KIT CHROMATOGRAPHIE DES PIGMENTS DES YEUX DE LA DROSOPHILE REF : CCMPIGM

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1 : 0033 (0) : 0033 (0) : : sordalab@wanadoo.fr KIT CHROMATOGRAPHIE DES PIGMENTS DES YEUX DE LA DROSOPHILE REF : CCMPIGM A RECEPTION DU COLIS : Vérifier la composition du colis indiquée ci-dessous en page 2 COMPOSITION DU COLIS : 1 tube de drosophiles souche sauvage 1 tube de drosophiles souche Scarlett 1 tube de drosophiles souche Brown 1 tube de drosophiles souche Scarlett brown 1 tube de drosophiles souche White 1 tube de drosophiles souche Sépia 20 plaques de silice 1 notice MATERIEL NECESSAIRE : - Mélange Isopropanol - Ammoniaque à 29% (1:1 v à v) - Pinceau pour manipuler les drosophiles - Cuve à chromatographie - Papier aluminium - Lampe à UV 365 nm (lumière noire) - Grandes pinces et pinces fines - Agitateur en verre ou lame en verre Kit CCMPIGM Page 1 sur 9

2 MATURATION DES TUBES : Les tubes que vous venez de recevoir contiennent des larves au stade du passage pupe-adulte. La vitesse à laquelle va s effectuer ce phénomène est fonction notamment de la température ambiante. A titre d exemple : RECEPTION Œuf larve larve larve pupe imago mort 1 stade 2 stade 3 stade à 26 : 1 jour 2 jours 3 jours 5 j 9-10 j 30 j à 23 : 6-7 j 14 jours à 20 : 8-9 j 18 jours Ces chiffres sont indicatifs car il existe de plus une variabilité au sein de chaque souche ainsi qu entre différentes souches et génotypes. De plus, les pontes se sont effectuées durant plusieurs jours avant d ôter les parents. D une manière approximative, les mouches vont éclore dans une période de : 8 à 20 jours à dater de la réception, si elles sont mises à 20 4 à 8 jours, si elles sont mises à 26. Afin d avoir le maximum de mouches, il est conseillé de les garder 15 jours à 20 (ou 7 jours à 26 ) après la date de réception. Les mouches vivent environ 3 semaines. Attention à ne pas garder les tubes trop longtemps pour éviter l apparition de la génération suivante (25 jours à 20 ou 15 jours à 26 ). Kit CCMPIGM Page 2 sur 9

3 FICHE PREPARATEUR Préparation des cuves à chromatographie Mener les opérations suivantes si possible sous une hotte! Le solvant doit être placé dans les cuves au moins 2 heures avant la séance, pour que l atmosphère du flacon ait le temps de se saturer en vapeurs de solvant. Verser environ 20 ml de solvant (mélange isopropanol Ammoniaque) au fond du flacon pour que la hauteur du liquide soit d environ 1 cm (une fois le gel de silice mis en place, le niveau du liquide devra se situer à environ 1 cm en dessous du trait de crayon, sans atteindre les dépôts). Fermer hermétiquement le flacon avec un couvercle ou du film étirable. PRINCIPE ET INTERET PEDAGOGIQUE: Éclairage historique L histoire de la génétique a connu plusieurs étapes majeures. Grégor Mendel a découvert en 1870 les lois de la génétique formelle en établissant les probabilités de transmission de tel ou tel trait à la descendance lors de croisements chez le pois. Entre 1910 et 1920, Thomas Morgan a confirmé la théorie chromosomique de l hérédité en étudiant les résultats de croisements chez des mutants de la drosophile et les travaux sur cet organisme modèle on conduit à définir le gène comme unité de fonction, de recombinaison et de mutation. Enfin, la découverte par Oswald Avery, en 1944, que les gènes sont formés d ADN et l élucidation de la structure de la molécule d ADN par J. Watson et F. Crick en 1953 rendirent possible la naissance d une nouvelle génétique, la génétique moléculaire. Une des étapes cruciales de ces travaux fut la démonstration par G. Beadle, E. Tatum et J. Lederberg que les gènes s expriment sous forme de protéines, notamment d enzymes, ce que l on résume par l aphorisme «un gène, une enzyme». Cette découverte, qui leur valut le prix Nobel en 1958, fut réalisée en travaillant sur des mutants de la moisissure Neurospora crassa. Mais pour s attaquer à la question de savoir comment les gènes produisent leurs effets, ils travaillèrent initialement sur la couleur de l œil de différents mutants de drosophile. Dans le laboratoire de Morgan, H.J. Muller avait en effet mis au point une méthode d irradiation des mouches par les rayons X permettant de multiplier par 150 le taux naturel de mutations et d obtenir des mutants aux yeux blancs, marrons, vermillons, roses, pourpres, sépia, etc. Beadle étudia ainsi 26 souches mutantes différant par la pigmentation des yeux. Avec B. Ephrussi, il mena de nombreuses expériences de transplantation de disques imaginaux des yeux entre différentes souches. Chez les insectes à métamorphoses complètes (holométaboles), comme les diptères, les organes de l adulte ont pour origine le développement pendant la mue imaginale de disques imaginaux présents chez les larves. Ce sont ces expériences qui les conduisirent à formuler l hypothèse que les gènes agissent par l intermédiaire des enzymes. Toutefois, devant la complexité du système qui conduit à la pigmentation de l œil de la drosophile, il préféra abandonner cet organisme pour en utiliser un plus simple, Neurospora crassa, ce qui le conduisit au succès. Néanmoins, certains des travaux menés sur les pigments de l œil de la drosophile peuvent Kit CCMPIGM Page 3 sur 9

4 être utilisés au lycée pour illustrer diverses notions essentielles : en première S, celle des relations complexes entre génotype et phénotype ; en terminale S, celle de mutations et, en enseignement de spécialité, les notions liées à l histoire de la génétique (thème 2). Enfin, l utilisation de la chromatographie pour séparer les pigments permet de souligner l importance des techniques dans les progrès des connaissances. Les pigments de l œil de la drosophile Les yeux des drosophiles contiennent plusieurs pigments appartenant à deux familles différentes, une de pigments rouges, les ptéridines, et une de pigments bruns, les ommochromes. Leur production est sous le contrôle de deux chaînes de biosynthèse séparées comportant chacune plusieurs enzymes. Chez la souche sauvage, c est le mélange ptéridines/xanthommatine (le produit final de la chaîne de biosynthèse des ommochromes) qui conduit à la couleur rouge brique de l œil. Chez les mutants de la série rouge, comme vermilion, scarlet et cinnabar, le pigment marron est absent et les mouches ont l œil rouge vif. Au contraire, les mutants de la série marron, comme brown ou sepia sont dépourvus de ptéridines ou de certaines d entre elles et ont l œil marron. La situation se complique du fait que les pigments synthétisés par chacune des chaînes de biosynthèse sont ensuite dépendants d un même système de transport pour s accumuler dans des granules pigmentaires qui donnent leur couleur à l œil. Une mutation affectant ce système conduit aussi à l absence de pigments, donc à des yeux blancs. Ainsi, une mouche peut avoir les yeux blancs, soit parce qu elle présente une mutation dans une enzyme du système d accumulation dans les grains, soit parce qu elle possède une double mutation, l une dans la chaîne des ommochromes, l autres dans celle des ptéridines. Ainsi les doubles homozygotes bw, st//bw, st [brown, scarlet] ont les yeux blancs. Les noms des mutants ont été initialement donnés en se référant à leur phénotype visible (la couleur des yeux) et non à l enzyme rendue inactive par la mutation. C est pourquoi les noms ne correspondent ni au gène muté, ni à l enzyme correspondante. La chaîne de biosynthèse des ommochromes est linéaire. Elle comporte quatre enzymes principales et conduit à la production de xanthommatine, un pigment brun. La chaîne de biosynthèse des ptéridines est ramifiée. Elle comporte huit enzymes principales et conduit à la production de différentes ptéridines toutes présentes dans l œil des drosophiles sauvages. Une mutation affectant un gène codant l une des enzymes de la chaîne des ptéridines va se traduire, si l enzyme résultante est inactive, par une réduction de la diversité des ptéridines et donc par une modification de la couleur de l œil. Kit CCMPIGM Page 4 sur 9

5 Les chaînes de biosynthèse des deux pigments sont indiquées ci-après. Applications pédagogiques Ce kit permet d identifier, en utilisant la chromatographie sur couche mince ou sur papier, les ptéridines présentes chez la souche sauvage et de les comparer avec celles présentes chez différents mutants, mais il n explore pas la voie des ommochromes. Il peut être utilisé pour explorer l histoire des sciences, d une part avec les expériences menées par Beadle et Ephrussi pour essayer de déterminer le mode d action des gènes, d autre part avec l utilisation de la chromatographie, technique qui a joué un rôle majeur dans les progrès de la génétique. En mettant en relation les résultats de la chromatographie avec les informations fournies par la chaîne de biosynthèse, on peut en déduire quelles sont les enzymes inactives chez les différents mutants et donc identifier les gènes correspondants. Ceci permet de comprendre, non seulement comment différents génotypes sont à l origine de différents phénotypes chez la drosophile, mais aussi de distinguer la notion de phénotype moléculaire (modification d une seule protéine enzymatique due à une mutation) de celle de phénotype macroscopique (couleur de l œil d origine plurifactorielle due à un mélange de pigments). Il permet également de montrer qu un même phénotype peut résulter de génotypes différents, comme dans le cas de l œil blanc. Kit CCMPIGM Page 5 sur 9

6 FICHE DE MANIPULATION PAR LES ELEVES : 1) Préparation de la plaque de chromatographie Vous disposez d une plaque de 9,5 x 4 cm pour réaliser 4 dépôts. Si vous êtes une classe de 12 binômes, vous disposez d une plaque pour 2 binômes. Utiliser un crayon à papier à mine tendre pour préparer les plaques Poser la plaque le côté de 4 cm vers vous Tracer un trait fin horizontal à 1 cm du bord inférieur Repérer 4 points sur cette ligne : le premier à 1 cm du bord, le second à 0,6 cm du premier, le troisième à 0,6 cm du second et le quatrième à 0,6 cm du troisième. Tracer un trait fort (appuyer assez fortement) horizontal à 1 cm du bord supérieur de la plaque A l aide d une paire de ciseaux, couper les deux bords inférieur de la plaque en enlevant un triangle isocèle de 0,25 cm de côté Avec une perforatrice, réaliser un trou au milieu du bord supérieur de la plaque à environ 0,5 cm de ce bord Schéma représentant la plaque de chromatographie : NB : Les croix permettent de repérer l endroit des dépôts de suspensions de pigments Les deux coupures des coins de la plaque permettent au solvant de migrer par capillarité de façon plus régulière dans la plaque. Le trou dans la plaque permet d attacher la plaque au couvercle pour faciliter la manipulation et éviter les contacts avec le solvant de migration dangereux. Kit CCMPIGM Page 6 sur 9

7 Le trait fort en haut de la plaque permet de repérer le moment où il faut arrêter la migration (le front du solvant est ainsi noté) 2) Préparation des dépôts : Tuer les drosophiles de chaque phénotype à étudier, soit en les mettant dans un flacon contenant un tampon imbibé d éther, soit en les mettant dans un flacon au congélateur. Il faut au moins deux drosophiles du même phénotype pour chaque dépôt, mais pour obtenir de meilleurs résultats, on peut en utiliser jusqu à cinq ou six. Avec des pinces fines, positionner une mouche au niveau de la première croix dessinée sur le papier et écraser la tête avec l extrémité de l agitateur ou le bord de la lame de verre. Éliminer le reste du corps et laisser sécher le dépôt. Recommencer au même endroit successivement avec des mouches du même phénotype (jusqu à cinq ou six) en prenant soin de laisser sécher chaque dépôt avant d écraser une tête supplémentaire. Procéder de la même façon aux autres emplacements choisis pour les mouches des autres phénotypes. Écraser avec l agitateur successivement deux mouches sauvages au même emplacement sur le trait, puis deux mouches d une souche mutante sur un autre emplacement et ainsi de suite pour les différentes souches. Noter le symbole correspondant à chaque phénotype en face de chaque croix à l autre extrémité du papier. NB : Mener les opérations suivantes si possible sous une hotte. Mettre en place le papier en veillant bien à ce que le liquide n atteigne pas les dépôts. S il s agit d une cuve avec un bouchon équipé d un crochet coulissant permettant de suspendre la bande, accrocher la bande au crochet relevé au maximum, l introduire dans la cuve, boucher la cuve avec le bouchon et régler la hauteur du crochet pour que l extrémité inférieure de la bande trempe dans le solvant en restant séparé d environ 1 cm de la ligne des dépôts. Recouvrir le flacon avec du papier d aluminium pour protéger de la lumière les pigments qui sont photosensibles. Laisser le solvant migrer jusqu à ce que le front du solvant soit à environ 1 cm de l extrémité supérieure du papier, soit environ 1 h 30 à 2 heures de développement. Retirer la bande de papier, la déposer sur une feuille de papier essuie-tout et marquer l emplacement du front du solvant. Recouvrir la bande de papier d aluminium (les pigments sont photosensibles) et laisser sécher. Kit CCMPIGM Page 7 sur 9

8 RESULTATS ET INTERPRETATIONS Pour observer les pigments, placer le chromatogramme développé sous la lampe UV (340 nm). Les différentes ptéridines sont fluorescentes en lumière ultraviolette. Les pigments ommochromes (bruns) n apparaissent pas avec cette technique. Ne pas regarder directement la lumière UV! Avec un crayon à papier, entourer chaque tache visible sous les UV et noter à côté sa couleur, par exemple en utilisant les symboles donnés dans le tableau ci-dessous. Chaque pigment est caractérisé par son Rf (référence front). Cette valeur se calcule en faisant le rapport de la distance parcourue par un pigment sur celle parcourue par le solvant. Noter dans le tableau la présence ou l absence des différents pigments et les valeurs de Rf calculées. Chaque souche mutante pour la couleur des yeux est dépourvue de tel ou tel pigment ou groupe de pigments, ce qui peut être mis en relation avec les enzymes et les gènes correspondants en se référant au schéma des voies de biosynthèse donné précédemment. Pteridines (couleur) Rf Sauvage +//+ Sepia se//se Brown bw//bw Scarlet brown StBw//Stbw Scarlet st//st White X w+ //X w+ X w+ //Y Isosepiaptérine (jaune-j) Bioptérine (bleu-b) 2-amino-4- hydroxyptéridine (bleu-b) Sépiaptérin (jaune- J) Xanthoptérin (bleu-vert-bv) Isoxanthoptérine (bleu-violet-v) Drosoptérine (orange-o) Kit CCMPIGM Page 8 sur 9

9 Profil de migration attendu : marron : ommochromes (ne migrent pas, ne fluorescent pas) orange : ptéridines (migrent et fluorescent) jaune : sépiatérines jaunes (migrent et fluorescent) Sauvage White (wh) Scarlet (st) Brown (bw) Sepia (se) St/bw Ptéridines et Aucun pas pas de pas de Aucun ommochromes pigment d ommochromes ptéridines ptéridines pigment orange et rouge, seulement jaunes Rf ~ 75% Rf ~ 60% FICHE SECURITE (guide non exhaustif) Le «solvant de migration» contient des composés organiques à manipuler avec gants, blouse et lunettes. FICHE TRI ET RECUPERATION Le «solvant de migration» doit être récupéré dans les containers pour les solvants organiques. Kit CCMPIGM Page 9 sur 9