Évaluation de la structure épidermique des substituts cutanés produits par la méthode d auto-assemblage

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1 Évaluation de la structure épidermique des substituts cutanés produits par la méthode d auto-assemblage Mémoire Laetitia Angers Maîtrise en sciences pharmaceutiques Maître ès sciences (M.Sc.) Québec, Canada Laetitia Angers, 2015

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3 Résumé Une adaptation de la méthode d auto-assemblage développée au LOEX permet de produire des substituts cutanés bicouches ayant un phénotype psoriasique. Le premier objectif de ce travail était d évaluer si une conservation par la congélation des substituts cutanés était envisageable afin d avoir accès à ces derniers en tout temps pour effectuer des analyses physiochimiques sans délais. Les études réalisées sur des substituts sains montrent qu elle ne l est pas dans sa méthodologie actuelle puisqu elle affecte la fonction barrière des substituts. Par ailleurs, en raison du rôle des lipides épidermiques dans la fonction barrière et de leur implication dans le psoriasis, une caractérisation de ces lipides a été effectuée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats obtenus montrent principalement une diminution de la proportion d acide linoléique dans les substituts par rapport à la peau normale humaine. Ces résultats sont prometteurs en raison du rôle de cet acide et de ses métabolites dans l inflammation. iii

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5 Abstract Adaptation of the self-assembly method developed at LOEX allows us to produce bilayered skin substitutes with psoriatic phenotype. The first aim of this study was to evaluate if freezing of the skin substitutes is possible without affecting its integrity, in order to access the skin substitutes in anytime to perform physicochemical analysis without delay. Results, obtained with control skin substitutes produced via the standard described self-assembly method, showed that freezing clearly affected the skin barrier function of the skin substitutes. Moreover, because of their implication in skin barrier and in psoriasis pathology, epidermal skin lipids of control and psoriatic skin substitutes were characterized by gas chromatography. Results showed mainly a significant reduction of the linoleic acid proportion in skin substitutes compared to normal human skin. These results are promising because of the implication of linoleic acid and its metabolites in inflammation. v

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7 Table des matières Résumé...iii Abstract... v Table des matières... vii Liste des tableaux... xi Liste des figures... xiii Liste des abréviations... xv Remerciements... xvii Avant-propos... xix 1. Introduction générale La peau L hypoderme Le derme L épiderme La couche cornée Le psoriasis Histologie Étiologie du psoriasis Analyse des lipides par chromatographie Les lipides de la peau saine Les lipides de surface Les lipides épidermiques Les lipides de la couche cornée Les céramides Les stérols Les acides gras Les lipides de la peau psoriasique Les lipides du sérum Les lipides de l épiderme et du stratum corneum L absorption percutanée Facteurs influençant la perméabilité de la peau Les facteurs biologiques vii

8 viii Les facteurs physicochimiques Les voies de passage Le flux Les coefficients de diffusion et de partage La méthode La spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée (ATR) Le génie tissulaire Modèles de substituts de peau saine Modèles de substituts de peau psoriasique Utilisation et conservation Objectifs du projet Congélation des substituts cutanés Résumé Article Abstract Introduction Material and methods Results Discussion Conclusion Legend to Figures Acknowledgements Tables and figures References Analyses des lipides épidermiques Mise en contexte Matériel et méthodes Extraction et culture cellulaire Méthode d auto-assemblage Isolation de l épiderme Analyses chromatographiques Analyses par chromatographie sur couche mince (HPTLC) Analyses par chromatographie gazeuse Analyses statistiques Résultats et discussion Méthode d analyse Analyses par HPTLC... 79

9 Analyses par chromatographie en phase gazeuse des lipides épidermiques d une peau saine et des substituts sains Phospholipides Triglycérides Analyse par chromatographie en phase gazeuse des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques Phospholipides Triglycérides Conclusion Conclusions Conclusions par objectif Limitations Perspectives Bibliographie ix

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11 Liste des tableaux Tableau 3.1 Étapes d extraction des lipides Tableau 3.2 Liste des standards pour les analyses par HPTLC Tableau 3.3 Acides gras analysés par chromatographie en phase gazeuse xi

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13 Liste des figures Figure 1.1 Couches de la peau normale humaine... 2 Figure 1.2 Couches de l épiderme de la peau normale humaine... 5 Figure 1.3 Différenciation des kératinocytes au travers des différentes couches de l épiderme... 6 Figure 1.4 Représentation «Briques dans le mortier» des cornéocytes de la couche cornée 8 Figure 1.5 Les cinq différentes formes de psoriasis... 9 Figure 1.6 La boucle inflammatoire du psoriasis Figure 1.7 Variation de la concentration de certains lipides au travers des couches de l épiderme, en % massique Figure 1.8 Composition lipidique de l épiderme dans ses différentes couches, en % massique Figure 1.9 Formation des feuillets lipidiques bilamellaires Figure 1.10 Formation des feuillets lipidiques Figure 1.11 Les différentes classes de céramides Figure 1.12 Voies de formation des céramides Figure 1.13 Structure du cholestérol Figure 1.14 Les voies de passage au travers de la couche cornée Figure Cellule de Franz statique Figure 1.16 Spectre infrarouge d une peau normale humaine Figure 3.1 Séparation des lipides sur plaque chromatographique Figure 3.2 Exemple d une TLC obtenue par le système de séparation des céramides en 1D Figure 3.3 Proportion des lipides épidermiques des biopsies de peau et des substituts sains dans la fraction «Phospholipides» Figure 3.4 Structure de l acide linoléique Figure 3.5 Série des oméga-3 et Figure 3.6 Métabolites des acides oméga Figure 3.7 Proportion des lipides épidermiques des biopsies de peau et des substituts sains dans la fraction «Triglycérides» Figure 3.8 Proportion des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques dans la fraction «Phospholipides» Figure 3.9 Proportion des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques dans la fraction «Triglycérides» Figure 3.10 Longueur de chaines des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques dans la fraction «Triglycérides» xiii

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15 Liste des abréviations 12 HETE 3T3 ADN APCI ATR CER DMEM DMSO EDTA EGF ELSD ESI FDA FID FNHS FSS FTIR GC HDL HPLC HPTLC K K 2 CO 3 Acide 12 hydroxyeicosatétraénoïque 3 day transfer, inoculum 3 x 10 5 cell Acide désoxyribonucléique Atmospheric pressure chemical ionization Attenuated total reflectance Céramide Dulbecco's modified Eagle medium Diméthylsulfoxyde Acide éthylène diamine tétraacétique Facteur de croissance épidermique Evaporative light scattering detector Electrospray ionization Food and Drug Administration Flame ionization detector Frozen normal human skin Frozen skin substitute Fourier transform infrared spectroscopy Chromatographie en phase gazeuse High density lipoprotein High performance liquid chromatography High performance thin layer chromatography Kératine Carbonate de potassium, xv

16 KCl LDL LOEX MAP MCT Chlorure de potassium Low density lipoprotein Laboratoire d'organogénèse expérimentale microtubule associated protein mercury cadmium telluride MRP 8 Myeloid related protein 8 MS Spectrométrie de masse n 3 Oméga 3 n 6 Oméga 6 NHS NPLC PBS PUFA SCID SD SKALP SS SSLs TGF TOF MS UPLC VLDL Normal human skin Normal phase liquid chromatography Phosphate buffered saline Polyinsaturated fatty acids Severe combined immunodeficiency Écart type Skin derived antileukoprotease Skin substitute Skin surface lipids Transforming growth factor Time of flight mass spectrometry Ultra performance liquid chromatography Very low density lipoprotein xvi

17 Remerciements La réalisation de mes travaux de maîtrise s est effectuée au Laboratoire d Organogénèse Expérimentale (LOEX) du Centre hospitalier universitaire de Québec (Hôpital Enfant- Jésus) sous la direction du Dr Roxane Pouliot. Je tiens tout d abord à remercier ma directrice de recherche, le Dr Roxane Pouliot, pour son support tout au long de mes études. Ses conseils, sa grande disponibilité et son écoute ont été grandement appréciés et m ont permis d apprendre et de progresser tout au long de mon cheminement à la maîtrise. Je veux également remercier tous les membres de l équipe de recherche, en particulier Jessica Jean et Isabelle Gendreau pour leur aide et leurs conseils. Merci spécialement à Sarah Dubois Declercq avec qui j ai réalisé la première partie de mon projet. Sa présence et son soutien auront permis de mener à bien ces travaux communs. Je profite de l occasion pour remercier tous les membres du LOEX, en particulier ceux de mon bureau pour leur dynamisme. Merci à François Dominique Scott pour son aide en statistique et à Marie Leroy pour son support lors des analyses en infrarouge. Merci également aux organismes subventionnaires suivants : FQRNT, CRSNG et IRSC ainsi qu à Hydro-Québec pour leur support financier. Finalement, un merci tout particulier à ma famille et à mes proches qui m ont encouragée tout au long de mes études. xvii

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19 Avant-propos Le deuxième chapitre de ce mémoire fait l objet d un article intitulé ATR-FTIR and drug permeation studies of cryopreserved human tissue-engineered skin substitutes for pharmaceutical studies perspective qui sera soumis dans le journal Skin Pharmacology avec Sarah Dubois Declercq et moi-même comme coauteurs principaux en raison d une contribution équivalente à cet article. J ai développé et réalisé la majorité des expériences de ce projet conjointement avec Sarah Dubois Declercq. Les extractions cellulaires des kératinocytes et fibroblastes utilisés pour la production des substituts sains avaient préalablement été effectuées par d anciens membres du groupe de recherche. La production des substituts cutanés a été effectuée avec Sarah Dubois Declercq dans un partage des tâches égal sous la supervision initiale de Jessica Jean. Les analyses d absorption percutanée ont principalement été réalisées par Sarah Dubois Declercq, mais j ai participé au traitement des données avec l aide de celle-ci et de Marielle Robert. J ai réalisé les analyses de spectroscopie infrarouge et j en ai analysé les données. Les analyses statistiques ont été prises en charge par Sarah Dubois Declercq. Finalement, Sarah Dubois Declercq et moi avons rédigé l article sous la supervision du Dr Roxane Pouliot. xix

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21 1. Introduction générale 1

22 1.1. La peau La peau est un épithélium d un poids moyen de 4 kg, d une superficie d environ 2 m 2 et d une épaisseur moyenne de 2 mm (Mélissopoulos & Levacher, 1998; Schaefer & Redelmeier, 1996), ce qui en fait le plus grand et le plus lourd organe du corps humain. Cet organe simple en apparence, mais complexe en réalité, est formé de trois couches : l épiderme, le derme et l hypoderme (Marieb, 2005). La peau joue un rôle crucial à différents niveaux par l action de ses quatre principales fonctions (Gartner & Hiatt, 2007). Figure 1.1 Couches de la peau normale humaine (Tirée de (Gartner & Hiatt, 2007)) 1) Tout d abord, constituant l interface entre l intérieur du corps et le monde extérieur, la peau joue un rôle de protection très important. Elle agit en tant que barrière physique, 2

23 chimique, biologique et immunologique pour contrer les agents pathogènes (Harding, 2004) En tant que barrière, la peau permet aussi de réguler la perte d eau. Différents mécanismes interviennent pour assurer cette fonction de barrière. Parmi ceux-ci se trouvent un système de défense immunitaire basé sur l interaction entre différents types cellulaires (Gartner & Hiatt, 2007; Ovalle & Nahirney, 2008) de même que la présence d une couche acide en surface. Effectivement, la couche cornée est à un ph variant entre 4 et 5,5, ce qui lui confère des propriétés antiseptiques (Choi, et al., 2007). 2) La peau agit également comme thermorégulateur. En effet, elle permet de maintenir la température du corps humain à une température d environ 37 C (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Cette thermorégulation est rendue possible grâce à la présence des poils et des glandes sudoripares (Heath, et al., 2008) de même qu à la contraction et dilatation des vaisseaux sanguins (Eroschenko & di Fiore, 2012). L hypoderme agit également comme couche isolante. 3) Différents récepteurs tactiles et sensoriels se retrouvent dans la peau, ce qui lui confère des propriétés au niveau de la perception. Les récepteurs sensoriels qui s y retrouvent sont des mécanorécepteurs, des thermorécepteurs et des nocicepteurs (Kierszenbaum, et al., 2006). 4) Finalement, la quatrième fonction principale de la peau consiste à métaboliser la vitamine D (Gartner & Hiatt, 2007). En effet, lors de l absorption de rayons ultraviolets par la peau, le cholestérol qui s y retrouve est transformé en vitamine D3. Par la suite, cette dernière sera elle-même modifiée par le foie et les reins en vitamine D active (Heath, et al., 2008) L hypoderme L hypoderme est un tissu adipeux représentant 15 à 20 % du poids corporel. Des extensions de fibres de collagène et de fibres élastiques le relient au derme (Mélissopoulos & 3

24 Levacher, 1998). Il est composé de cellules, les adipocytes, et de tissu conjonctif (Kierszenbaum, et al., 2006). Les adipocytes ont la particularité de pouvoir subir une importante variation de volume en peu de temps lorsqu il y a changement du poids corporel (Mélissopoulos & Levacher, 1998). L hypoderme joue un rôle important comme isolant thermique et amortisseur des chocs extérieurs (Stevens & Lowe, 2005). Il représente par ailleurs la plus grande réserve d énergie de tout le corps humain (Lowe & Anderson, 2014) en emmagasinant les lipides sous forme de triglycérides (phase de captation) pour ensuite les relarguer sous formes d acides gras ou encore de glycérol (lipolyse). L hypoderme constitue également une réserve d hormones stéroïdes et est un site important dans la transformation des androgènes en oestrogènes (Mélissopoulos & Levacher, 1998) Le derme Le derme est un tissu conjonctif relié à l épiderme par la jonction dermo-épidermique. Il se divise en deux zones, soit le derme papillaire, d où ont lieu les échanges avec l épiderme, et la couche réticulaire (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Le derme est principalement constitué de fibroblastes qui se trouvent dans une matrice extracellulaire qu ils produisent eux-mêmes. Effectivement, les fibroblastes sont responsables de la synthèse du collagène, de l élastine et de glycoprotéines de structure dont est constituée la matrice. Le derme contient également un réseau de capillaires qui alimente les trois couches cutanées en nutriments et en oxygène et qui élimine les déchets qui y sont produits (Mélissopoulos & Levacher, 1998). On retrouve également dans le derme les glandes sébacées et sudoripares, les cellules du système immunitaire (Jean, 2010; Marieb, 2005; Mélissopoulos & Levacher, 1998) de même que des fibres nerveuses et des récepteurs sensoriels tels des mécanorécepteurs, des thermorécepteurs et des nocicepteurs (Kierszenbaum, et al., 2006) L épiderme L épiderme constitue la couche externe de la peau et joue un rôle important dans la formation d une barrière physique, chimique, biologique et immunologique contre les agents extérieurs (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Cette structure est stratifiée et non 4

25 vascularisée. Elle est composé de kératinocytes se subdivisant en quatre ou cinq couches (Marieb, 2005) soit la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse, la couche claire, présente uniquement au niveau de la plantes des pieds et de la paume des mains, et la couche cornée. Son épaisseur varie entre 0,05 mm et 1,5 mm. Peau mince Peau épaisse Figure 1.2 Couches de l épiderme de la peau normale humaine (Tirée de (Ash, et al., 2012)) L épiderme est composé à 80 % de kératinocytes (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Ces cellules subissent un processus de différenciation cellulaire lors de leur migration au travers des différentes couches de l épiderme jusqu à la surface de ce dernier (Gartner & Hiatt, 2007; Junqueira & Carneiro, 2005; Ovalle & Nahirney, 2008). Ce faisant, ils synthétisent différentes protéines de la famille des kératines. Ce sont des protéines qui contribuent entre autres au rôle de barrière (Stevens & Lowe, 2005). L épiderme est donc en constant renouvellement. De la couche basale à la couche cornée, les kératinocytes changent d aspect. Dans la couche basale, ils sont de forme cylindrique et perpendiculaires aux papilles du derme (Mélissopoulos & Levacher, 1998). La différenciation cellulaire commence dans cette couche, alors qu un kératinocyte se divise en deux cellules; une 5

26 restera dans la couche basale où elle continuera à se différencier et une migrera vers les couches supérieures. On retrouve dans cette couche les kératines de type 5 et 14 (Blumenberg & Tomic-Canic, 1997). Les kératinocytes situés dans la 2 e couche, soit la couche épineuse, sont de forme polyédrique avec un noyau sphérique (Wysocki, 1999). Il y a présence de desmosomes rattachant les kératinocytes entre eux (Eckert, 1989). On retrouve également dans cette couche les kératines de type 1 et 10 (Blumenberg & Tomic- Canic, 1997). Au niveau de la couche granuleuse, les kératinocytes sont d apparence fusiforme (Mélissopoulos & Levacher, 1998), alors qu au niveau de la couche claire, ils présentent une forme aplatie et ont un noyau très petit, voire absent (Wysocki, 1999). Finalement, dans la couche cornée, les kératinocytes n ont plus de noyau ni d organites cytoplasmiques. Rendus en surface, ils se détachent afin d être remplacés par de nouvelles cellules. Ce processus porte le nom de desquamation (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Figure 1.3 Différenciation des kératinocytes au travers des différentes couches de l épiderme (Tirée de (Schaefer & Redelmeier, 1996)) 6

27 L épiderme, en plus des kératinocytes, contient également des mélanocytes. La mélanine, que synthétisent ces cellules, a la propriété d absorber les rayons ultraviolets du soleil permettant ainsi la protection de l ADN cellulaire (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Les cellules de Langerhans et les cellules de Merkel sont deux autres types cellulaires retrouvés dans l épiderme. Alors que les premières sont impliquées dans le système immunitaire (Kierszenbaum, et al., 2006; Mélissopoulos & Levacher, 1998), les secondes le sont au niveau des récepteurs sensoriels du toucher (Wysocki, 1999). L épiderme contient également des terminaisons nerveuses reliées au derme (Stellman & Dufresne, 2000) La couche cornée La couche cornée étant directement en contact avec le monde extérieur, elle est la principale actrice dans la fonction de barrière physique (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Elle est constituée de cornéocytes, c est-à-dire de kératinocytes complètement différenciés, imbriqués dans une matrice intercellulaire de lipides (Walters, 2002). Cette organisation est souvent représentée par l illustration de briques dans du mortier. Grâce à leur organisation spécifique, ces différents lipides interviennent en tant que barrière par le biais de plusieurs mécanismes. Par conséquent, ils jouent un rôle important au niveau de la perméabilité de la peau (Bernard, et al., 2007; Duque Fernandez, 2008). 7

28 Figure 1.4 Représentation «Briques dans le mortier» des cornéocytes de la couche cornée (Tirée de (Harding, 2004) et modifiée par Jessica Jean (Jean, 2010)) 1.2. Le psoriasis Le psoriasis est une dermatose érythémato-squameuse qui est auto-immune et non contagieuse. Il s agit d une maladie chronique touchant 3 à 5% de la population. Comme son nom l indique, cette dermatose est reconnaissable par des plaques rouges (érythème) recouvertes de squames. Elle peut se présenter sous cinq formes différentes, soit le psoriasis en plaques, en gouttes, inversé, pustuleux ou érythrodermique (Nicolas & Thivolet, 1997). Le psoriasis en plaques est le plus commun, représentant environ 80% des cas (Dubertret, 2004). 8

29 Psoriasis en plaques Psoriasis en gouttes Psoriasis pustuleux Psoriasis érythrodermique Psoriasis inversé Figure 1.5 Les cinq différentes formes de psoriasis (Tirée de (Thivolet & Schmitt, 1993)) 9

30 Histologie Le psoriasis est caractérisé par une augmentation de la prolifération des kératinocytes et par une maturation incomplète de ces derniers. Effectivement, au lieu de prendre entre 28 et 44 jours, leur processus de différenciation au travers des différentes couches de l épiderme ne prend qu autours de 4 jours (Federman, et al., 1999). Le derme et l épiderme des lésions psoriasiques sont également infiltrés par des cellules du système immunitaire. En outre, il y a augmentation de l angiogénèse de même que présence d anomalies au niveau de la composition protéinique, certaines protéines étant sur- ou sous-exprimées. Ces anomalies peuvent être regroupées en trois catégories, soit celles reliées à la différenciation ou à l hyperprolifération des kératinocytes et à l infiltration des cellules du système immunitaire. Au niveau des anomalies protéiniques reliées à la différenciation des kératinocytes, la filaggrine est un marqueur qui est sous-exprimé dans une peau psoriasique. Elle se retrouve habituellement dans la couche granuleuse, qui est absente dans une peau lésionnelle (Bernard, et al., 1988). Les marqueurs de différenciation terminale K1 et K10 sont également sous-exprimés (Mils, et al., 1994). À l inverse, il y a surexpression de l involucrine, une protéine impliquée dans la stabilisation de l enveloppe kératinisée (Ishida-Yamamoto & Iizuka, 1995). C est le cas également du marqueur de différenciation MRP-8, impliqué dans la formation de liens avec le Ca 2+ et dans la réorganisation du cytosquelette, et du SKALP, impliqué dans la dégradation de l élastine (Nagpal, et al., 1996). Différentes protéines présentes dans les peaux psoriasiques sont aussi impliquées dans l hyperprolifération des kératinocytes. Il y a ainsi une augmentation du nombre de récepteurs du facteur épidermique de croissance (EGF) dans les couches supérieures d un épiderme psoriasique par rapport à celui d une peau saine (Nanney, et al., 1986). Le TGF-α est également augmenté (Turbitt, et al., 1990), tout comme l activité de la kinase MAP, impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire (Dimon-Gadal, et al., 1998). Différents marqueurs de la kératine sont également affectés dans une peau lésionnelle. 10

31 C est le cas entre autres des K5, K6, K14 et K16 qui sont surexprimées (Thewes, et al., 1991). Une peau psoriasique présente également de nombreuses dérégulations au niveau des interleukines, un groupe de cytokines particulièrement important au niveau du système immunitaire. En effet, les interleukines 8, 13, 17, 22 et 23 sont, par exemple, surexprimées, alors que l interleukine 10 est, au contraire, sous-exprimée dans la peau psoriasique (Menter & Stoff, 2010) Étiologie du psoriasis Les causes exactes du psoriasis sont à ce jour inconnues. Il est toutefois généralement admis que des facteurs immunologiques, environnementaux et génétiques entreraient en jeu (Nicolas & Thivolet, 1997). Une fois le processus de la maladie enclenché, il en résulte une boucle impliquant la réponse immunitaire du système et le stress subi par les kératinocytes. En effet, chez une personne à la peau saine, suite à une agression de l épiderme, la réponse inflammatoire rapide poussera les cellules immunitaires à produire des facteurs de croissance afin de favoriser la division des kératinocytes et ainsi réparer rapidement la blessure. L inflammation disparaitra ensuite. Dans le cas d une peau psoriasique, l inflammation perdure en raison d une réponse exagérée du système immunitaire (Ainsworth, 2012). La réponse n est toutefois pas constante puisque la maladie évolue en phases de poussées de plaques suivies par des phases de rémission. Le psoriasis se divise en trois niveaux de gravité selon le pourcentage de peau atteinte : la forme légère (moins de 2 %), la forme modérée (2 à 10 %) et la forme grave (plus de 10 %) (Lebwohl, et al., 2004). 11

32 Figure 1.6 La boucle inflammatoire du psoriasis (Tirée de (Ainsworth, 2012)) 1.3. Analyse des lipides par chromatographie L isolation des lipides d un échantillon naturel tel que la peau se fait principalement par extraction avec des solvants organiques. Différentes combinaisons peuvent être utilisées afin de limiter les pertes et la dénaturation des lipides au cours du processus. Des solvants neutres, acides ou basiques peuvent être employés, chacun présentant certains inconvénients (Myher & Kuksis, 1995). Alors que les solvants neutres résultent en un faible recouvrement des phospholipides acides, des lysophospholipides et des acides gras nonestérifiés, les solvants acides peuvent générer des lysophospholipides lorsque l échantillon contient initialement des plasmalogènes. L emploi de solvants alcalins, d un autre côté, engendre un risque de désacyler certains composés. Une fois l isolation des lipides effectuée, des analyses par chromatographie peuvent être effectuées. Cette technique est une méthode analytique permettant de séparer physiquement des espèces chimiques. Ces dernières sont mises en solution dans une phase mobile qui passe au travers d une phase stationnaire. Les différentes molécules sont éluées à un rythme 12

33 plus ou moins rapide en fonction de leurs propriétés et de celles des phases mobiles et stationnaires. Il existe plusieurs types de techniques chromatographiques qui peuvent être classées en fonction de leur phase mobile et du mécanisme de séparation entrant en jeu. Les lipides de la peau saine et de la peau psoriasique ont été analysés par différents groupes de recherche à l aide de méthodes chromatographiques variées. Plusieurs études utilisent la chromatographie sur couche mince afin de séparer ou d analyser différentes classes de lipides présentes dans la peau (Farwanah, et al., 2002; Imokawa, et al., 1989; Melnik, et al., 1989; Ponec & Weerheim, 1990; Weerheim & Ponec, 2001; Wertz, et al., 1985). Afin de quantifier les lipides, un densitomètre peut être utilisé (Motta, et al., 1993). La chromatographie sur couche mince est toutefois une méthode encombrante, nécessitant beaucoup de temps et une concentration de molécules assez spécifique si l on veut obtenir une détection nette et optimale. De plus, la quantité maximale de molécules pouvant être séparée en une analyse est limitée (Gildenast & Lasch, 1997). Afin de palier à certains de ces inconvénients, la chromatographie sur couche mince peut aussi être utilisée en précurseur d une autre méthode chromatographique. Cette technique d analyse implique l utilisation d une plaque de silice sur laquelle les extraits de lipides sont mis à éluer. La plaque est ensuite grattée et hydrolisée, ce qui permet ensuite l analyse par chromatographie en phase gazeuse ou liquide. Alors que le chromatographe gazeux est principalement couplé à un MS (Gonzalez-Illan, et al., 2011; Michael-Jubeli, et al., 2011; Pons, et al., 2002), la chromatographie liquide, quant à elle, a aussi été utilisée couplée à divers autres détecteurs. On retrouve ainsi par exemple des analyses par ESI-MS, par APCI-MS (Farwanah, et al., 2002) et par ELSD (Christie, 1985). Par ailleurs, certains lipides ont été analysés spécifiquement dans différentes études. C est le cas des céramides de la couche cornée dont la caractérisation a entre autres été effectuée par NPLC-ESI-MS, ce qui a permis d identifier 342 céramides différents et de découvrir une nouvelle classe de céramides présents dans la peau, le CER[ADS] en plus des 10 déjà connus (Masukawa, et al., 2008). Par ailleurs, les acides gras libres ont été analysés spécifiquement par GC-MS et GC-FID (Norlen, et al., 1998). Plus récemment, l UPLC en phase inverse a commencé à être utilisé pour les analyses lipidiques couplé, par exemple, à 13

34 un TOF-MS (Rainville, et al., 2007). Son utilisation permet une séparation meilleure et plus rapide qu avec un HPLC standard. Il est à noter que pour les analyses en chromatographie liquide, la phase inverse est à privilégier au dépend de la phase normale puisqu elle offre une meilleure compatibilité avec les échantillons biologiques et lipophiles (Rainville, et al., 2007) Les lipides de la peau saine Les lipides de surface La peau est un site riche en lipides ayant des fonctions diversifiées. Elle est recouverte en surface par une couche de lipides (SSLs) sous forme d un film hydrolipidique. Ces SSLs sont composés d un mélange de lipides sébacés et épidermiques incluant entre autres des triglycérides, des esters et des squalènes. La fraction acide gras des SSLs est riche en acides gras à longues chaînes, mais pauvre en polyinsaturés (PUFAs). Ces lipides de surface possèdent entre autres des propriétés antimicrobiennes (De Luca & Valacchi, 2010) Les lipides épidermiques La composition lipidique varie au travers des différentes couches de l épiderme. Tout au long du processus de kératinisation, celle-ci change, passant d une composition contenant davantage de lipides polaires à une composition comportant majoritairement des lipides neutres. Ce changement de composition lipidique n est toutefois pas linéaire, certains lipides augmentant en concentration dans une couche supérieure pour diminuer par la suite (Lampe, et al., 1983). 14