Contrôle de la stabilité d un sirop anti-inflammatoire
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- Geoffrey Jean
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1 Contrôle de la stabilité d un sirop anti-inflammatoire 1 / 6 L'instabilité des solutions aqueuses médicamenteuses représente un problème pour leur stockage et leur administration. Des temps de conservation importants peuvent provoquer une diminution de l activité du principe actif et une altération des composants de l excipient. Le principe actif du sirop analysé est l a-amylase. Le principal excipient est le saccharose. Les contrôles effectués seront les suivants : Contrôle de la concentration d activité a-amylasique ; Contrôle du ph optimal de l a-amylase ; Contrôle de la stabilité du saccharose : mesure de son hydrolyse éventuelle. 1. Étude de l activité a-amylasique du sirop 1.1. Présentation L'a-amylase (EC ) catalyse l hydrolyse des liaisons a (1-4) glucosidiques établies entre les unités d oses constituant l'amidon, provoquant la libération de maltose. Ce diholoside réducteur est dosé par la méthode colorimétrique à l'acide 3-5 dinitrosalicylique (DNS). En présence de maltose, le DNS est réduit en un produit orangé/rouge absorbant à 570 nm. Dans les manipulations proposées, toutes les solutions seront colorées suivant le même protocole : 200 µl de solution de glucides réducteurs ; 2 ml de réactif au DNS ; Tube placé 5 minutes au bain thermostaté à 93 C ; Refroidissement rapide dans la glace ; Lecture de l absorbance à 570 nm Étalonnage du spectrophotomètre Réactifs et matériel 6 tubes à hémolyse ; Réactif au DNS en distributeur de 2 ml ; Solution étalon de maltose à 5 g.l -1 ; P200 + cônes ; Bain thermostaté à 93 C Protocole Préparer une gamme de 6 tubes à partir de la solution étalon fournie. Effectuer la coloration au DNS. Donnée : La limite de linéarité de la méthode est de 1 mg de maltose dans les conditions du dosage Compte rendu Présenter un tableau de colorimétrie. A l aide de l outil informatique, tracer la courbe : A 570 = f(mg de maltose / tube).
2 2 / Mesure de la concentration d activité a-amylasique du sirop Principe L activité amylasique du sirop sera mesurée par la méthode dite des prélèvements : la réaction est arrêtée après différents temps d incubation par prélèvement d un volume fixe de milieu réactionnel ajouté à un réactif d arrêt Réactifs et matériel Sirop ; Tampon phosphate à 0,02 mol.l -1 ph 7 ; Solution d amidon à 1 % dans le tampon phosphate ph 7; Réactif au DNS en distributeur de 2 ml ; Tubes à hémolyse ; P20, P100, P200 et P cônes ; Fiole jaugée de 200 ml ; Pipette jaugée de 2 ml ; Bain thermostaté à 37 C ; Bain thermostaté à 93 C Protocole Diluer le sirop au 1/100 dans le tampon phosphate ph 7. La solution obtenue est notée S 1. Dans une série de 7 tubes à hémolyse, ajouter : - 0,9 ml de tampon phosphate ph 7 ; - 1,0 ml d amidon. Préincuber environ 4 minutes à 37 C. Ajouter 100 µl de sirop dilué S 1. Arrêter la réaction aux temps 1, 2, 3, 4, 5, 7 et 9 minutes en prélevant 200µL de milieu réactionnel et en les plaçant dans un tube contenant 2 ml de réactif au DNS. Traiter les tubes comme précédemment. Prévoir le (ou les) témoin(s) nécessaire(s), à traiter dans les mêmes conditions Compte rendu Tracer la courbe A570 = f(t). Calculer la concentration d activité du sirop en U PH.EUR.mL -1 puis en U CEIP.mL -1 à partir de la valeur de da 570 /dt. Q1 : Indiquer la réalisation et la composition quantitative du (ou des) témoin(s). Q2 : Quel est l intérêt de cette méthode par rapport à la méthode en 2 points? Q3 : Quelle est la durée de la phase de vitesse initiale dans ces conditions?
3 3 / 6 Données : M(maltose) = 342 g.mol -1 Une unité PH.EUR (Pharmacopée Européenne) = quantité d enzyme libérant 1 µmol d équivalent réducteur par minute dans les conditions du dosage. Une unité CEIP (Centre d Évaluation et d Information de la Pharmacodépendance) = quantité d enzyme qui catalyse l hydrolyse de 1 mg d amidon en 10 secondes dans les conditions du dosage. 1 U CEIP = 0,7143 U PH.EUR 1.4. Évaluation du ph optimal de l a-amylase Principe L activité amylasique d une solution de sirop dilué notée S 2 sera mesurée à différents ph par la méthode en 2 points. La durée de l incubation sera de 3 minutes Réactifs et matériel Solution de sirop dilué S 2 ; Amidon à 1 % en tampon phosphate 0,02 mol.l -1 ph 7 ; Tampons citrate-phosphate à 0,5 mol.l -1 ph 4, ph 5, ph 6, ph 6,6 et ph8; Réactif au DNS en distributeur de 2 ml ; Tubes à hémolyse ; P20, P100, P200 et P cônes ; Bain thermostaté à 37 C ; Bain thermostaté à 93 C Mode opératoire L activité de l a-amylase est mesurée dans différents tampons selon le même protocole : - dans un tube à hémolyse ajouter 0,9 ml de tampon et 1 ml d amidon ; - préincuber 4 minutes à 37 C ; - ajouter 100 µl de solution de sirop S 2 ; - après 3 minutes d incubation à 37 C, prélever 200 µl de milieu réactionnel ; - les mélanger à 2 ml de réactif au DNS ; - traiter les tubes comme précédemment. NB. : un seul témoin sera préparé en tampon ph Compte rendu Présenter les résultats sous forme de tableau. Tracer la courbe A 570 = f(ph). Conclure. Q4 : La dilution du sirop et la solution d amidon sont préparées en tampon ph 7. Expliquer pourquoi cela n interfère pas avec l étude de l influence du ph.
4 4 / 6 2. Mesure de l hydrolyse du saccharose de l excipient 2.1. Principe Le saccharose, présent dans une prise d essai de sirop, est hydrolysé en présence d invertase. Après avoir fait réagir le sirop hydrolysé dilué sur une quantité déterminée de solution cupro-alcaline, l'excès d'ions cuivriques est dosé par iodométrie (essai «hydrolysat»). La masse m de saccharose hydrolysé correspondante est déterminée à l aide de la table de Luff-Schoorl fournie en annexe. Un essai (essai «sirop») est effectué en parallèle sur le sirop non dilué, non traité à l invertase. Soit m la masse de saccharose hydrolysé correspondante Dosage Réactifs Sirop ; Solution d invertase ; Acide acétique à 20 % ; Iodure de potassium à 30 % ; Acide sulfurique 25 % (m/v) en distributeur de 25 ml sous hotte ; Thiosulfate de sodium à 0,100 mol.l -1 ; Thiodène ; Solution cupro-alcaline : réactif de Luff-Schoorl Protocole opératoire Calcul du volume x (ml) de sirop à hydrolyser En se référant aux paragraphes «Hydrolyse du saccharose» et «Essai», calculer le volume x de sirop à hydrolyser. Données : - les 10 ml d hydrolysat mélangés à la solution cupro-alcaline doivent contenir au maximum 50 mg de glucides réducteurs. - une cuillère à soupe de sirop contient environ 10 g de saccharose ; - une cuillère à soupe = 15 ml ; Hydrolyse du saccharose : Introduire x ml de sirop dans un tube à essai. Ajouter 4 à 5 gouttes d acide acétique à 20 % et 2 ml de solution d invertase. Agiter, boucher et placer dans un bain thermostaté à 37 C pendant 30 minutes. Refroidir. Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 200 ml et compléter au trait de jauge à l eau distillée. Essai : Un essai unique sera réalisé sur l hydrolysat et sur le sirop. Dans un erlenmeyer de 250 ml à col rodé, introduire : - 20 ml de solution cupro-alcaline ; - 15 ml d'eau distillée; - 10 ml de solution à doser (hydrolysat ou sirop). Ajouter quelques grains de pierre ponce. Adapter à l erlenmeyer un réfrigérant à reflux et porter à ébullition. Maintenir l'ébullition pendant 10 minutes exactement. Refroidir immédiatement sous un courant d'eau froide.
5 5 / 6 Après refroidissement complet, ajouter : -10 ml de solution d'iodure de potassium ; -très doucement, 25 ml d'acide sulfurique à 25 % (risque de formation d une mousse abondante). Titrer immédiatement par la solution de thiosulfate de sodium. Le virage se repère par l apparition d une coloration laiteuse. L absence de diiode peut être confirmée par l ajout d une pointe de spatule de thiodène. Soient n 1 et n 2 les volumes de thiosulfate utilisés respectivement pour l essai «sirop» et pour l essai «hydrolysat». Témoin : Réaliser 2 témoins Effectuer un dosage témoin sans porter à ébullition dans lequel 10 ml d'eau distillée remplacent les 10 ml de prise d essai. Soit n le volume de thiosulfate employé Compte rendu Présenter le calcul qui a permis de déterminer le volume x de sirop à hydrolyser. A partir des volumes de thiosulfate versés pour les essais et les témoins, déterminer les masses m et m de saccharose hydrolysé. En déduire la concentration massique en saccharose du sirop et le pourcentage d hydrolyse du saccharose. Données : M(saccharose) = 342 g.mol -1 M(hexose) = 180 g.mol -1
6 6 / 6 Annexe : Table de Luff-Schoorl Table de correspondance entre le volume de solution de thiosulfate de sodium à 0,100 mol.l -1 : (n n) ml et la quantité de glucides réducteurs en mg Na 2 S 2 O 3 (ml) Glucides réducteurs (mg) 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 Na 2 S 2 O 3 (ml) Glucides réducteurs (mg) 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,2 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2
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