ANTITHROMBINE III HUMAINE (CONCENTRÉ D ) Antithrombinum III humanum densatum

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1 NOTERELATIVEÀLAMONOGRAPHIE Cettemonographieaétécorrigéepourréintroduire et décrire in extenso la méthode de titrage de l héparine qui, jusqu au Supplément 8.3 de la Ph. Eur., figurait dans le chapitre En effet, le chapitre a fait l objet d une révision, publiée dans le Supplément 8.3, où l ancienne méthode qui reposait sur la mesure de l activité anticoagulante a été remplacée par des méthodes plus spécifiques de titrage anti-iia et anti-xa, qui visent à déterminer le rapport de l activité anti-facteur Xa à l activité anti-facteur IIa. Or, ce rapport est un bon moyen de titrer l héparine en tant que substance active, mais il est moins bien adapté à la détermination de la teneur en héparine dans les concentrés d antithrombine III. Les spécifications de la monographie sont donc considérées comme inchangées. La monographie ainsi corrigée sera à prendre en compte dès le 1 er janvier : ANTITHROMBINE III HUMAINE (CONCENTRÉ D ) DÉFINITION Antithrombinum III humanum densatum Préparation cryodesséchée stérile d une fraction glycoprotéique plasmatique qui inactive lathrombineenprésenced unexcèsd héparine.leconcentréd antithrombineiii humaine est obtenu à partir de plasma humain conforme à la monographie Plasma humain pour fractionnement (0853). La préparation peut contenir des excipients tels que des stabilisants. L activité de la préparation, reconstituée selon les indications figurant sur l étiquette, n est pas inférieure à 25 UI d antithrombine III par millilitre. PRODUCTION La méthode de préparation doit préserver l intégrité fonctionnelle de l antithrombine III. Elle comprend une ou plusieurs étapes dont la capacité à éliminer ou inactiver les agents infectieux connus a été démontrée. Si des substances sont utilisées à des fins d inactivationviraleencoursdeproduction,l étapedepurificationultérieuredoitfaire l objet d une validation permettant de démontrer que leur concentration est ramenée à un niveau convenable et que leurs résidus éventuels ne sont pas susceptibles de compromettrel innocuitédelapréparationpourlespatients. L activité spécifique n est pas inférieure à 3 UI d antithrombine III par milligramme de protéines totales, albumine exclue. L antithrombine III est purifiée et concentrée. Aucun conservateur antimicrobien ni antibiotique n est ajouté. Le concentré d antithrombine III est filtré sur une membrane antibactérienne, puis réparti aseptiquement dans les récipients finals et immédiatement congelé.ilestensuitecryodesséchéetlesrécipientssontferméssousvideousousgaz inerte. F1

2 Il doit être démontré, au moyen d une procédure analytique appropriée établie lors du développement, que le procédé de fabrication donne un produit contenant une proportion constante d antithrombine III capable de se lier à l héparine. La procédure utilisée peut par exemple être la procédure suivante. Proportion d antithrombine III capable de se lier à l héparine. Opérez par électrophorèse (2.2.31) sur gel d agarose. Préparez une solution d agarose pour électrophorèse R à10g/l contenant 15 UI d héparine R parmillilitredansdelasolution tampon barbital ph 8,4 R. Versez5mLdecettesolutionsuruneplaquedeverrede5 5cm.Refroidissezlegelà 4 Cpendant30min.Creusez2cupulesd undiamètrede2mmsituéesà1cmetà4cm du bord de la plaque et à 1 cm de la cathode. Déposez dans une des cupules 5 μl de la préparation à examiner après l avoir diluée de façon à obtenir une activité d environ 1 UI d antithrombine III par millilitre. Déposez dans l autre cupule 5 μl d une solution d un colorant tel que le bleu de bromophénol R. Procédez à l électrophorèse à 4 C en appliquantunchampélectriqueconstantde7v/cmjusqu àcequelecolorantatteigne l anode. Découpez le gel d agarose à 1,5 cm du bord de la plaque près duquel la préparation à examiner a été déposée, et enlevez la plus grande partie du gel en ne laissant qu une bande de 1,5 cm de largeur contenant la préparation à examiner. Remplacez la partie dugelquiaétéenlevéeparunecoucheuniformeforméepar3,5mld unesolution d agarose pour électrophorèse R à 10 g/l dans de la solution tampon barbital ph 8,4 R, contenant un sérum de lapin anti-antithrombine III humaine à une concentration appropriée, déterminée au préalable, afin d obtenir des hauteurs de pics adéquates, d au moins1,5cm.placezàlacathodeleborddelaplaquelelongduquelsetrouvelegel initial, de façon qu une 2 e migration puisse s effectuer perpendiculairement à la 1 re. Procédez à cette 2 e électrophorèse en appliquant un champ électrique constant de 2 V/cm pendant 16 h. Couvrez les plaques de papier filtre et de plusieurs couches d ouate imbibée d une solution de chlorure de sodium R à9g/letmaintenezsouspression pendant 2 h, en renouvelant la solution saline plusieurs fois. Rincez à l eau R, séchez les plaques et colorez par la solution de bleu acide 92 R. Calculez la proportion d antithrombine III liée à l héparine (représentée par le pic le plus proche de l anode) par rapport à la quantité totale d antithrombine III, en mesurant lasurfacedéfinieparles2picsdeprécipitation. La proportion d antithrombine III capable de se lier à l héparine n est pas inférieure à 60 pour cent. CARACTÈRES Aspect : poudre ou masse solide friable blanche ou sensiblement blanche, hygroscopique. Reconstituez la préparation à examiner selon les indications de l étiquette immédiatement avant d effectuer l identification, les essais (sauf ceux de solubilité, des protéines totales et de teneur en eau) et le dosage. IDENTIFICATION Le concentré d antithrombine III humaine satisfait aux limites du dosage. F2

3 ESSAI Solubilité. Au contenu d un récipient de la préparation à examiner, ajoutez le volume de liquide indiqué sur l étiquette, à la température recommandée. Agitez doucement. La préparation se dissout complètement dans les 10 min en donnant une solution limpide ou légèrement opalescente, incolore ou pratiquement incolore. ph (2.2.3) : 6,0 à 7,5. Osmolalité (2.2.35) : au minimum 240 mosmol/kg. Protéines totales. Diluezsinécessaireunvolumeexactementmesurédelapréparation reconstituée de façon à obtenir une solution contenant environ 15 mg de protéines dans 2 ml. Dans un tube à centrifuger à fond rond, introduisez 2,0 ml de cette solution, puis ajoutez2mld unesolutiondemolybdatedesodiumrà75g/let2mld unmélange de 1 volume d acide sulfurique exempt d azote R et de 30 volumes d eau R. Agitez, centrifugezpendant5min,éliminezlesurnageantetlaissezégoutterletuberenversé sur du papier filtre. Déterminez la teneur en azote du culot de centrifugation par la méthode de minéralisation par l acide sulfurique (2.5.9). Calculez la teneur en protéines en multipliant le résultat par 6,25. Héparine : au maximum 0,1 UI d héparine par Unité Internationale d antithrombine III. L activité anticoagulante de l héparine est évaluée in vitro par comparaison de sa capacité à retarder la coagulation du plasma de mouton, citraté et recalcifié, à celle d une préparation de référence, étalonnée en Unités Internationales, dans des conditions données. L UnitéInternationaled héparinecorrespondàl activitéd unequantitédonnéede l étalon international ; celui-ci est constitué par de l héparine sodique cryodesséchée provenantdemuqueuseintestinaledeporc. Lacorrespondanceentrel Unité Internationale et l étalon international est indiquée par l Organisation mondiale de la Santé. L héparine sodique PBR est étalonnée en Unités Internationales à partir de l étalon international, à l aide du titrage décrit ci-après. Effectuez le titrage à l aide d un des procédés suivants permettant de déterminer le début de la coagulation et de choisir les tubes et autres appareils appropriés à la méthode utilisée : a) examen visuel direct, effectué de préférence à l aide d un éclairage indirect sur fond noir et mat ; b) enregistrement spectrophotométrique du changement de densité optique à une longueur d onde de 600 nm environ ; c) examen visuel du changement de fluidité en inclinant les tubes manuellement ; d) enregistrement mécanique du changement de fluidité en procédant au mélange tout enayantsoind éviteraumaximumtouteperturbationauseindelasolutionpendant laphaseinitialedecoagulation. Ilestnécessairedevaliderletitragedel héparinepourchaquepréparationafindetenir compte de l interférence de l antithrombine III. MODE OPÉRATOIRE F3

4 Les volumes sont donnés à titre indicatif et peuvent être adaptés à l appareillage utilisé, à condition toutefois que les rapports entre les différents volumes soient respectés. Diluez l héparine sodique PBR dans une solution de chlorure de sodium R à9g/lde façon à obtenir par millilitre un nombre connu avec précision d Unités Internationales. Préparez dans les mêmes conditions une solution de la préparation à examiner de même activité présumée. A partir de chacune de ces solutions, préparez une série de dilutionsdansunesolutiondechlorure de sodium R à 9 g/l en progression géométrique, defaçonqueletempsdecoagulationobtenuaveclaconcentrationlaplusfaiblenesoit pas inférieur à 1,5 fois le temps de recalcification à blanc et que le temps de coagulation obtenu avec la plus forte concentration soit tel qu il donne une courbe log dose/réponse satisfaisante, telle que déterminée dans un essai préliminaire. Placez 12 tubes dans un bain d eau glacée en les étiquetant en double T 1 et T 3 pour les dilutions de la préparation à examiner et S 1 et S 3 pour les dilutions de la préparation de référence. Dans chaque tube, introduisez 1,0 ml de substrat de plasma R1 décongelé, 1,0 ml de la dilution appropriée de la préparation à examiner ou de la préparation de référence. Après chaque addition, mélangez en évitant la formation de bulles. En prenant les tubes dans l ordre suivant S 1,S 3,T 1,T 3,transférezchacund eux dans un bain-marie à 37 C. Laissez s équilibrer la température du milieu à 37 C pendant 15 min environ, puis ajoutez dans chacun des tubes 1 ml d un réactif APTT (1) (temps de thromboplastine partielle activée) approprié contenant des phospholipides et un activateur de contact, à une dilution telle qu un temps de recalcification à blanc convenable ne dépassant pas 60 s est obtenu. Après exactement 2 min, ajoutez 1mLd unesolutiondechlorure de calcium R à3,7g/lchaufféeaupréalableà37 C. Enregistrez, comme temps de coagulation, l intervalle exprimé en secondes entre cette dernièreadditionetledébutdelacoagulationdéterminéselonleprocédéchoisi. Déterminez le temps de calcification à blanc au début et à la fin de l opération dans les mêmes conditions en utilisant 1 ml d une solution de chlorure de sodium R à9g/l au lieu d une des dilutions d héparine ; les 2 valeurs à blanc obtenues ne doivent pas différer de façon significative. Transformez les temps de coagulation en logarithmes, en utilisant la valeur moyenne des tubes traités en double. Répétez le procédé en utilisant de nouvelles dilutions et effectuez l incubation dans l ordre T 1,T 3,S 1,S 3.Calculez les résultats par les méthodes statistiques habituelles (5.3). Effectuez au moins 3 titrages indépendants. Pour chacun d eux, préparez respectivement de nouvelles solutions de la préparation à examiner et de la préparation de référence et utilisez un nouveau prélèvement de substrat de plasma décongelé immédiatement avant l emploi. Calculez l activité de la préparation à examiner par les méthodes statistiques habituelles (5.3) en combinant les résultats des différents titrages. Lorsque la variance issue des différences entre les titrages est significative au niveau P = 0,01, une estimation combinée de l activité peut être obtenue en calculant la moyenne non pondérée des estimations de l activité. (1) Les kits CK Prest conviennent. F4

5 Eau. Déterminéeparuneméthodeappropriéetellequelesemi-microdosagedel eau (2.5.12), la perte à la dessiccation (2.2.32) ou la spectroscopie dans le proche infrarouge (2.2.40), la teneur en eau est comprise dans les limites approuvées par l Autorité compétente. Stérilité (2.6.1). La préparation à examiner satisfait à l essai. Pyrogènes (2.6.8) ou Endotoxines bactériennes (2.6.14). La préparation à examiner satisfait à l essai des pyrogènes ou, de préférence et sous réserve de justification et d autorisation, à un essai in vitro validé, tel que l essai des endotoxines bactériennes. Pour l essai des pyrogènes, injectez à chaque lapin, par kilogramme de masse corporelle, unvolumedepréparationcorrespondantà50uid antithrombineiii. Si l essai utilisé est celui des endotoxines bactériennes, la préparation à examiner contient moins de 0,1 UI d endotoxines par Unité Internationale d antithrombine III. DOSAGE Antithrombine III humaine (2.7.17). L activité estimée n est pas inférieure à 80 pour cent ni supérieure à 120 pour cent de l activité déclarée. Les limites de confiance (P = 0,95) ne sont pas inférieures à 90 pour cent ni supérieures à 110 pour cent de l activité estimée. CONSERVATION A l abri de la lumière, en récipient étanche. ÉTIQUETAGE L étiquette indique : le nombre d Unités Internationales d antithrombine III par récipient, le nom et le volume du liquide à utiliser pour reconstituer la préparation, dans les cas appropriés, la quantité d albumine ajoutée comme stabilisant. F5

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