15/07/14 ESSAI DES PYROGENES. SUBSTANCES PYROGÈNES Déclenchent une élévation thermique de l organisme après injection Nature : Chimique
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- Micheline Girard
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1 UE PREPARATION, CONTRÔLE, ASSURANCE QUALITE Module 2 Contrôle qualité Méthode de contrôle d une prépara2on injectable : recherche des substances pyrogènes et des endotoxines Emmanuelle BARRON Université de Bordeaux Collège Santé UFR Sciences Pharmaceutiques Laboratoire Hydrologie Environnement emmanuelle.barron@u-bordeaux.fr Pyrogènes Définition, nature, effets biologiques Recherche des pyrogènes : Essai des pyrogènes Essai d activation des monocytes Endotoxines Définition, structure, élimination, effets biologiques Recherche des endotoxines : Essai des endotoxines bactériennes 2 SUBSTANCES PYROGÈNES Déclenchent une élévation thermique de l organisme après injection Nature : Chimique formol, polynucléotides, stéroïdes, bleu de méthylène Particulaire bris de bouchons, de filtre.. Bactériennes LPS des bactéries gram-négatives, peptidoglycane Symptomatologie élévation de la température centrale de l'organisme frissons et céphalées dyspnées choc avec hypotension mort par insuffisance circulatoire aiguë 4 RECHERCHE DES PYROGÈNES (1) ESSAI DES PYROGENES : Pharmacopée Européenne 8ème Édition : Chapitre ESSAI DES PYROGENES Sélection des animaux Stabulation Essai Appareillage: Verrerie, seringues, aiguilles Dispositif de fixation Thermomètres 5 6 1
2 Essai préliminaire: 1 jours avant l essai : injection IV d une solution apyrogène variation de T < 0,6 C par lapin Essai définitif 1 groupe = lapins = 1 essai Détermination : températures initiales et maximales Interprétation des résultats de lapins Le produit satisfait l essai si la somme des réponses n est pas supérieure : Le produit ne satisfait pas l essai si la somme des réponses est supérieure : 1,15 C 2,65 C 6 2,80 C 4,0 C 9 4,45 C 5,95 C 12 6,60 C 6,60 C 7 8 RECHERCHE DES PYROGÈNES (2) ESSAI D ACTIVATION DES MONOCYTES : Pharmacopée Européenne 8ème Édition : Chapitre Peut après validation spécifique pour le produit considéré se substituer l essai des pyrogènes sur le lapin Principe : Incubation de la solution avec une source de monocytes humains ou de cellules monocytaires humaines Sang périphérique humain héparinisé Fraction de sang contenant des monocytes Lignée de cellules monocytaires humaines Comparaison de la réponse avec celles obtenues avec un étalon d endotoxine ou avec un lot de référence de la préparation 9 méthodes : Méthode A : essai quantitatif Méthode B : essai semi-quantitatif Méthode C : essai de comparaison un lot de référence 10 Contrôles préliminaires Vérification de la validité de la courbe d étalonnage Recherche de facteurs d interférence due la solution Vérifier que l essai permet la détection des endotoxines et des contaminants non endotoxiniques Pas d interférence de la solution dans le système de détection du marqueur choisi ENDOTOXINES Partie de la membrane des bactéries gram-négatives Toxine lipopolysaccharidiques (LPS) de haut PM 12 2
3 LPS Unité structurale des endotoxines, non homogène Enchâssé dans le feuillet terne de la membrane terne des bactéries Constitué de régions de l térieur vers l intérieur Région 1 «chaîne latérale O» : chaîne polyosidique variable selon le type de bactérie Elle est responsable de la spécificité antigénique O des bactéries Gram négatif Formée d un enchainement variable en nombre et en ordre des principaux types d oses : mannose, galactose, glucose, glucosamine 1 14 Région 2 «core» : chaîne polyosidique, variations faibles Il contient des sucres comme le N acétyl glucosamine, le glucose, le galactose, un heptose un désoxyose : le 2 céto désoxyoctonate ou acide désoxy D manno 2 octulosonique (KDO) qui permet de relier la chaîne polysaccharidique au lipide A 15 Région «lipide A : formé de polyglucosamines phosphorylés et portant divers acides gras ( : acide β hydroxymyristique) Responsable de toutes les activités biologiques des endotoxines
4 LPS MANIFESTATIONS BIOLOGIQUES PROVOQUÉES PAR DES ENDOTOXINES Activation du facteur XII Activation du complément Monocytes, macrophages, cellules endothéliales Production de fibrine et bradykinine Inflammation Production de cytokines : IL1, IL6, IL8 et TNF α Activation de la coagulation sanguine et augmentation de la vasoperméabilité Recrutement des neutrophiles Production de dérivés oxygénés, PAF Faible production Effets bénéfiques Stimulation du système immunitaire Augmentation de la résistance non spécifique l infection Effets néfastes Processus inflammatoire chronique amyloïdose Forte production Effets néfastes Fièvre élevée Hypotension Coagulation intravasculaire disséminée Inflammation Altérations tissulaires Choc létal Endotoxines dans l air Ex de produits dont la monographie demande la recherche d endotoxines Peuvent être présentes dans les bioaérosols troubles de fonction pulmonaire, acerbation des réactions inflammatoires de l asthme, bronchite chronique TYPE D ECHANTILLON pour dilution des solutions concentrées pour hémodialyse ppi VALEURS LIMITES ADMISSIBLES 0,25 UI/mL 0,25 UI/mL Amphotéricine B 1 UI/mg 22 Limite en endotoxines = K M K : dose seuil d endotoxines ayant un effet pyrogène, par kg de mc M : dose maximale recommandée pour le produit, par kg de mc Voie d administration K (UI d endotoxines par kg de mc) IV 5,0 IV, produits radiopharmaceutiques 2,5 Intrarachidienne 0,2 Inactivation/élimination des endotoxines Inactivation : acide fort ou base forte anhydrides acétiques, succiniques ou phtaliques température supérieure 250 C pendant 0 mn peroxyde d hydrogène Élimination En fonction de la taille 4
5 MISE EN ÉVIDENCE DU LPS Pyrogénicité dans le test pyrogène du lapin Activation des monocytes in vitro Coagulation du lysat d amoebocytes du limulus ESSAI DES ENDOTOXINES BACTÉRIENNES Pharmacopée Européenne 8ème Édition : Chapitre Essai destiné la détection ou la quantification des endotoxines produites par des bactéries gram-négatives au moyen d amoebocytes de limule (Limulus polyphemus ou Tachypleus tridentatus) 25 Test LAL (Limulus amoebocyte lysate) : «crabes» morts d une coagulation intra-vasculaire due une infection par bactéries Gram négatif endotoxines + solution de lysat d amoebocytes gélification Gelification = cascade enzymatique comple nécessitant 4 substances : Enzyme pro-coagulante Cations bivalents de Ca Coagulogène (chaine polypeptidique de 220 aa) Endotoxines lysat Cascade enzymatique : LPS Facteur C Facteur C activé Facteur B Facteur B activé Procoagulase Coagulase Coagulogène Ca 2+, Mg 2+, ph 7 FACTEURS D INTERFÉRENCES ph Température Agent complant du Ca 2+ (EDTA) Produit : thyroxine, albumine, héparine, Zn 2+, hormones, (1,)-ß-D glucanes Consommables, verrerie : adsorption des endotoxines sur les parois, relargage de composés inhibiteurs Coaguline (d après Morita, 1985) GELIFICATION
6 techniques : Gélification Turbidimétrie Colorimétrie 1 6 méthodes: Méthode A : Gélification : essai limite Méthode B : Gélification : essai quantitatif Méthode C : Turbidimétrie cinétique Méthode D : Colorimétrie cinétique Méthode E : Colorimétrie en point final Méthode F : Turbidimétrie en point final 4 APPAREILLAGE Matériel Consommable Doit être apyrogène RÉACTIFS ET SOLUTIONS : (1) LYSAT D AMOEBOCYTES Fourni par le limule ou «crabe en fer c h e v a l» ( a r t h r o p o d e c l a s s e d e s mérostomates, genre limulus, espèce polyphémus) x littorales atlantiques américaines 5 Possède une hémolymphe, colorée en bleu par une hémocyanine (pigment cuivrique), ne contient qu une sorte de cellule, l amoebocyte qui possède la fois les fonctions de défense, d hémostase et de coagulation 6 6
7 RÉACTIFS ET SOLUTIONS : (2) SOLUTION DE LYSAT Prélèvement de l hémolymphe sur anticoagulant Écoulement spontané Marquage de l animal Séparation des ameobocytes Lavage puis lyse Élimination des débris cellulaires Stockage du surnageant 4 C pendant 18 mois et plusieurs années après congélation -25 C Répartition du lysat en flacons, lyophilisation et détermination de la sensibilité de chaque lot Dissolution dans de l eau ou tampon comme recommandé par le fabricant, sous agitation modérée, conservation au réfrigérateur ou congélateur 7 8 RÉACTIFS ET SOLUTIONS : () EAU RÉACTIFS ET SOLUTIONS : (4) SOLUTION MÈRE ÉTALON D ENDOTOXINE pour essai des endotoxines bactériennes = eau ppi ou de l eau produite par un autre procédé 9 Préparée partir d une solution de référence d endotoxine étalonnée par rapport l étalon international, par emple l étalon d endotoxine PBR Endotoxin Control Standard (CSE 10ng, lyophilisé (souche E. coli 055 : B5) La teneur en endotoxines est primée en Unités Internationales (UI) 1 UI d endotoxine équivaut une Unité d Endotoxine (UE) 40 RÉACTIFS ET SOLUTIONS : (5) SOLUTIONS ÉTALONS D ENDOTOXINE RÉACTIFS ET SOLUTIONS : (6) SOLUTIONS À EXAMINER Après agitation énergique de la solution mère étalon d endotoxine, préparez les séries de dilutions appropriées de cette solution avec de l eau pour essai des endotoxines bactériennes (eau ) Utilisez ces solutions dès que possible En dissolvant ou diluant la substance active ou le produit médicinal avec de l eau Détermination de la Dilution Maximale Significative (DMS)
8 EX Limite en endotoxines X [solution ] DMS = λ Limite en endotoxines = K M [solution ] : mg/ml, ml/ml K : dose seuil d endotoxines ayant un effet pyrogène, par kg de mc M : dose maximale recommandée pour le produit, par kg de mc λ : pour la technique de gélification, sensibilité déclarée du lysat (UI/mL); pour les techniques turbidimétrique et colorimétrique, point le plus bas utilisé sur la courbe d étalonnage de phénytoïne sodique 50 mg/ ml injecter par voie IV. K = 5 UI/kg de mc M = dose humaine max = 15 mg/kg de mc C = 50 mg/ml λ= 0,4 UI/mL DMS = 5x50/15 x 1/0,4 = 41, Méthode de gélification A et B A : essai limite B : essai semi quantitatif TECHNIQUE DE GÉLIFICATION (A ET B) Contrôles préliminaires (1) Confirmation de la sensibilité déclarée du lysat (UI/mL) 2λ 4 λ 4 0,5 λ 4 0,25 λ 4 46 TECHNIQUE DE GÉLIFICATION (A ET B) TECHNIQUE DE GÉLIFICATION (A ET B) Contrôles préliminaires (1) Confirmation de la sensibilité déclarée du lysat (UI/mL) λ λ ,5 λ ,25 λ Contrôles préliminaires (1) Confirmation de la sensibilité déclarée du lysat (UI/mL) λ λ ,5 λ ,25 λ
9 TECHNIQUE DE GÉLIFICATION (A ET B) Contrôles préliminaires (1) Confirmation de la sensibilité déclarée du lysat (UI/mL) λ λ ,5 λ ,25 λ (2) Recherche des facteurs d interférence A B + 2 λ 4 λ 4 0,5 λ 4 0,25 λ 4 λ 2 0,5 λ 2 0,25 λ 2 D ,5λ sensibilité mesurée 2 λ (2) Recherche des facteurs d interférence A B + 2 λ 4 λ 4 0,5 λ 4 0,25 λ 4 λ 2 0,5 λ 2 0,25 λ 2 D Sensibilité : même que celle déclarée (2) Recherche des facteurs d interférence : RÉSULTATS A B + 2 λ 4 λ 4 0,5 λ 4 0,25 λ 4 λ 2 0,5 λ 2 0,25 λ 2 D Résultat : sensibilité du lysat avec le produit entre 0,5 λ et 2 λ pas d interférences Sensibilité : même que celle déclarée ESSAI LIMITE (A) ESSAI LIMITE (A) A B + 2 λ 2 D A B + 2 λ D
10 ESSAI LIMITE (A) A B + 2 λ D Résultat ESSAI QUANTITATIF (B) A B 1 2 λ 2 λ 2 0,5 λ 2 0,25 λ 2 D ESSAI QUANTITATIF (B) ESSAI QUANTITATIF (B) A B 1 2 λ λ 2 0,5 λ 2 0,25 λ 2 Moy géo de [point final] entre 0,5 λ et 2 λ D A B 1 2 λ λ 2 0,5 λ 2 0,25 λ 2 Résultat : = λ FD au point final Moy géo de [point final] entre 0,5 λ et 2 λ D MÉTHODES C À F MÉTHODES C À F Techniques photométriques quantitatives Turbidimétriques (C et F) Colorimétriques (D et E) Contrôles préliminaires : Vérification des critères de validité de la courbe d étalonnage Recherche des facteurs d interférences Point final Cinétique
11 (1) Vérification des critères de validité de la courbe d étalonnage Au moins solutions de concentrations différentes en emplaires au moins Méthodes cinétiques : si intervalle de concentrations souhaité > 2 log, préparation d étalon pour encadrer chaque incrément Valeur absolue du coef de corrélation (r) 0,980 (2) Recherche des facteurs d interférences A + - Au - 2 B + [médiane] Au 2 C - Au moins Au 2 D Au (2) Recherche des facteurs d interférences A + - Au - 2 B + [médiane] Au 2 C - Au moins 1 2 Au 2 D Au - 2 recouvrement : % r 0,98 résultat ne doit pas dépasser le niveau du point d étalonnage le plus bas (2) Recherche des facteurs d interférences A + - Au - 2 B + [médiane] Au 2 C - Au moins 1 2 Au 2 D Au - 2 recouvrement : % r 0,98 résultat ne doit pas dépasser le niveau du point d étalonnage le plus bas 6 64 ESSAI A + - Au - 2 B + [médiane] Au 2 C - Au moins 1 2 Au 2 D Au - 2 recouvrement : % r 0,98 résultat ne doit pas dépasser le niveau du point d étalonnage le plus bas ESSAI A + - Au - 2 B + [médiane] Au 2 C - Au moins 1 2 Au 2 D Au - 2 Résultat recouvrement : % r 0,98 résultat ne doit pas dépasser le niveau du point d étalonnage le plus bas
12 MISE EN ŒUVRE AU LABORATOIRE Procédure générale : organisation de la section Procédure : Qualification Essai en routine
13 Intérêts et limites Facilité d emploi Test in vitro Sensibilité fois plus sensible Reproductibilité Très fiable Coût fois moins cher que le lapin Test restrictif Ne détecte que les endotoxines des bactéries G(-) l clusion de tout autre pyrogène Ne permet pas de se faire une idée de la toxicité du produit 1
β-galactosidase A.2.1) à 37 C, en tampon phosphate de sodium 0,1 mol/l ph 7 plus 2-mercaptoéthanol 1 mmol/l et MgCl 2 1 mmol/l (tampon P)
bioch/enzymo/tp-betagal-initiation-michaelis.odt JF Perrin maj sept 2008-sept 2012 page 1/6 Etude de la β-galactosidase de E. Coli : mise en évidence d'un comportement Michaélien lors de l'hydrolyse du
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