TP 2 : Les enzymes digestives.

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1 TP 2 : Les enzymes digestives. Animation : Enzymes Ils existent des milliers d enzymes qui interviennent simultanément dans des réactions chimiques. Problèmes : Comment les enzymes agissent-elles sur leur substrat? Comment font-elles pour «s y retrouver»? Hypothèse : il existe une spécificité enzyme-substrat. Elles reconnaissent leur substrat et s y lient. Activité : Expérimenter le mode d action des enzymes. (Noté) La pepsine est une enzyme digestive active dans l estomac où le ph est acide. Elle catalyse l hydrolyse de liaisons chimiques, en particulier celle des liaisons peptidiques entre acides aminés des protéines. Ainsi, une solution trouble d ovalbumine (protéine du blanc d œuf) devient limpide après ajout de pepsine, ce qui traduit l hydrolyse de l ovalbumine. Problème à résoudre : On cherche à tester si la pepsine est également capable de catalyser l hydrolyse de liaisons glucidiques Matériel : Verrerie (pipettes, tubes à essais, béchers) ; bain marie à 37 C, eau iodée, eau distillée, solution de pepsine (5g/ 00mL), solution d HCl ( mol/l), solution d amidon (%), solution d ovalbumine, marqueur.

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3 A. Une mutation de l amylase. Thème 3 CORRECTION : TP 2 : Les enzymes digestives. Activité : Expérimenter le mode d action des enzymes. Nom/prénom : Réponses attendues. Protocole et justification : Pour tester si la pepsine peut catalyser l hydrolyse des liaison glucidiques, il faut la mettre en présence d un glucide complexe (l amidon) dans les conditions de son action ( 37 C, ph acide) Barème 2 Si l amidon est hydrolysé, on veut être sûrs que c est bien grâce à la pepsine, donc il faut un tube témoin avec amidon, sans pepsine. Il faut aussi vérifier que la pepsine est efficace sur son substrat, il faut donc un tube avec de l ovalbumine et de la pepsine dans les conditions de son action ( 37 C, ph acide) et un tube témoin sans pepsine pour vérifier l action de cette dernière. On prépare donc 4 tubes : T (témoin) : Ovalbumine + HCl ; T2 : Pepsine + ovalbumine + HCl ; T3 (témoin) : Amidon + HCl ; T4 : Pepsine + amidon + HCl 2 On les place au bain marie à 37 C pendant 30 min puis on réalise les tests à l eau iodée pur vérifier la présence d amidon sur T2 et T3 et on observe l aspect des tubes T et T2 (laiteux ou limpide) 2 2. Résultats attendus : - Si la pepsine ne peut catalyser l hydrolyse des liaisons glucidiques les tests à l eau iodée seront positifs pour T3 et T4 - Si la pepsine peut catalyser l hydrolyse des liaisons glucidiques les tests à l eau iodée sera positif pour T4 et négatif pour T3 (témoin) 3. Manipulations : soin, organisation, précision 2 Tableau de résultats des tests : Contenu des tubes Résultats T (témoin) : Ovalbumine + HCl T2 : Pepsine + ovalbumine + HCl Aspect des tubes Laiteux Plus limpide Test à l eau iodée T3 (témoin) : Amidon + HCl Positif T4 : Pepsine + amidon + HCl positif 4. Exploitation des résultats Dans le Tube sans pepsine, l ovalbumine n a pas été hydrolysée contrairement au tube 2 où la pepsine était présente. Dans les tube 3 et 4, avec ou sans pepsine, l amidon n a pas été hydrolysé. Donc la pepsine n est pas capable de catalyser hydrolyse des liaisons glucidiques. Elle ne peut catalyser que celle des liaisons peptidiques. La pepsine est spécifique d un substrat (protéine) et d une réaction (hydrolyse) 3 (titre/ ; construction/ ; résultats / 6. Gérer et ranger TOTAL 20

4 Activité 2 : Visualiser le mode d action des enzymes La structure de certaines enzymes est connue. Par la technique de la cristallographie aux rayons X, les scientifiques ont élaboré des modèles moléculaires de l enzyme seule ou de l enzyme avec son substrat. Problème à résoudre : On cherche à comprendre les modalités de l action de l enzyme sur le substrat en étudiant un modèle présentant l amylase et un petit fragment d amidon. Matériel : Logiciel Rastop avec fiche technique. Molécule : «Amylase_amidon» : Amylase en complexe avec son substrat, l amidon. Ouvrir le fichier «amylase_amidon» avec le logiciel RasTop (situé dans le dossier commun-svt-spécialité-tp2 enzyme) Colorer par chaîne puis afficher en Ruban pour observer la structure de la protéine (l amylase apparaît en bleu, l amidon en rouge). Afficher le fichier de la molécule pour visualiser sa composition.. Décrire brièvement la structure et la composition de l amylase. L amylase a une forme ovale. C est une protéine constituée d une chaine d acides aminés. Choisir la représentation en bâtonnets. Dans le cadre Propriétés, choisir Protéiques et sélectionner (bouton avec un carré blanc sur un carré bleu). Sélectionner ensuite la représentation en sphères (seule la protéine est affectée). En utilisant l éditeur de commandes, sélectionner les acides aminés n 97, 300, 233 ; sélectionner ce choix dans la fenêtre «sélection des atomes» puis les afficher en sphère de couleur distincte. Appeler le professeur. Réaliser une capture écran puis réaliser un document légendé et titré du complexe enzyme-substrat dans un traitement de texte ou d image de votre choix. Mettre en page de façon à obtenir 2 représentations du complexe sur une même page. Imprimer. Appeler le professeur. 2. Indiquer la position de l amidon et expliquer le fonctionnement de l amylase en prenant en compte l ensemble de votre travail. Image du complexeamylase Amidon avec Rastop

5 L amidon est entouré par l amylase, elle est située au niveau de certains acides aminés. Grâce à cette fixation, l amylase peut agir sur l amidon : elle catalyse l hydrolyse des liaisons glucidiques. Activité 3 : Etudier une mutation de l amylase. Des chercheurs ont réalisé des mutations contrôlées du gène contrôlant la synthèse de l amylase. Ils ont obtenu une Amylase pancréatique humaine mutée où l'acide aspartique en position 97 est remplacé par une alanine Ils ont ensuite mesuré l activité de cette enzyme. Ces essais expérimentaux ont montré une diminution par un facteur de l'activité enzymatique par cette mutation, ce qui correspond à une disparition quasi totale de la catalyse. Expliquer l inefficacité de l enzyme mutée. L acide aminé muté fait partie des 3 acides aminés du site catalytique de l'enzyme, responsables de la réaction d'hydrolyse des liaisons glucidiques entre unités de glucose de l'amidon. (Les autres acides aminés sont Glu233 et Asp300). La mutation de cette acide aminé doit modifier la structure spatiale (forme) du site de liaison de l enzyme avec son substrat (= site actif). Ainsi, l enzyme se lie difficilement au substrat et ne peut donc agir efficacement sur celui-ci. Ceci explique l inefficacité de l enzyme. Exercice : l influence des facteurs du milieu. A partir de l étude des docs et 2 p 54 et du doc 4 p 55, expliquer l influence de la température et du ph sur l activité de l amylase. Observation : Doc : Le test à la Liqueur de Fehling est positif uniquement pour le tube où la température est de 37 C (= température du corps). Déduction : L amylase ne peut catalyser l hydrolyse de l amidon qu à une certaine température. Observation : Doc 2 : A Ph 6 et 7 correspondant au ph de la cavité buccale, les tests à l eau iodée sont négatifs. Déduction Plus le ph est acide plus les tests sont positifs. L amylase ne peut hydrolysée l amidon que dans des valeurs de ph comprise entre 6 et 7. Explication : Doc 4 : Un ph acide et une température trop basse ou trop élevée modifient la structure de l amylase qui ne peut être efficace.

6 Conclusion : Au-delà de certaines conditions de température et de ph, l activité de l amylase diminue = L amylase a une activité efficace que dans certaines conditions de température (37 C) et de ph (6 à 7) Conclusion : Résumer les caractéristiques des enzymes (nature, structure, conditions d action). Voir Docs 4 et 5 p 55 Enzyme = protéine = chaîne(s) d acides aminées dont la succession définit la structure spatiale.(cf act 2) Chaque enzyme est spécifique d un substrat et ne catalyse qu un type de réaction (cf act ) De plus chaque enzyme possède des conditions de température et de ph optimale = dans lesquelles sont efficacité est maximale. En effet, le ph et la température influencent l activité de l enzyme en agissant sur sa structure spatiale. Une mutation d une enzyme peut aussi modifier la structure de son site actif et donc son efficacité d action.