La chromatographie aspects généraux
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- Joel Benoît
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1 La chromatographie aspects généraux Méthode de séparation et de quantification de composés présents dans une phase homogène liquide ou gazeuse. Le principe est basé sur les équilibres successifs des composés présents entre 2 phases dont l une est dite stationnaire, emprisonnée dans la colonne et l autre, dite mobile qui se déplace en entraînant les substances. L entraînement différentiel des composés présents dans la colonne conduit à leur séparation. Intérêt: couplage avec des détecteurs très sensibles. le chromatogramme permet d obtenir des informations qualitatives (temps de rétention d un composé) et quantitative (surface ou hauteur du pic chromatographique). domaine de mesure: Ordre du nanogramme.
2 Processus analytique L analyse de composés dans des matrices complexes (sang, urine, ) nécessite souvent une optimisation de la séparation chromatographique. ANALYSE Préparation d échantillon Séparation Détection Résultats? Sélectivité Types de matrices Nombre d échantillons à traiter Appareillage à disposition Type de détection (UV, Fluo, NPD, MS) Possibilité d automatisation
3 La chromatographie: historique La chromatographie La chromatographie(du grec chroma: couleur et graphein: écrire) a été inventée par le botaniste Mikhail Tswett au début du XX ème siècle. Une colonne de CaCO 3 permet de séparer des pigments végétaux (chlorophylles et xanthophylles). Par adjonction de solvant, on obtient des bandes colorées qui se déplacent le long de la colonne à des vitesses propres. Le Prix Nobel de chimie est attribué en 1952 aux biochimistes Martin et Synge pour leur contribution au développement de la chromatographie moderne.
4 Principe de base Le principe qui régit pratiquement toute purification / séparation en chimie, se base sur la (ré)partition d une substance A (analyte) entre deux phases Cristallisation: : partition phase liquide phase cristalline Distillation: : partition phase liquide phase gazeuse Sublimation: : partition phase solide phase gazeuse Extraction: : partition entre deux phases liquides non miscibles (LLE) ou phase liquide phase solide (SPE) Chromatographie: : partition phase stationnaire phase mobile.
5 Principe de séparation Si le composé B a une grande affinité pour la phase stationnaire et le composé A une grande affinité pour la phase mobile, le composé A aura tendance à être élué plus rapidement. Son temps de rétention sera plus petit que le temps de rétention de B. Cette différence d affinité pour les deux phases est le principe même de la chromatographie! Il existe diverses méthodes de chromatographie utilisées quotidiennement par les chimistes, biologistes, etc. GC HPLC CCM EC Etc
6 Définitions La chromatographie est une technique dans laquelle les constituants d un mélange se séparent en fonction des vitesses auxquelles ils sont entraînés à travers une phase stationnaire par une phase mobile. La phase stationnaire est une phase qui reste en place, soit dans une colonne, soit sur une surface plane. La phase mobile est une phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, entraînant l analyte avec elle. L élution est un processus au cours duquel les analytes sont entraînés à travers une phase stationnaire par le mouvement d une phase mobile. Un chromatogramme est le graphique d une fonction de la concentration de l analyte en fonction du temps d élution (ou temps de rétention).
7 Propriétés physico-chimiques chimiques Chromatographie: : partition phase stationnaire phase mobile En fonction des propriétés PHYSICO-CHIMIQUES CHIMIQUES des molécules et surtout, en GC - Volatilité / Polarité - Solubilité - Hydrophobe / Hydrophile - Acide / Base
8 Chromatographie en phase gazeuse La chromatographie en phase gazeuse (GC) est basée sur le partage de l analyte entre une phase gazeuse mobile et une phase liquide immobilisée sur la surface d un support inerte. La phase (liquide) immobilisée est le plus souvent un polymère organique modifié (siloxane( R 3 SiO[SiR 2 O] n SiR 3 ). Le gaz porteur est un gaz inerte, typiquement l hélium (He( He). La détection à la sortie de la colonne peut être de plusieurs types (FID, NPD, ECD, MSD, etc ).
9 Aspects théoriques Chaque analyte a une affinité plus ou moins prononcée pour la phase mobile et la phase stationnaire (propriétés physico-chimiques). Le coefficient de distribution d un analyte A est défini comme la constante d équilibre (K A ou D A ) entre la phase mobile et la phase stationnaire (partage du soluté entre les 2 phases). A Mobile A Stationnaire K A = C S / C M Le facteur de sélectivité (α) d une colonne pour deux espèces A et B est défini comme le rapport des coefficients de distribution K A et K B : α = K A / K B ( 1) Le facteur de capacité (k ) permet de comparer, pour un soluté donné, différentes colonnes chromatographiques: k = m S / m M (m: masse du soluté dans chaque phase). De faibles valeurs de k indiquent que le composé est peu retenu. Habituellement, on travaille avec des k compris entre 1 et 10.
10 Aspects théoriques Nombre de plateaux théoriques (N) Ce paramètre permet de définir l efficacité d une colonne. Plus ce nombre est grand (valeurs de l ordre de ), plus la colonne est efficace. Afin de pouvoir comparer les colonnes entre elles, on définit la hauteur équivalente de plateaux théoriques (H ou HEPT) HEPT = H = L / N L = longueur de la colonne
11 Aspects théoriques La résolution (Rs) Ce paramètre représente la séparation entre 2 pics. Elle dépend de 3 facteurs: - sélectivité α - facteur de capacité k (doit être compris entre 1 et 10) - efficacité de la colonne N t r : le temps de rétention du composé w: largeur du pic à mi-hauteur R s = 2 [(t r2 t r1 ) / (w 1 + w 2 )] Plus R s est grand, meilleure est la séparation. A partir de R s = 1.5 la séparation entre 2 composés est complète.
12 Résolution
13 Helium GC: Appareillage
14 GC: l injecteur L'injecteur est logé dans un bloc métallique dont la température est régulée afin d'assurer une bonne homogénéité thermique du système. L'échantillon va être introduit, à travers une pastille auto- obturante appelée septum,, par l'intermédiaire d'une microseringue. L'échantillon sera vaporisé et les solutés traverseront l'injecteur à travers un tube en verre (parfois métallique) appelé liner (ou insert), grâce au gaz porteur, jusqu'à la tête de la colonne.
15 L injecteur liner Split Split: : injection d une partie de l échantillon dans la colonne (1:10, par exemple). Splitless Splitless: : injection de la totalité de l échantillon dans la colonne (1 à 10 μl).
16 Split
17 Splitless
18 Colonne
19 Colonne capillaire Injecteur Support pour la colonne capillaire Détecteur Silice greffée recouverte d une couche de polyimide Four GC
20 Nombreuses colonnes capillaires commercialisés: - nature de la phase greffée (polarité) - longueur de la colonne (10m à 60m) - diamètre de la colonne capillaire (0.18mm à 0.53 mm) - diamètre de la couche greffée (0.10μm m à 1.50 μm) La silice greffée (phase stationnaire) Choix de la colonne (greffage) en fonction des substances que l on veut analyser. Attention! - stabilité du greffage (durée de vie des colonnes, peut dépendre du fabricant) etc
21 La séparation des molécules INJECTEUR AUGMENTATION DE LA TEMPERATURE 300 C 50 C XXOS SSOOXO OXSSXSOO SOXXXOX O XX S OOO X SS OOO XX SSS OO XXXX S O XX S OOO X SS OOO XX SSS OO XXXX S Abondance T1 T2 T3 DETECTEUR Temps (min)
22 Le chromatogramme Abondance Caractéristique de la quantité de substance initiallement présente dans le volume qui a été injecté Temps de rétention (min) Temps que met la substance depuis son introduction dans la colonne (injection) jusqu au moment où elle arrive au détecteur
23 Pics chromatographiques
24 Pics chromatographiques
25 La migration dans la colonne O XX S OOO X SS OOO XX SSS OO XXXX S DETECTEUR La vitesse de migration des substances dans la colonne capillaire dépend de leur volatilité et leur polarité (interaction avec la phase stationnaire). de là, dépend l ordre d arrivée au détecteur!
26 Volatilité et polarité O CH 2 CHCH 3 CH 3 N C OCH 3 O C NH 2 O Amphétamine C 9 H 13 N MW = 135 B.p. = 203 C Molécule peu polaire Cocaine C 17 H 21 NO 4 MW = 303 B.p. = 98 C Molécule polaire Analyse directe par GC-MS! Il est nécessaire de dériver la molécule pour l analyse par GC-MS!
27 La détection Détecteur les plus couramment utilisés: - FID: Flame Ionization Detector - TCD: Thermal Conductivity Detector - ECD: Electron Capture Detector - NPD: Nitrogen Phosphorous Detector (détecteur spécifique) - MSD: Mass Spectrometer Detector (détecteur universel) NPD ECD FID FPD PID TCD MSD STABILITE du détecteur: Reproductibilité des injections!
28 La linéarité LINEARITE du détecteur: Zone de concentration dans laquelle le signal de détection est directement d proportionnel à la concentration en analyte (quantité injectée). Signal / Abondance / Aire du pic Saturation Domaine de linéarité LOD LOQ LOD: limite de détection LOQ: limite de quantification Quantité injectée (μl)( Concentration (μg/ml,( ng/ml)
29 Sensibilité NPD Cuscohygrine Tropacocaïne Norcocaïne FID
30 Sélectivité / Spécificité NPD MS
31 Quantité de substance détectée OOO X OOOOOOO XX OOOOOO XXX OOOO X DETECTEUR 2 1 Abondance L aire sous le pic chromatographique est caractéristique de la concentration de la substance dans l échantillon analysé 1 2 Temps rétention La surface ou la hauteur du pic chromatographique est proportionnelle à la masse ou à la concentration injectée. Il est ainsi possible, au moyen d une courbe d étalonnage, de déterminer avec précision la quantité chromatographiée.. En GC, l injection n étant pas très reproductible, il est nécessaire d utiliser un standard interne (SI). Le choix du SI est très important car il doit se comporter comme le ou les produits p à analyser et ne doit pas interférer sur le chromatogramme.
32 Liner L'intérêt du liner est de retenir les constituants non volatils de l'échantillon, impropres par nature à la chromatographie.
33 Liner
34 Standard interne - Composé organique ajouté à un mélange inconnu, à une concentration connue. - Utiliser pour déterminer la concentration d un ou de plusieurs composés c dans un mélange inconnu. - Le volume d échantillon injecté n a pas d importance, contrairement ent à la méthode de la courbe d étalonnage. - Trois conditions doivent être respectées pour pouvoir l utiliser : 1) ) Le composé choisi doit être idéalement de structure chimique similaire aux composés étudiés. 2) ) Le composé choisi comme standard interne doit être absent du mélange inconnu, car s il y est, sa concentration deviendra inconnue. 3) ) Le pic du standard interne doit être bien séparé des autres pics du mélange inconnu, sinon le calcul de sa surface sera inexact.
35 Références La plupart des schémas et figures contenues dans cette présentation sont tirées des ouvrages suivants: - F. Rouessac et A. Rouessac: Analyse Chimique, Méthodes et Techniques Instrumentales Modernes,, Masson, 2ème édition, 303 p., G. Schwedt: Atlas de Poche des Méthodes d Analyse,, Flammarion, édition française, 234 p., M.S. Klee: GC Inlets An Introduction,, Hewlett-Packard, 132 p., 1990.
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