Évaluation de la structure épidermique des substituts cutanés produits par la méthode d auto-assemblage

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1 Évaluation de la structure épidermique des substituts cutanés produits par la méthode d auto-assemblage Mémoire Laetitia Angers Maîtrise en sciences pharmaceutiques Maître ès sciences (M.Sc.) Québec, Canada Laetitia Angers, 2015

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3 Résumé Une adaptation de la méthode d auto-assemblage développée au LOEX permet de produire des substituts cutanés bicouches ayant un phénotype psoriasique. Le premier objectif de ce travail était d évaluer si une conservation par la congélation des substituts cutanés était envisageable afin d avoir accès à ces derniers en tout temps pour effectuer des analyses physiochimiques sans délais. Les études réalisées sur des substituts sains montrent qu elle ne l est pas dans sa méthodologie actuelle puisqu elle affecte la fonction barrière des substituts. Par ailleurs, en raison du rôle des lipides épidermiques dans la fonction barrière et de leur implication dans le psoriasis, une caractérisation de ces lipides a été effectuée par chromatographie en phase gazeuse. Les résultats obtenus montrent principalement une diminution de la proportion d acide linoléique dans les substituts par rapport à la peau normale humaine. Ces résultats sont prometteurs en raison du rôle de cet acide et de ses métabolites dans l inflammation. iii

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5 Abstract Adaptation of the self-assembly method developed at LOEX allows us to produce bilayered skin substitutes with psoriatic phenotype. The first aim of this study was to evaluate if freezing of the skin substitutes is possible without affecting its integrity, in order to access the skin substitutes in anytime to perform physicochemical analysis without delay. Results, obtained with control skin substitutes produced via the standard described self-assembly method, showed that freezing clearly affected the skin barrier function of the skin substitutes. Moreover, because of their implication in skin barrier and in psoriasis pathology, epidermal skin lipids of control and psoriatic skin substitutes were characterized by gas chromatography. Results showed mainly a significant reduction of the linoleic acid proportion in skin substitutes compared to normal human skin. These results are promising because of the implication of linoleic acid and its metabolites in inflammation. v

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7 Table des matières Résumé...iii Abstract... v Table des matières... vii Liste des tableaux... xi Liste des figures... xiii Liste des abréviations... xv Remerciements... xvii Avant-propos... xix 1. Introduction générale La peau L hypoderme Le derme L épiderme La couche cornée Le psoriasis Histologie Étiologie du psoriasis Analyse des lipides par chromatographie Les lipides de la peau saine Les lipides de surface Les lipides épidermiques Les lipides de la couche cornée Les céramides Les stérols Les acides gras Les lipides de la peau psoriasique Les lipides du sérum Les lipides de l épiderme et du stratum corneum L absorption percutanée Facteurs influençant la perméabilité de la peau Les facteurs biologiques vii

8 viii Les facteurs physicochimiques Les voies de passage Le flux Les coefficients de diffusion et de partage La méthode La spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée (ATR) Le génie tissulaire Modèles de substituts de peau saine Modèles de substituts de peau psoriasique Utilisation et conservation Objectifs du projet Congélation des substituts cutanés Résumé Article Abstract Introduction Material and methods Results Discussion Conclusion Legend to Figures Acknowledgements Tables and figures References Analyses des lipides épidermiques Mise en contexte Matériel et méthodes Extraction et culture cellulaire Méthode d auto-assemblage Isolation de l épiderme Analyses chromatographiques Analyses par chromatographie sur couche mince (HPTLC) Analyses par chromatographie gazeuse Analyses statistiques Résultats et discussion Méthode d analyse Analyses par HPTLC... 79

9 Analyses par chromatographie en phase gazeuse des lipides épidermiques d une peau saine et des substituts sains Phospholipides Triglycérides Analyse par chromatographie en phase gazeuse des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques Phospholipides Triglycérides Conclusion Conclusions Conclusions par objectif Limitations Perspectives Bibliographie ix

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11 Liste des tableaux Tableau 3.1 Étapes d extraction des lipides Tableau 3.2 Liste des standards pour les analyses par HPTLC Tableau 3.3 Acides gras analysés par chromatographie en phase gazeuse xi

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13 Liste des figures Figure 1.1 Couches de la peau normale humaine... 2 Figure 1.2 Couches de l épiderme de la peau normale humaine... 5 Figure 1.3 Différenciation des kératinocytes au travers des différentes couches de l épiderme... 6 Figure 1.4 Représentation «Briques dans le mortier» des cornéocytes de la couche cornée 8 Figure 1.5 Les cinq différentes formes de psoriasis... 9 Figure 1.6 La boucle inflammatoire du psoriasis Figure 1.7 Variation de la concentration de certains lipides au travers des couches de l épiderme, en % massique Figure 1.8 Composition lipidique de l épiderme dans ses différentes couches, en % massique Figure 1.9 Formation des feuillets lipidiques bilamellaires Figure 1.10 Formation des feuillets lipidiques Figure 1.11 Les différentes classes de céramides Figure 1.12 Voies de formation des céramides Figure 1.13 Structure du cholestérol Figure 1.14 Les voies de passage au travers de la couche cornée Figure Cellule de Franz statique Figure 1.16 Spectre infrarouge d une peau normale humaine Figure 3.1 Séparation des lipides sur plaque chromatographique Figure 3.2 Exemple d une TLC obtenue par le système de séparation des céramides en 1D Figure 3.3 Proportion des lipides épidermiques des biopsies de peau et des substituts sains dans la fraction «Phospholipides» Figure 3.4 Structure de l acide linoléique Figure 3.5 Série des oméga-3 et Figure 3.6 Métabolites des acides oméga Figure 3.7 Proportion des lipides épidermiques des biopsies de peau et des substituts sains dans la fraction «Triglycérides» Figure 3.8 Proportion des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques dans la fraction «Phospholipides» Figure 3.9 Proportion des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques dans la fraction «Triglycérides» Figure 3.10 Longueur de chaines des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques dans la fraction «Triglycérides» xiii

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15 Liste des abréviations 12 HETE 3T3 ADN APCI ATR CER DMEM DMSO EDTA EGF ELSD ESI FDA FID FNHS FSS FTIR GC HDL HPLC HPTLC K K 2 CO 3 Acide 12 hydroxyeicosatétraénoïque 3 day transfer, inoculum 3 x 10 5 cell Acide désoxyribonucléique Atmospheric pressure chemical ionization Attenuated total reflectance Céramide Dulbecco's modified Eagle medium Diméthylsulfoxyde Acide éthylène diamine tétraacétique Facteur de croissance épidermique Evaporative light scattering detector Electrospray ionization Food and Drug Administration Flame ionization detector Frozen normal human skin Frozen skin substitute Fourier transform infrared spectroscopy Chromatographie en phase gazeuse High density lipoprotein High performance liquid chromatography High performance thin layer chromatography Kératine Carbonate de potassium, xv

16 KCl LDL LOEX MAP MCT Chlorure de potassium Low density lipoprotein Laboratoire d'organogénèse expérimentale microtubule associated protein mercury cadmium telluride MRP 8 Myeloid related protein 8 MS Spectrométrie de masse n 3 Oméga 3 n 6 Oméga 6 NHS NPLC PBS PUFA SCID SD SKALP SS SSLs TGF TOF MS UPLC VLDL Normal human skin Normal phase liquid chromatography Phosphate buffered saline Polyinsaturated fatty acids Severe combined immunodeficiency Écart type Skin derived antileukoprotease Skin substitute Skin surface lipids Transforming growth factor Time of flight mass spectrometry Ultra performance liquid chromatography Very low density lipoprotein xvi

17 Remerciements La réalisation de mes travaux de maîtrise s est effectuée au Laboratoire d Organogénèse Expérimentale (LOEX) du Centre hospitalier universitaire de Québec (Hôpital Enfant- Jésus) sous la direction du Dr Roxane Pouliot. Je tiens tout d abord à remercier ma directrice de recherche, le Dr Roxane Pouliot, pour son support tout au long de mes études. Ses conseils, sa grande disponibilité et son écoute ont été grandement appréciés et m ont permis d apprendre et de progresser tout au long de mon cheminement à la maîtrise. Je veux également remercier tous les membres de l équipe de recherche, en particulier Jessica Jean et Isabelle Gendreau pour leur aide et leurs conseils. Merci spécialement à Sarah Dubois Declercq avec qui j ai réalisé la première partie de mon projet. Sa présence et son soutien auront permis de mener à bien ces travaux communs. Je profite de l occasion pour remercier tous les membres du LOEX, en particulier ceux de mon bureau pour leur dynamisme. Merci à François Dominique Scott pour son aide en statistique et à Marie Leroy pour son support lors des analyses en infrarouge. Merci également aux organismes subventionnaires suivants : FQRNT, CRSNG et IRSC ainsi qu à Hydro-Québec pour leur support financier. Finalement, un merci tout particulier à ma famille et à mes proches qui m ont encouragée tout au long de mes études. xvii

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19 Avant-propos Le deuxième chapitre de ce mémoire fait l objet d un article intitulé ATR-FTIR and drug permeation studies of cryopreserved human tissue-engineered skin substitutes for pharmaceutical studies perspective qui sera soumis dans le journal Skin Pharmacology avec Sarah Dubois Declercq et moi-même comme coauteurs principaux en raison d une contribution équivalente à cet article. J ai développé et réalisé la majorité des expériences de ce projet conjointement avec Sarah Dubois Declercq. Les extractions cellulaires des kératinocytes et fibroblastes utilisés pour la production des substituts sains avaient préalablement été effectuées par d anciens membres du groupe de recherche. La production des substituts cutanés a été effectuée avec Sarah Dubois Declercq dans un partage des tâches égal sous la supervision initiale de Jessica Jean. Les analyses d absorption percutanée ont principalement été réalisées par Sarah Dubois Declercq, mais j ai participé au traitement des données avec l aide de celle-ci et de Marielle Robert. J ai réalisé les analyses de spectroscopie infrarouge et j en ai analysé les données. Les analyses statistiques ont été prises en charge par Sarah Dubois Declercq. Finalement, Sarah Dubois Declercq et moi avons rédigé l article sous la supervision du Dr Roxane Pouliot. xix

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21 1. Introduction générale 1

22 1.1. La peau La peau est un épithélium d un poids moyen de 4 kg, d une superficie d environ 2 m 2 et d une épaisseur moyenne de 2 mm (Mélissopoulos & Levacher, 1998; Schaefer & Redelmeier, 1996), ce qui en fait le plus grand et le plus lourd organe du corps humain. Cet organe simple en apparence, mais complexe en réalité, est formé de trois couches : l épiderme, le derme et l hypoderme (Marieb, 2005). La peau joue un rôle crucial à différents niveaux par l action de ses quatre principales fonctions (Gartner & Hiatt, 2007). Figure 1.1 Couches de la peau normale humaine (Tirée de (Gartner & Hiatt, 2007)) 1) Tout d abord, constituant l interface entre l intérieur du corps et le monde extérieur, la peau joue un rôle de protection très important. Elle agit en tant que barrière physique, 2

23 chimique, biologique et immunologique pour contrer les agents pathogènes (Harding, 2004) En tant que barrière, la peau permet aussi de réguler la perte d eau. Différents mécanismes interviennent pour assurer cette fonction de barrière. Parmi ceux-ci se trouvent un système de défense immunitaire basé sur l interaction entre différents types cellulaires (Gartner & Hiatt, 2007; Ovalle & Nahirney, 2008) de même que la présence d une couche acide en surface. Effectivement, la couche cornée est à un ph variant entre 4 et 5,5, ce qui lui confère des propriétés antiseptiques (Choi, et al., 2007). 2) La peau agit également comme thermorégulateur. En effet, elle permet de maintenir la température du corps humain à une température d environ 37 C (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Cette thermorégulation est rendue possible grâce à la présence des poils et des glandes sudoripares (Heath, et al., 2008) de même qu à la contraction et dilatation des vaisseaux sanguins (Eroschenko & di Fiore, 2012). L hypoderme agit également comme couche isolante. 3) Différents récepteurs tactiles et sensoriels se retrouvent dans la peau, ce qui lui confère des propriétés au niveau de la perception. Les récepteurs sensoriels qui s y retrouvent sont des mécanorécepteurs, des thermorécepteurs et des nocicepteurs (Kierszenbaum, et al., 2006). 4) Finalement, la quatrième fonction principale de la peau consiste à métaboliser la vitamine D (Gartner & Hiatt, 2007). En effet, lors de l absorption de rayons ultraviolets par la peau, le cholestérol qui s y retrouve est transformé en vitamine D3. Par la suite, cette dernière sera elle-même modifiée par le foie et les reins en vitamine D active (Heath, et al., 2008) L hypoderme L hypoderme est un tissu adipeux représentant 15 à 20 % du poids corporel. Des extensions de fibres de collagène et de fibres élastiques le relient au derme (Mélissopoulos & 3

24 Levacher, 1998). Il est composé de cellules, les adipocytes, et de tissu conjonctif (Kierszenbaum, et al., 2006). Les adipocytes ont la particularité de pouvoir subir une importante variation de volume en peu de temps lorsqu il y a changement du poids corporel (Mélissopoulos & Levacher, 1998). L hypoderme joue un rôle important comme isolant thermique et amortisseur des chocs extérieurs (Stevens & Lowe, 2005). Il représente par ailleurs la plus grande réserve d énergie de tout le corps humain (Lowe & Anderson, 2014) en emmagasinant les lipides sous forme de triglycérides (phase de captation) pour ensuite les relarguer sous formes d acides gras ou encore de glycérol (lipolyse). L hypoderme constitue également une réserve d hormones stéroïdes et est un site important dans la transformation des androgènes en oestrogènes (Mélissopoulos & Levacher, 1998) Le derme Le derme est un tissu conjonctif relié à l épiderme par la jonction dermo-épidermique. Il se divise en deux zones, soit le derme papillaire, d où ont lieu les échanges avec l épiderme, et la couche réticulaire (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Le derme est principalement constitué de fibroblastes qui se trouvent dans une matrice extracellulaire qu ils produisent eux-mêmes. Effectivement, les fibroblastes sont responsables de la synthèse du collagène, de l élastine et de glycoprotéines de structure dont est constituée la matrice. Le derme contient également un réseau de capillaires qui alimente les trois couches cutanées en nutriments et en oxygène et qui élimine les déchets qui y sont produits (Mélissopoulos & Levacher, 1998). On retrouve également dans le derme les glandes sébacées et sudoripares, les cellules du système immunitaire (Jean, 2010; Marieb, 2005; Mélissopoulos & Levacher, 1998) de même que des fibres nerveuses et des récepteurs sensoriels tels des mécanorécepteurs, des thermorécepteurs et des nocicepteurs (Kierszenbaum, et al., 2006) L épiderme L épiderme constitue la couche externe de la peau et joue un rôle important dans la formation d une barrière physique, chimique, biologique et immunologique contre les agents extérieurs (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Cette structure est stratifiée et non 4

25 vascularisée. Elle est composé de kératinocytes se subdivisant en quatre ou cinq couches (Marieb, 2005) soit la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse, la couche claire, présente uniquement au niveau de la plantes des pieds et de la paume des mains, et la couche cornée. Son épaisseur varie entre 0,05 mm et 1,5 mm. Peau mince Peau épaisse Figure 1.2 Couches de l épiderme de la peau normale humaine (Tirée de (Ash, et al., 2012)) L épiderme est composé à 80 % de kératinocytes (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Ces cellules subissent un processus de différenciation cellulaire lors de leur migration au travers des différentes couches de l épiderme jusqu à la surface de ce dernier (Gartner & Hiatt, 2007; Junqueira & Carneiro, 2005; Ovalle & Nahirney, 2008). Ce faisant, ils synthétisent différentes protéines de la famille des kératines. Ce sont des protéines qui contribuent entre autres au rôle de barrière (Stevens & Lowe, 2005). L épiderme est donc en constant renouvellement. De la couche basale à la couche cornée, les kératinocytes changent d aspect. Dans la couche basale, ils sont de forme cylindrique et perpendiculaires aux papilles du derme (Mélissopoulos & Levacher, 1998). La différenciation cellulaire commence dans cette couche, alors qu un kératinocyte se divise en deux cellules; une 5

26 restera dans la couche basale où elle continuera à se différencier et une migrera vers les couches supérieures. On retrouve dans cette couche les kératines de type 5 et 14 (Blumenberg & Tomic-Canic, 1997). Les kératinocytes situés dans la 2 e couche, soit la couche épineuse, sont de forme polyédrique avec un noyau sphérique (Wysocki, 1999). Il y a présence de desmosomes rattachant les kératinocytes entre eux (Eckert, 1989). On retrouve également dans cette couche les kératines de type 1 et 10 (Blumenberg & Tomic- Canic, 1997). Au niveau de la couche granuleuse, les kératinocytes sont d apparence fusiforme (Mélissopoulos & Levacher, 1998), alors qu au niveau de la couche claire, ils présentent une forme aplatie et ont un noyau très petit, voire absent (Wysocki, 1999). Finalement, dans la couche cornée, les kératinocytes n ont plus de noyau ni d organites cytoplasmiques. Rendus en surface, ils se détachent afin d être remplacés par de nouvelles cellules. Ce processus porte le nom de desquamation (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Figure 1.3 Différenciation des kératinocytes au travers des différentes couches de l épiderme (Tirée de (Schaefer & Redelmeier, 1996)) 6

27 L épiderme, en plus des kératinocytes, contient également des mélanocytes. La mélanine, que synthétisent ces cellules, a la propriété d absorber les rayons ultraviolets du soleil permettant ainsi la protection de l ADN cellulaire (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Les cellules de Langerhans et les cellules de Merkel sont deux autres types cellulaires retrouvés dans l épiderme. Alors que les premières sont impliquées dans le système immunitaire (Kierszenbaum, et al., 2006; Mélissopoulos & Levacher, 1998), les secondes le sont au niveau des récepteurs sensoriels du toucher (Wysocki, 1999). L épiderme contient également des terminaisons nerveuses reliées au derme (Stellman & Dufresne, 2000) La couche cornée La couche cornée étant directement en contact avec le monde extérieur, elle est la principale actrice dans la fonction de barrière physique (Mélissopoulos & Levacher, 1998). Elle est constituée de cornéocytes, c est-à-dire de kératinocytes complètement différenciés, imbriqués dans une matrice intercellulaire de lipides (Walters, 2002). Cette organisation est souvent représentée par l illustration de briques dans du mortier. Grâce à leur organisation spécifique, ces différents lipides interviennent en tant que barrière par le biais de plusieurs mécanismes. Par conséquent, ils jouent un rôle important au niveau de la perméabilité de la peau (Bernard, et al., 2007; Duque Fernandez, 2008). 7

28 Figure 1.4 Représentation «Briques dans le mortier» des cornéocytes de la couche cornée (Tirée de (Harding, 2004) et modifiée par Jessica Jean (Jean, 2010)) 1.2. Le psoriasis Le psoriasis est une dermatose érythémato-squameuse qui est auto-immune et non contagieuse. Il s agit d une maladie chronique touchant 3 à 5% de la population. Comme son nom l indique, cette dermatose est reconnaissable par des plaques rouges (érythème) recouvertes de squames. Elle peut se présenter sous cinq formes différentes, soit le psoriasis en plaques, en gouttes, inversé, pustuleux ou érythrodermique (Nicolas & Thivolet, 1997). Le psoriasis en plaques est le plus commun, représentant environ 80% des cas (Dubertret, 2004). 8

29 Psoriasis en plaques Psoriasis en gouttes Psoriasis pustuleux Psoriasis érythrodermique Psoriasis inversé Figure 1.5 Les cinq différentes formes de psoriasis (Tirée de (Thivolet & Schmitt, 1993)) 9

30 Histologie Le psoriasis est caractérisé par une augmentation de la prolifération des kératinocytes et par une maturation incomplète de ces derniers. Effectivement, au lieu de prendre entre 28 et 44 jours, leur processus de différenciation au travers des différentes couches de l épiderme ne prend qu autours de 4 jours (Federman, et al., 1999). Le derme et l épiderme des lésions psoriasiques sont également infiltrés par des cellules du système immunitaire. En outre, il y a augmentation de l angiogénèse de même que présence d anomalies au niveau de la composition protéinique, certaines protéines étant sur- ou sous-exprimées. Ces anomalies peuvent être regroupées en trois catégories, soit celles reliées à la différenciation ou à l hyperprolifération des kératinocytes et à l infiltration des cellules du système immunitaire. Au niveau des anomalies protéiniques reliées à la différenciation des kératinocytes, la filaggrine est un marqueur qui est sous-exprimé dans une peau psoriasique. Elle se retrouve habituellement dans la couche granuleuse, qui est absente dans une peau lésionnelle (Bernard, et al., 1988). Les marqueurs de différenciation terminale K1 et K10 sont également sous-exprimés (Mils, et al., 1994). À l inverse, il y a surexpression de l involucrine, une protéine impliquée dans la stabilisation de l enveloppe kératinisée (Ishida-Yamamoto & Iizuka, 1995). C est le cas également du marqueur de différenciation MRP-8, impliqué dans la formation de liens avec le Ca 2+ et dans la réorganisation du cytosquelette, et du SKALP, impliqué dans la dégradation de l élastine (Nagpal, et al., 1996). Différentes protéines présentes dans les peaux psoriasiques sont aussi impliquées dans l hyperprolifération des kératinocytes. Il y a ainsi une augmentation du nombre de récepteurs du facteur épidermique de croissance (EGF) dans les couches supérieures d un épiderme psoriasique par rapport à celui d une peau saine (Nanney, et al., 1986). Le TGF-α est également augmenté (Turbitt, et al., 1990), tout comme l activité de la kinase MAP, impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire (Dimon-Gadal, et al., 1998). Différents marqueurs de la kératine sont également affectés dans une peau lésionnelle. 10

31 C est le cas entre autres des K5, K6, K14 et K16 qui sont surexprimées (Thewes, et al., 1991). Une peau psoriasique présente également de nombreuses dérégulations au niveau des interleukines, un groupe de cytokines particulièrement important au niveau du système immunitaire. En effet, les interleukines 8, 13, 17, 22 et 23 sont, par exemple, surexprimées, alors que l interleukine 10 est, au contraire, sous-exprimée dans la peau psoriasique (Menter & Stoff, 2010) Étiologie du psoriasis Les causes exactes du psoriasis sont à ce jour inconnues. Il est toutefois généralement admis que des facteurs immunologiques, environnementaux et génétiques entreraient en jeu (Nicolas & Thivolet, 1997). Une fois le processus de la maladie enclenché, il en résulte une boucle impliquant la réponse immunitaire du système et le stress subi par les kératinocytes. En effet, chez une personne à la peau saine, suite à une agression de l épiderme, la réponse inflammatoire rapide poussera les cellules immunitaires à produire des facteurs de croissance afin de favoriser la division des kératinocytes et ainsi réparer rapidement la blessure. L inflammation disparaitra ensuite. Dans le cas d une peau psoriasique, l inflammation perdure en raison d une réponse exagérée du système immunitaire (Ainsworth, 2012). La réponse n est toutefois pas constante puisque la maladie évolue en phases de poussées de plaques suivies par des phases de rémission. Le psoriasis se divise en trois niveaux de gravité selon le pourcentage de peau atteinte : la forme légère (moins de 2 %), la forme modérée (2 à 10 %) et la forme grave (plus de 10 %) (Lebwohl, et al., 2004). 11

32 Figure 1.6 La boucle inflammatoire du psoriasis (Tirée de (Ainsworth, 2012)) 1.3. Analyse des lipides par chromatographie L isolation des lipides d un échantillon naturel tel que la peau se fait principalement par extraction avec des solvants organiques. Différentes combinaisons peuvent être utilisées afin de limiter les pertes et la dénaturation des lipides au cours du processus. Des solvants neutres, acides ou basiques peuvent être employés, chacun présentant certains inconvénients (Myher & Kuksis, 1995). Alors que les solvants neutres résultent en un faible recouvrement des phospholipides acides, des lysophospholipides et des acides gras nonestérifiés, les solvants acides peuvent générer des lysophospholipides lorsque l échantillon contient initialement des plasmalogènes. L emploi de solvants alcalins, d un autre côté, engendre un risque de désacyler certains composés. Une fois l isolation des lipides effectuée, des analyses par chromatographie peuvent être effectuées. Cette technique est une méthode analytique permettant de séparer physiquement des espèces chimiques. Ces dernières sont mises en solution dans une phase mobile qui passe au travers d une phase stationnaire. Les différentes molécules sont éluées à un rythme 12

33 plus ou moins rapide en fonction de leurs propriétés et de celles des phases mobiles et stationnaires. Il existe plusieurs types de techniques chromatographiques qui peuvent être classées en fonction de leur phase mobile et du mécanisme de séparation entrant en jeu. Les lipides de la peau saine et de la peau psoriasique ont été analysés par différents groupes de recherche à l aide de méthodes chromatographiques variées. Plusieurs études utilisent la chromatographie sur couche mince afin de séparer ou d analyser différentes classes de lipides présentes dans la peau (Farwanah, et al., 2002; Imokawa, et al., 1989; Melnik, et al., 1989; Ponec & Weerheim, 1990; Weerheim & Ponec, 2001; Wertz, et al., 1985). Afin de quantifier les lipides, un densitomètre peut être utilisé (Motta, et al., 1993). La chromatographie sur couche mince est toutefois une méthode encombrante, nécessitant beaucoup de temps et une concentration de molécules assez spécifique si l on veut obtenir une détection nette et optimale. De plus, la quantité maximale de molécules pouvant être séparée en une analyse est limitée (Gildenast & Lasch, 1997). Afin de palier à certains de ces inconvénients, la chromatographie sur couche mince peut aussi être utilisée en précurseur d une autre méthode chromatographique. Cette technique d analyse implique l utilisation d une plaque de silice sur laquelle les extraits de lipides sont mis à éluer. La plaque est ensuite grattée et hydrolisée, ce qui permet ensuite l analyse par chromatographie en phase gazeuse ou liquide. Alors que le chromatographe gazeux est principalement couplé à un MS (Gonzalez-Illan, et al., 2011; Michael-Jubeli, et al., 2011; Pons, et al., 2002), la chromatographie liquide, quant à elle, a aussi été utilisée couplée à divers autres détecteurs. On retrouve ainsi par exemple des analyses par ESI-MS, par APCI-MS (Farwanah, et al., 2002) et par ELSD (Christie, 1985). Par ailleurs, certains lipides ont été analysés spécifiquement dans différentes études. C est le cas des céramides de la couche cornée dont la caractérisation a entre autres été effectuée par NPLC-ESI-MS, ce qui a permis d identifier 342 céramides différents et de découvrir une nouvelle classe de céramides présents dans la peau, le CER[ADS] en plus des 10 déjà connus (Masukawa, et al., 2008). Par ailleurs, les acides gras libres ont été analysés spécifiquement par GC-MS et GC-FID (Norlen, et al., 1998). Plus récemment, l UPLC en phase inverse a commencé à être utilisé pour les analyses lipidiques couplé, par exemple, à 13

34 un TOF-MS (Rainville, et al., 2007). Son utilisation permet une séparation meilleure et plus rapide qu avec un HPLC standard. Il est à noter que pour les analyses en chromatographie liquide, la phase inverse est à privilégier au dépend de la phase normale puisqu elle offre une meilleure compatibilité avec les échantillons biologiques et lipophiles (Rainville, et al., 2007) Les lipides de la peau saine Les lipides de surface La peau est un site riche en lipides ayant des fonctions diversifiées. Elle est recouverte en surface par une couche de lipides (SSLs) sous forme d un film hydrolipidique. Ces SSLs sont composés d un mélange de lipides sébacés et épidermiques incluant entre autres des triglycérides, des esters et des squalènes. La fraction acide gras des SSLs est riche en acides gras à longues chaînes, mais pauvre en polyinsaturés (PUFAs). Ces lipides de surface possèdent entre autres des propriétés antimicrobiennes (De Luca & Valacchi, 2010) Les lipides épidermiques La composition lipidique varie au travers des différentes couches de l épiderme. Tout au long du processus de kératinisation, celle-ci change, passant d une composition contenant davantage de lipides polaires à une composition comportant majoritairement des lipides neutres. Ce changement de composition lipidique n est toutefois pas linéaire, certains lipides augmentant en concentration dans une couche supérieure pour diminuer par la suite (Lampe, et al., 1983). 14

35 Stratification des lipides dans l épiderme humain Masse des lipides (%) Phospholipides Sulfate de cholestérol Acides gras libres Sphingolipides Stérols libres Lipides non polaires (Stérols, cires, squalènes, n-alcanes) SB/SS SG SC Couches épidermiques Figure 1.7 Variation de la concentration de certains lipides au travers des couches de l épiderme, en % massique (Modifiée de (Lampe, et al., 1983)) La couche basale de l épiderme est constituée principalement de phospholipides, au deux tiers en poids, ainsi que de cholestérol, de triacylglycérol, d acides gras libres et de glucosylcéramides (Yardley, 1990). Alors qu il y a très peu de sphingolipides dans les premières couches de l épiderme, ces derniers représentent 20 % des lipides de la couche 15

36 cornée. À l opposé, la quantité de glycolipides diminue à mesure que l on monte dans les différentes couches de l épiderme, pour devenir pratiquement inexistante dans la couche cornée. Les squalènes sont distribués dans toutes les couches de l épiderme, tout comme le sulfate de cholestérol. Il y a toutefois une augmentation de la présence de ce dernier dans la couche granuleuse (Lampe, et al., 1983). Les acides gras retrouvés dans l épiderme sont soit sous forme libre, soit liés dans les triglycérides, les phospholipides, les glycosylcéramides et les céramides (Proksch, et al., 2008) Lipides polaires Sulfate de cholestérol Lipides neutres Glucosylcéramides Céramides Masse (%) Stratum basale Stratum granulosum Stratum corneum Figure 1.8 Composition lipidique de l épiderme dans ses différentes couches, en % massique (Modifiée de (Lampe, et al., 1983)) 16

37 Les lipides de la couche cornée Les lipides de la couche cornée se présentent sous la forme d une bicouche lipidique bien organisée en phase lamellaire. Ils représentent environ 15 % en poids de la masse sèche totale de la couche cornée (Harding, 2004) et 20 % de son volume. Ils sont composés principalement entre 45 à 50 % en masse de céramides, 25 % de cholestérol et 10 à 15 % d acides gras sous forme libre, pour une composition environ équimolaire de ces trois classes de lipides (Tfayli, et al., 2013). La composition lipidique exacte de la couche cornée varie toutefois selon différents facteurs. Parmi ceux-ci se retrouvent l âge, le sexe, la localisation anatomique et les saisons. Ainsi, avec l âge a lieu une diminution de la quantité totale de lipides. Il y a également une baisse de la quantité lipidique en hiver par rapport à l été ou au printemps (Rogers, et al., 1996). Il est à noter que les triglycérides, les acides gras saturés à chaînes courtes et les acides gras insaturés retrouvés dans la couche cornée proviendraient de contamination du sérum et n auraient, par conséquent, aucun rôle connu dans la fonction barrière de la peau (Harding, 2004). Les lipides intercellulaires de la couche cornée proviennent de lipides précurseurs présents dans les corps lamellaires au niveau des couches épineuses et granuleuses. Ces corps lamellaires, d une dimension de 0,2 x 0,3 mm, forment une membrane bicouche contenant différents lipides : des phospholipides, des glucosylcéramides, des sphingomyélines et du cholestérol. Ils contiennent également des enzymes tels que des hydrolases et protéases lipidiques, des lipases neutres et des cathepsines ainsi que des peptides antimicrobiens (Elias & Feingold, 2013). Les lipides précurseurs sont assemblés dans les corps lamellaires en disques lamellaires au niveau des couches épineuse et granuleuse. Les corps poursuivent ensuite leur ascension pour atteindre l interface entre la couche granuleuse et la couche cornée (Downing, 1992). Ils fusionnent alors avec la membrane cellulaire et sécrètent leur contenu lipidique dans les espaces intercellulaires (Madison, 2003). Les lipides sont d abord déposés en feuillets à double couches lipidiques qui s enligneront par la suite sous l action de la phospholipase A2. La présence de l enzyme β-glucocérébrosidase permettra alors la fusion entre les membranes afin de former des rangées uniformes de feuillets lipidiques (Downing, 1992; Schaefer & Redelmeier, 1996). 17

38 Figure 1.9 Formation des feuillets lipidiques bilamellaires (Tirée de (Downing, 1992)) L action de différents enzymes présents dans l épiderme permet la formation de lipides spécifiques. Ainsi, la formation des céramides provient de l action de la β- glucocérébrosidase sur les glucosylcéramides et de la sphingomyélinase sur les sphingomyélines alors que le sulfate de cholestérol est métabolisé par les stéroïdes sulfatase en cholestérol. Les phospholipases, quant à elles, transforment les phospholipides en acides gras libres et en glycérol (Feingold, 2007). Parmi les phospholipases impliquées, une d intérêt, comme vu précédemment, est la phospholipase A2, présente en plusieurs isoformes. L inhibition de cet enzyme induit entre autres des malformations structurales au 18

39 niveau de la membrane des lipides extracellulaires de même qu au niveau de la régulation de la barrière cutanée (MaoQiang, et al., 1996). Figure 1.10 Formation des feuillets lipidiques (Tirée de (Schaefer & Redelmeier, 1996). La première flèche indique l action de la phospholipase A2 et la 2 e flèche, celle de la cérébrosidase) Par ailleurs, l action des différents enzymes, en plus de permettre la formation de lipides spécifiques, a d autres fonctions. Ainsi, elle permet de réguler la perte d eau par le biais de la formation de glycérol lors de la transformation des phospholipides par les phospholipases. Ce processus aide à maintenir l hydratation de la couche cornée. En outre, les acides gras libres formés lors de l action de ces mêmes phospholipases ont un impact sur l acidité de la couche cornée (Fluhr, et al., 2001). Le maintien du ph à un certain niveau selon la profondeur dans les couches épidermiques est très important. Ainsi, une augmentation de ce dernier induira entre autres une hausse de l activité des protéases, causant une augmentation de la desquamation des cornéocytes et une diminution de la fonction barrière du stratum corneum (Hachem, et al., 2003; Hachem, et al., 2005). L action de la β-glucocérébrosidase et de la phospholipase A2 est également dépendante du ph (Schaefer & Redelmeier, 1996). L organisation des lipides en feuillets lamellaires joue un rôle crucial dans la fonction barrière. Les lipides de la couche cornée humaine et animale ont, par conséquent, été investigués par différents groupes de recherche avec des méthodes variées telles que la diffraction par rayons X, la calorimétrie différentielle à balayage, la spectroscopie par 19

40 résonnance magnétique, la spectroscopie Raman et la spectroscopie infrarouge (Bernard, et al., 2007) Les céramides Les céramides de la couche cornée jouent un rôle important au niveau de la stabilité des bicouches lipidiques et de la fonction barrière de la peau face à la perte d eau (Coderch, et al., 2003). Certains céramides seraient également impliqués au niveau de la régulation de la kératinisation (Masukawa, et al., 2008). Ils ont également différents rôles physiologiques dans la transduction de signaux et la régulation cellulaire au niveau de l apoptose, dans l arrêt de la croissance cellulaire, dans la différenciation, dans la sénescence et dans les réponses immunitaires (Masukawa, et al., 2008). Les acylcéramides auraient un rôle particulièrement important au niveau de fonctions liées à l organisation membranaire dans la couche cornée alors que les acylglucosylcéramides seraient plus impliquées au niveau de fonctions liées à l empilement membranaire dans les corps lamellaires (Motta, et al., 1994). Une diminution de la quantité totale de céramides présents de même qu une modification au niveau de la proportion des différents types de céramides sont d ailleurs caractéristiques de plusieurs maladies de peau (Coderch, et al., 2003). Les céramides sont constitués d un groupement sphingosine lié par une liaison amide à un acide gras qui peut être hydroxylé ou non. Quatre groupements sphingosines sont retrouvés : sphingosine (S), dihydrosphingosine (ds), 6-hydroxysphingosine (H) et phyto-sphingosine (P). Pour ce qui est des acides gras, il y a trois possibilités : un acide gras non hydroxylé (N), un acide gras α-hydroxylé (A), un acide gras estérifié ω-hydroxylé (EO). Les céramides sont classés en fonction des groupements les constituant, ce qui donne 12 classes possibles. Les longueurs des chaines des groupements sont toutefois variables, laissant place à un éventail beaucoup plus large de céramides. À ce jour, 11 classes de céramides ont été observées dans le stratum corneum, seulement la classe des CER [EOdS] ne l ayant pas été (Masukawa, et al., 2008). 20

41 Figure 1.11 Les différentes classes de céramides (Tirée de (Masukawa, et al., 2008)) Dans la majorité des céramides, les chaines sont longues (24 à 26 carbones) et saturées avec une petite tête polaire (Bouwstra, et al., 2003). Cela résulte en des lipides ayant un haut point de fusion et se trouvant dans un état ordonné solide cristallin à la température du corps humain. En effet, conjointement avec les acides gras libres, le cholestérol et le sulfate de cholestérol, les céramides forment une structure bicouche bien organisée dans un domaine orthorhombique et hexagonal (Coderch, et al., 2003; Mendelsohn, et al., 2006). Une variation de certains facteurs du système tels que la température et la pression peut engendrer une transition de phase. Le système devient alors dans un état gel ou encore liquide cristallin, phases dans lesquelles il y a présence de lipides en conformation gauche et dans lesquelles ces derniers sont par conséquent dans un arrangement davantage désorganisé (Ongpipattanakul, et al., 1994). Cette température de transition est fortement 21

42 influencée par la composition lipidique et est autour de 75 C pour la peau normale humaine (Bernard, et al., 2007). La production des céramides dans la couche cornée peut se faire par deux voies selon les différentes classes. La première voie, qui est catalysée par la β-glucocérébrosidase et la sphingomyélinase, implique la dégradation des glucosylcéramides et des sphingomyélines. La seconde est catalysée par la sérine palmitoyltransférase et la céramide synthase. Elle implique, quant à elle, la formation de céramides à partir de l acide palmitique et de la sérine (Choi & Maibach, 2005). 22

43 Sphingosine Synthase dihydrocéramide Dihydrocéramide Déhydrogénase dihydrocéramide Céramide Synthase sphingomyéline P DG UDP-Glc UDP Synthase Glucosylcéramide Sphingomyéline Glucosylcéramide Figure 1.12 Voies de formation des céramides (Modifiée de (Schaefer & Redelmeier, 1996)) Les stérols Le cholestérol est le stérol présent majoritairement dans la couche cornée, représentant 27 % des lipides de cette dernière. Celle-ci contient également du sulfate de cholestérol (3 %) de même que des esters de cholestérol (2 à 5 %) (Chilcott & Price, 2008). Le cholestérol est synthétisé majoritairement dans l épiderme à partir d acétate (Proksch, et al., 2008) et serait orienté perpendiculairement à la surface bicouche membranaire (Khelashvili, et al., 2010). Il joue un rôle important au niveau de la fluidité de la membrane (Madison, 2003). Le sulfate de cholestérol, quant à lui, est impliqué dans la cohésion des cornéocytes et dans la desquamation (Thivolet & Schmitt, 1993). 23

44 H H H H HO Figure 1.13 Structure du cholestérol Les acides gras Les acides gras libres présents dans la matrice lipidique proviennent de l hydrolyse des phospholipides (Fluhr, et al., 2001). En plus de jouer un rôle dans la régulation de la synthèse du cholestérol et de son transport, ils permettent de moduler les structures membranaires (Mélissopoulos & Levacher, 1998; Schaefer & Redelmeier, 1996). Ils sont majoritairement saturés, avec un nombre de carbones allant de 14 à 28 (Chew & Maibach, 2006), ceux avec une chaine de 22 et 24 carbones étant les plus fréquents. La quantité d acides gras libres dans l épiderme augmente de la couche basale à la couche cornée. Les acides gras n-6 sont ceux présents en plus grand nombre, les acides 18 : 2 (n-6), 18 : 3 (n-6) et 18 : 4 (n-6) représentant 70 % des acides gras cutanés. Ces acides gras sont particulièrement importants : les acides gras n-6 sont précurseurs de l acide arachidonique, qui est impliqué dans les phénomènes inflammatoires en étant transformé en prostaglandines, alors que les acides gras n-3 sont impliqués dans la formation de l acide eicosapentaénoïque, impliqué lui aussi dans l inflammation par sa métabolisation en acide 15-hydroxy-eicosapentaénoïque. Les acides gras oméga-3 et oméga-6 font d ailleurs partie des acides gras essentiels. Ces derniers ont d importantes fonctions au niveau cutané, tant au niveau de la modulation de la structure membranaire et de l imperméabilité de la peau 24

45 qu au niveau de la régulation du transport et de la synthèse du cholestérol (Thivolet & Schmitt, 1993) Les lipides de la peau psoriasique L étude par microscopie électronique de la couche cornée de peau psoriasique a montré entre autres la présence d espaces intercellulaires plus grands, de jonctions intercellulaires moins résistantes et d une adhésion intracellulaire moins efficace. Ces altérations pourraient être causées entre autres par une homéostase anormale du cholestérol (Pietrzak, et al., 2006). Chez les mammifères, le cholestérol est effectivement un régulateur essentiel de l organisation des lipides (Maxfield & Tabas, 2005). Il est d ailleurs admis dans la littérature que les personnes atteintes de psoriasis souffrent d un dysfonctionnement au niveau du métabolisme des lipides. Une désorganisation au niveau de ces derniers peut engendrer de graves conséquences en affectant, par exemple, différentes fonctions cellulaires telles que les signaux de transduction (Maxfield & Tabas, 2005). Au cours des dernières années, les différences tant au niveau des lipides de surface que des lipides de la couche cornée, épidermiques et du sérum ont été investiguées chez des sujets en santé et atteints de psoriasis. Il n est toutefois pas encore clair si les anomalies observées au niveau lipidique chez ces derniers sont causées par le psoriasis ou si, au contraire, elles sont des précurseurs de la maladie (Pietrzak, et al., 2010) Les lipides du sérum Tout d abord, la composition lipidique au niveau du sérum a été évaluée chez des individus sains et des individus souffrant de psoriasis. Les différentes études sont parfois contradictoires en raison possiblement des changements rapides pouvant survenir dans la composition du sérum et des effets liés entre autres à l alimentation, aux saisons, à l origine ethniques et aux hormones. Il ressort toutefois de façon générale une augmentation significative au niveau du cholestérol total (Akhyani, et al., 2007; Mallbris, et al., 2006; Rocha-Pereira, et al., 2001; Kural, et al., 2003) et des triglycérides (Akhyani, et al., 2007; 25

46 Pietrzak, et al., 2006; Rocha-Pereira, et al., 2001; Vahlquist, et al., 1987; Vanizor Kural, et al., 2003). Les lipoprotéines transportant le cholestérol seraient également affectées, la quantité de lipoprotéines de très basses (VLDL) et de basses densités (LDL) étant augmentée (Akhyani, et al., 2007; Pietrzak, et al., 2006; Rocha-Pereira, et al., 2001; Vahlquist, et al., 1985; Vahlquist, et al., 1987; Vanizor Kural, et al., 2003) alors que la quantité des lipoprotéines de haute densité (HDL) est diminuée (Pietrzak, et al., 2006; Rocha-Pereira, et al., 2001; Vahlquist, et al., 1985). Certaines études n ont toutefois pas obtenu de différences tant au niveau de la quantité des LDL et des VLDL que des HDL (Akhyani, et al., 2007; Farshchian, et al., 2007). Une réduction de la quantité d acide linoléique et α-linolénique ainsi qu une augmentation de la quantité d acide dihomo-γlinolénique au niveau des chaînes acides gras des triglycérides, des phospholipides et des esters de cholestérol a aussi été observée (Vahlquist, et al., 1985). Par ailleurs, les différences observées entre le sérum des patients sains et des patients atteints de psoriasis seraient plus prononcées lorsque le psoriasis est présent sous une forme sévère (Akhyani, et al., 2007; Vahlquist, et al., 1985) Les lipides de l épiderme et du stratum corneum Au niveau des lipides épidermiques, les études sont parfois contradictoires. Une étude a permis ainsi d observer une augmentation du pourcentage en poids des céramides entre des échantillons de peau saine et psoriasique, passant de 18,8 % à 24,9 % (Motta, et al., 1993). Le cholestérol est aussi augmenté (10,5 % comparé à 16,2 %) de même que les squalènes (1,9 % comparé à 10 %). À l opposé, il y a une réduction de la quantité de triglycérides (33,4 % comparé à 23,4 %) et d acides gras libres (23,1 % comparé à 16,2 %). Cette diminution pourrait être expliquée par le renouvellement plus rapide des kératinocytes lésionnels impliquant un processus oxydo-dépendant nécessitant de l énergie. Il y aurait donc une consommation accrue de ces lipides. D autres études montrent également une augmentation de la quantité totale des lipides et du cholestérol, mais font état, à l opposé d une augmentation des triglycérides. Du côté des phospholipides, une étude montre une diminution de ces derniers alors que d autres font état d une augmentation (Pietrzak, et al., 2010). Les longueurs de chaines des acides gras seraient aussi plus courtes (Khyshiktuyev, 26

47 et al., 2008) dans les peaux psoriasiques et la fraction d acides gras estérifiés serait moins importante (Fortinskaia, et al., 1996). La présence d anomalies au niveau des céramides du stratum corneum est, quant à elle, moins controversée, certains de ses effets ayant été clairement observés (Motta, et al., 1994). Il est effectivement connu qu il y a une augmentation de la perte d eau transépidermique au niveau des plaques psoriasiques. La peau se retrouve alors dans un état de sous-hydratation. Ce phénomène serait relié entre autres à des perturbations au niveau des lipides, ces derniers étant impliqués au niveau de la rétention d eau. Plus spécifiquement, les longues chaines N-acyl saturées des acides gras des céramides y joueraient un rôle particulièrement important. Or, il a été montré que, dans la peau psoriasique lésionnelle, il y a une modification au niveau de la composition des céramides. Ainsi, il y a une augmentation des céramides avec le groupement phytosphingosine. De même, certains céramides ayant le groupement spingosine sont également augmentés alors que d autres avec ce même groupement, dont le CER[EOS], subissent une diminution. La diminution de ce dernier serait particulièrement problématique puisque sa présence serait cruciale pour la formation des couches bilamellaires (Motta, et al., 1993) L absorption percutanée L absorption percutanée est une méthode permettant de mesurer quantitativement le passage d une molécule au travers des différentes couches de la peau jusqu à atteindre le système sanguin, qui distribuera la molécule au travers du corps humain. Effectivement, la peau, malgré la présence de la couche cornée, n est pas imperméable. Pratiquement toutes les substances peuvent la traverser, de façon plus ou moins rapide en fonction de différents facteurs (Mélissopoulos & Levacher, 1998). 27

48 Facteurs influençant la perméabilité de la peau Les facteurs influençant la perméabilité de la peau peuvent être regroupés en deux catégories : les facteurs biologiques et les facteurs physicochimiques. Les premiers reflètent les variations interindividuelles au niveau cutané. Parmi ceux-ci se retrouvent les caractéristiques de la peau, soit entre autres l épaisseur et l hydratation de sa couche cornée, sa température et son flux sanguin Les facteurs biologiques Plus le stratum corneum d une peau saine est épais, moins celle-ci sera perméable. De même, un renouvellement rapide de cette couche épidermique permet un ralentissement de l absorption au travers de la peau en ne permettant pas aux principes actifs de s y accumuler (Fernandez, 2008). À l opposé, une augmentation de la température favorise l absorption percutanée (Chang & Riviere, 1991) tout comme le fait une augmentation du flux sanguin. Effectivement, un flux sanguin plus élevé signifie que les principes actifs sont éliminés plus rapidement du derme. Le gradient de concentration dans la peau est donc plus élevé, ce qui favorise la diffusion au travers de celle-ci (Barry, 1983). Une bonne hydratation du stratum corneum permet également de favoriser l absorption percutanée (Blank, 1952). Les caractéristiques de la personne elle-même telles que son âge et origine ethnique font également partie des facteurs biologiques. De fait, une personne plus jeune aura tendance à avoir une peau plus perméable qu une personne plus âgée (Feldmann & Maibach, 1970). De même, une peau noire sera généralement moins perméable qu une peau caucasienne (Drill, et al., 1980). Il est à noter que le sexe de la personne ne semble pas avoir d influence sur la perméabilité de la peau (McCormick & Abdelrahman, 1991). 28

49 Les facteurs physicochimiques Les facteurs physicochimiques, quant à eux, sont reliés à la formulation des principes actifs. Ils incluent entre autres certaines propriétés de ces derniers de même que le ph et la nature de la formulation. Le poids moléculaire du principe actif utilisé a ainsi de l influence sur la perméabilité. En effet, il doit être inférieur à daltons pour que la molécule puisse être absorbée par la peau. Un poids inférieur à 600 daltons favorisera en outre une plus grande diffusion transcutanée (Barry, 2004). Le caractère lipophile de la molécule a également de l importance puisque le stratum corneum ne permet principalement que l absorption des molécules amphiphiles ou moyennement lipophiles (Fernandez, 2008). Le pka du principe actif, combiné au ph cutané, influencera également la perméabilité. En effet, de ces derniers dépendra le pourcentage de la molécule présente sous forme ionisée, une forme qui semble se distribuer moins facilement, diminuant ainsi l absorption percutanée (Croutham, et al., 1971; Lopez, et al., 1996). La formulation du principe actif influencera également la perméabilité. En effet, si les excipients ont un ph acide, cette dernière sera réduite. À l inverse, la présence dans la formulation de certaines molécules telles que l éthanol et le diméthylsulfoxide aura l effet opposé (Fernandez, 2008) Les voies de passage Le passage des molécules au travers de la peau peut s effectuer par deux voies différentes : la voie transépidermique et la voie par les annexes cutanées. La première voie se sousdivise en deux types de passage, soit le passage transcellulaire et le passage intercellulaire. Le passage transcellulaire implique le passage de la molécule au travers des cornéocytes, en alternance entre des structures lipophiles et hydrophiles alors que, dans le passage intercellulaire, la molécule diffuse entre les cornéocytes (Potts & Francoeur, 1991; Schaefer & Redelmeier, 1996). La voie par les annexes cutanées, quant à elle, est caractérisée par le passage des molécules soit par les follicules pilo-sébacés, soit par les glandes sudoripares (Scheuple & Blank, 1973). Le premier est majoritairement employé par les grosses molécules ayant un groupement polaire (Scheuple, 1967) alors que le deuxième l est par certains composés hydrophiles ayant un petit poids moléculaire de même que par des 29

50 électrolytes, ces derniers diffusant dans le liquide aqueux des conduits sudoripares (Pinnagoda, et al., 1990). Figure 1.14 Les voies de passage au travers de la couche cornée (Tirée de (Schaefer & Redelmeier, 1996)) Le flux L absorption percutanée peut être caractérisée par le calcul du flux, c est-à-dire la quantité de la molécule étudiée qui est diffusée par unité de surface de couche cornée et par unité de temps. Il est calculé à l aide de la formule suivante : J Q S t où J est le flux en μg.cm -2.h -1, Q est la quantité de la molécule absorbée en μg, S est l aire de la couche cornée en cm 2 et t est le temps de contact de la substance avec la peau en h. Le graphique du flux en fonction de la concentration de la molécule donne une droite dont la pente correspond au coefficient de perméabilité (Kp) qui est caractéristique de la molécule étudiée. Ce dernier est indépendant de la concentration, mais dépend d autres facteurs tels 30

51 que l épaisseur de la peau (e) et des coefficients de partage (Km) et de diffusion (D) selon l équation suivante (Mélissopoulos & Levacher, 1998; Schaefer & Redelmeier, 1996). Kp Km D e Les coefficients de diffusion et de partage Le coefficient de diffusion caractérise la résistance du milieu face à la diffusion de la molécule au travers de la peau. Le calcul de ce coefficient implique la température du milieu, le rayon de la molécule étudiée de même que la viscosité du milieu. De son côté, le coefficient de partage caractérise l affinité de la molécule pour le milieu aqueux et la membrane cutanée (Beetge, et al., 2000). On le calcule donc à l aide des concentrations de la molécule dans le solvant organique et dans l eau. Une distribution en faveur du solvant organique donnera un coefficient de partage plus élevé et bien souvent une plus grande perméabilité La méthode La perméabilité d un échantillon de peau ou d un substitut cutané en présence d une molécule peut être mesurée à l aide de cellules à diffusion de type Franz (Franz, 1975). L échantillon est placé et tenu fermement à l aide d une pince entre les deux chambres de la cellule à diffusion (compartiments donneur et receveur). Le compartiment receveur est rempli avec du milieu de culture et est maintenu à 37 C sous agitation. La molécule étudiée est déposée sur l échantillon dans le compartiment donneur et le milieu du compartiment receveur est prélevé à des temps définis. Ce type de système d absorption est dit statique. Il existe également des systèmes plus complexes avec des cellules dynamiques dans lesquelles le milieu receveur est constamment renouvelé. Le système de cellules à diffusion de type Franz n est pas limitant quant aux molécules étudiées. La contrainte de ce côté provient de l appareil utilisé pour analyser les prélèvements. Un compteur à scintillation liquide permet une analyse assez facile, ne nécessitant pas de développement de méthodes analytiques complexes. Toutefois, il nécessite l emploi de molécules radioactives, ce qui 31

52 peut devenir rapidement contraignant. L analyse des prélèvements peut également s effectuer par chromatographie, permettant l utilisation de molécules non marquées. Les analyses de perméabilité avec le système de cellules à diffusion de type Franz permettent de mesurer la quantité de molécules ayant passé au travers des différentes couches de la peau en fonction du temps, de même que la vitesse de passage (flux).!"#$ %&' ( )* +, - $.-*&$/&$ (&' ()")&)$ 5/78*#)"7 - +)$9/ ++- &#$ 0*&$ 5/78*#)"7 - +)$#-,-:-&#$ ; "<"- &$ 0*&$ $ =*##-$9>*?")*)"/+$ Figure Cellule de Franz statique (Tirée de (Jean, 2010)) 1.7. La spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée (ATR) Les radiations infrarouges, qui correspondent à la région du spectre électromagnétique se situant entre la région du visible et celles des micro-ondes, ont des fréquences comprises entre et 100 cm -1. Lorsqu elles atteignent une molécule, ces radiations sont absorbées par celle-ci sous forme d énergies de vibrations moléculaires, qui peuvent être quantifiées dans un spectre de vibration sous forme de bandes. Un spectre de vibration obtenu suite à une analyse infrarouge est caractéristique de l échantillon étudié. Effectivement, la fréquence d absorption de chaque bande du spectre est dépendante des masses relatives et de la géométrie des atomes composant l échantillon de même que de la force de leurs liaisons (Silverstein, et al., 1998). La largeur des bandes dépend également entre autres de la vitesse des molécules. Une analyse infrarouge permettra ainsi d obtenir des informations sur la structure et la conformation de l échantillon. Dans le cadre des 32

53 analyses effectuées sur les substituts cutanés produits au LOEX, la bande de vibration symétrique des groupements CH2, qui a une fréquence aux alentours de 2850 cm -1, est particulièrement intéressante (Bernard, 2007). En effet, cette bande est caractéristique des chaines acyle des lipides. Étant donné que la fréquence de cette bande dépend de l organisation des lipides, son étude permet d évaluer la conformation des chaines hydrocarbonées des lipides de la couche cornée de substituts cutanés et d échantillons de peau de même que les transitions de phase. Figure 1.16 Spectre infrarouge d une peau normale humaine (La flèche indique la bande d intérêt à une fréquence d environ 2850 cm -1 ) Lorsqu elles se trouvent dans un état ordonné, les chaines acyles des lipides sont en conformation trans alors que, dans un état davantage désordonné, on en retrouve également en conformation gauche. La présence de ces conformères fait augmenter la fréquence de vibration. La longueur des chaines acyle et leur degré d insaturation de même que la nature de la tête polaire des lipides influencent la température de transition entre ces états ordonné et désordonné (Casal & Mantsch, 1984; Ongpipattanakul, et al., 1994; Rowat, et al., 2006). L utilisation de la spectroscopie infrarouge ATR permet l analyse de la couche cornée de la peau normale humaine et des substituts cutanés en minimisant les risques de dommages à 33

54 cette dernière. En effet, aucune préparation n est nécessaire pour effectuer l analyse, l échantillon étant déposé directement sur le cristal ATR (Mendelsohn, et al., 2006) Le génie tissulaire Plusieurs méthodes de préparation de substituts de peau reproduisant une ou plusieurs couches de la peau ont été développées au cours des dernières années (Jean, et al., 2011; MacNeil, 2007). Les substituts peuvent contenir du matériel allogénique, xénogénique ou autologue et peuvent être d'usage temporaire, semi-permanent ou encore permanent. Différents modèles sont actuellement disponibles sur le marché (Fodor, 2003; Horch, et al., 2005; Jean, et al., 2011). En raison des caractéristiques les différenciant, les substituts développés n'ont pas tous la même utilité. À ce jour, aucun substitut reproduisant intégralement la peau n a été développé. Afin de reproduire pleinement les fonctions cutanées et d'avoir les mêmes propriétés, ce substitut idéal se devrait d'avoir entre autres les trois couches de la peau, soit l'épiderme, le derme et l hypoderme, avec un épiderme bien différencié et un derme vascularisé (Gibot, et al., 2010; MacNeil, 2007). De plus, les propriétés du substitut devraient idéalement s'apparenter à celles de la peau. Une structure permettant une vascularisation et une réinnervation du derme rapide est ainsi recherchée. Également, la présence d un derme permettant une réparation de la blessure rapide et d un épiderme fonctionnel permettant de retrouver rapidement une bonne fonction barrière est grandement souhaitable. Le substitut doit aussi pouvoir bien s intégrer au niveau du lit de la plaie lorsqu il est utilisé en clinique (Auger, et al., 2004) Modèles de substituts de peau saine Les modèles de substituts de peau saine disponibles sur le marché peuvent être regroupés en trois catégories selon qu ils contiennent seulement un derme, un épiderme ou bien encore ces deux couches. Il existe trois approches principales pour la production de substituts in vitro, soit les approches par gel, échafaudage et auto-assemblage (Auger, et al., 2004). 34

55 La méthode de production utilisant un gel comme matrice permet d obtenir des reconstructions de peau intéressantes, mais avec des propriétés mécaniques assez faibles (Parenteau, et al., 2000). Un exemple de substituts utilisant cette méthode est Apligraf (Novartis), qui a été approuvé dès 1998 par la FDA pour le traitement des ulcères. Ce substitut bicouche consiste en des fibroblastes allogéniques ensemencés dans un gel de collagène bovin de type 1, sur lequel sont ensemencés des kératinocytes (Wilkins, et al., 1994). Les substituts cutanés peuvent également être produits à l aide d un échafaudage. Ce dernier peut être fait à partir de biomatériaux naturels ou bien encore synthétiques. Il peut également être ensemencé avec des cellules ou bien être acellulaire (Auger, et al., 2004; Auger, et al., 2004). Alloderm (LifeCell), un substitut dermique obtenu à partir de traitements sur des peaux de cadavres, en est un exemple. Les substituts produits avec un échafaudage acellulaire ont l avantage d être rapidement disponibles pour une greffe, mais leur utilisation implique toutefois une 2 e chirurgie afin de greffer par la suite un épiderme autologue cultivé ou bien provenant d un site donneur (Auger, et al., 2004). Ce type de substitut produit par échafaudage est par conséquent peu fréquent. Les substituts produits avec un échafaudage cellularisé sont, à l opposé, retrouvés plus fréquemment. Dermagraft (Shire), un substitut dermique avec un échafaudage de polyglactine, en constitue un exemple. On retrouve également des substituts à échafaudage cellularisé bicouches tels qu Academia et OrCel TM. Ce type de substituts est principalement développé en milieu académique. Finalement, la méthode d auto-assemblage constitue une autre approche pour produire des substituts cutanés. Celle-ci est basée sur la propriété qu ont les cellules mésenchymateuses telles que les fibroblastes à produire leur propre matrice extracellulaire in vitro. Cette méthode permet de produire des substituts exempts de matériel exogène lorsque les cellules du patient sont utilisées. Cette méthode est également applicable à d autres organes que la peau (Auger, et al., 2004). 35

56 Modèles de substituts de peau psoriasique Le développement de modèles de peau psoriasique a également fait l objet de recherches au cours des dernières années et différentes techniques ont été développées afin de produire des modèles in vivo et in vitro. Les premiers se divisent en différentes catégories, soit les mutations spontanées, les modèles produits génétiquement et les xénotransplantations (Jean, et al., 2012). Les modèles à mutations spontanées, souvent chez la souris, ne représentent globalement pas de bons modèles puisqu ils ne permettent pas de générer un phénotype psoriasique assez complet. Ils peuvent toutefois permettre l étude de certains aspects spécifiques de la maladie (Mizutani, et al., 2003). Une centaine de mutations chez la souris menant à certaines caractéristiques du phénotype psoriasique a été recensée (Sundberg, et al., 1990) et de multiples modèles ont été développés dans les dernières décennies (Gudjonsson, et al., 2007). Les modèles produits génétiquement sont les plus fréquents et incluent les modèles d animaux transgéniques et knockout. Les modifications génétiques apportées ont différentes cibles telles que le système immunitaire, l endothélium vasculaire et les protéines épidermiques. Ces modèles permettent de reproduire en tout ou en partie différentes caractéristiques importantes du phénotype psoriasique, soit l épaisseur épidermique, la différenciation anormale des kératinocytes, l augmentation de l angiogénèse et l infiltration épidermique de cellules T (Jean, et al., 2012). Les modèles produits par xénotransplantation, quant à eux, consistent en la greffe d un morceau de peau psoriasique ou d un substitut de peau psoriasique sur une souris génétiquement modifiée. Trois types de souris sont principalement utilisés, soit la souris nue athymique qui n a pas de thymus et donc de cellules T (Raychaudhuri, et al., 2001), la souris SCID qui n a pas de cellules T et B (Gudjonsson, et al., 2007) et finalement la souris à mutations spontanées AGR129 qui n a pas non plus de cellules T et B en plus d avoir des cellules NK immatures (Boyman, et al., 2004). Ce dernier modèle permet d obtenir un taux moins élevé du rejet des greffons par rapport aux deux autres. Les modèles de 36

57 xénotransplantation ont toutefois le désavantage de ne pas permettre l étude de l implication du système immunitaire dans la maladie. Différents modèles in vitro existent également et peuvent se diviser en trois catégories, soit les modèles monocouches, les modèles sur gel de collagène et les modèles par autoassemblage. Les modèles en monocouche ne permettent pas d étudier les interactions entre les différents types cellulaires de la peau pouvant être impliqués dans la pathologie, mais permettent toutefois d analyser séparément certains mécanismes cellulaires et de mieux en comprendre le fonctionnement (Jean, et al., 2012). Les modèles sur gel de collagène, quant à eux, consistent globalement en des fibroblastes ensemencés dans cette matrice avec des kératinocytes ensemencés par dessus. Plusieurs caractéristiques du psoriasis telles que l hyperprolifération et la différenciation anormale des kératinocytes de même que la dérégulation de certains marqueurs sont retrouvées dans ces modèles, ce qui les rend intéressants pour l étude de la pathologie. Il reste toutefois que ces derniers contiennent du matériel exogène, ce qui les différencie de la peau normale humaine. La méthode d autoassemblage développée au LOEX permet d éliminer l utilisation de ce dernier et de produire des substituts bicouches avec des fibroblastes et des kératinocytes lésionnels. Ces substituts possèdent un phénotype psoriasique et réagissent à un traitement anti-psoriasique comme le ferait la peau lésionnelle (Jean, et al., 2009). La compagnie MatTek propose également un substitut psoriasique bicouche sans matrice de gel qui présente un bon phénotype psoriasique. Le substitut est produit à partir de fibroblastes lésionnels et de kératinocytes sains. Néanmoins, il est cultivé sur un substrat exogène, soit un insert à culture cellulaire Millipore Millicell TM sur lequel le substitut reste accroché à la fin de la culture Utilisation et conservation Au cours des dernières années, différents modèles de substituts de peau humaine ont été développés afin de traiter différentes blessures cutanées telles que les brûlures et les ulcères (Dougherty & Chalabian, 1995). En plus de leurs applications cliniques, les substituts cutanés sains et pathologiques peuvent être utilisés en recherche pour diverses études dermopharmacologiques et de toxicité (Auxenfans, et al., 2009). Des compagnies 37

58 renommées en utilisent d ailleurs déjà, telles que L Oréal qui utilise des substituts du laboratoire SkinEthic pour des tests. En outre, le développement de substituts cutanés est d autant plus important que l utilisation d animaux en recherche appliquée et fondamentale est de plus en plus sujet à des débats sociaux dans le domaine de l éthique. Ces derniers ont d ailleurs mené à des législations plus restrictives, surtout sur le continent Européen où les réformes du 7 e amendement de la Directive Cosmétique sont rentrées totalement en vigueur depuis le 11 mars 2013, interdisant l usage de tests sur les animaux pour les produits cosmétiques et leur ingrédients fabriqués au sein de l Union Européenne de même que la vente de produits cosmétiques et ingrédients ayant été testés sur des animaux (European- Union, 2003; Fentem, et al., 2004). En plus d être une méthode alternative à ces tests, les substituts de peau peuvent offrir des caractéristiques se rapprochant davantage de la peau normale humaine in vivo par rapport à la peau animale (Welss, et al., 2004). Cependant, afin de permettre un accès efficace et rapide aux tests physiques et chimiques sur les substituts cutanés, des méthodes optimales de conservation de ces derniers sont souhaitables (Chen, et al., 2011). La conservation par congélation est une méthode qui pourrait se révéler efficace. Différents groupes ont déjà étudié l impact de la congélation sur la perméabilité de la peau de différents animaux tels que le cochon (Bosman, et al., 1998; Hawkins & Reifenrath, 1984; Schreiber, et al., 2005), le rat (Babu, et al., 2003; Hadzija, et al., 1992), la souris (Holland, et al., 1984), le singe (Kemppainen, et al., 1986) et le chien (Ahlstrom, et al., 2007). Ces analyses ont montré dans tous les cas une augmentation de la perméabilité, sauf dans le cas d une analyse sur la peau porcine (Schreiber, et al., 2005). Des études de perméabilité ont également été réalisées sur de la peau humaine avec diverses molécules. Les études avec de l eau (Astley & Levine, 1976; Bronaugh, et al, 1986; Burch & Winsor, 1944; Harrison, et al., 1984) et avec des solvants organiques (Nakai, et al., 1997) ne montrent pas de différences de perméabilité alors que celles avec de l acide contenant un groupement chromone (Swarbrick, et al., 1982) et avec la toxine T-2 (Kemppainen, et al., 1986) montrent une augmentation de la perméabilité. Différentes méthodes de congélation ont été utilisées lors de ces expériences telles que l emploi de coton imbibé d une solution saline et placé dans un pétri (Burch & Winsor, 1944), de gazes stériles imbibées également d une 38

59 solution saline et placées dans une contenant fermé (Astley & Levine, 1976), de sacs de plastique (Bronaugh, et al., 1986) ou encore de feuilles d aluminium (Swarbrick, et al., 1982) Objectifs du projet Mon projet de recherche consistait à poursuivre la caractérisation physicochimique des substituts cutanés sains et psoriasiques produits par la méthode d auto-assemblage afin d améliorer leur développement et d assurer un perfectionnement du modèle. Les études se sont divisées en deux objectifs principaux qui seront présentés respectivement aux chapitres 2 et 3 : 1) Caractériser l impact d une conservation des substituts cutanés par le biais d une banque de substituts cryopréservés sur une période de 2 mois. Dans ces travaux, nous avons mis à profit l absorption percutanée pour évaluer la perméabilité des substituts après congélation par rapport à celle de substituts frais. L organisation lipidique de la couche cornée a également été investiguée par ATR-FTIR afin d analyser l impact de la congélation sur cette organisation. Trois populations cellulaires saines ont été utilisées pour la production de substituts cutanés et des biopsies de peau normale humaine fraiches et congelées ont été utilisées comme contrôle lors de chaque analyse. 2) Étudier la composition lipidique de l épiderme des substituts cutanés sains et psoriasiques. Afin que le substitut cutané produit par la méthode d auto-assemblage présente des caractéristiques se rapprochant au maximum de celles de la peau normale humaine, il serait souhaitable que sa composition lipidique soit le plus ressemblante possible à celle de la peau. De même, la composition lipidique d une peau psoriasique présentant des variations par rapport à celle d une peau saine, les substituts psoriasiques produits par la méthode d auto-assemblage devraient présenter de semblables variations en comparaison aux substituts sains. La présence de ces anomalies lipidiques permettrait de 39

60 reproduire plus fidèlement le phénotype psoriasique. L objectif de l étude était donc de commencer la caractérisation de la composition des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques produits par la méthode d auto-assemblage. Des substituts sains ou psoriasiques ont été produits avec des kératinocytes et fibroblastes sains ou psoriasiques respectivement et analysés par chromatographie afin de quantifier les différents types de lipides présents dans leur épiderme. Deux différentes comparaisons ont été effectuées, la première entre la composition lipidique des substituts sains et celle de la peau normale humaine et la seconde, entre la composition lipidique des substituts sains et celle des substituts psoriasiques. Trois populations saines et 3 populations psoriasiques ont été utilisées pour la production de ces substituts par la méthode d auto-assemblage. 40

61 2. Congélation des substituts cutanés 41

62 2.1. Résumé La peau est une membrane complexe exécutant différentes fonctions physiologiques telles le métabolisme, la synthèse, la régulation et l excrétion. Sa couche supérieure, le stratum corneum, est considérée comme étant la principale barrière contre la pénétration cutanée de matériel exogène. Cette barrière est également importante dans la maintenance de l eau dans le corps et dans l absorption de médicaments et autres agents. La science du génie tissulaire a été développée pour produire des substituts biologiques permettant de maintenir, régénérer et réparer des organes et tissus humains. Le but de cette étude a été d évaluer si la congélation de substituts de peau, sur une période de temps relativement courte (6-8 semaines), pouvait altérer certaines de leurs propriétés physiques. Notre projet implique un modèle de substituts de peau humaine produit par génie tissulaire pour lequel il a déjà été démontré que la perméabilité aux drogues était similaire à celle de la peau humaine. À l aide de différentes techniques, nous avons comparé les propriétés physicochimiques de la couche cornée de substituts ayant été congelés à celles de substituts frais. Les résultats obtenus suggèrent que l organisation lipidique du stratum corneum des substituts cutanés produits par la méthode d auto-assemblage n est pas significativement affectée par une congélation à -20 C pendant 2 mois. Cependant, une augmentation significative de la perméabilité du substitut à l acide benzoïque a été observée. Cela suggère que certaines des fonctionnalités du stratum corneum sont affectées par le processus de congélation mais que son intégrité structurale est conservée. 42

63 2.2. Article ATR-FTIR and drug permeation studies of cryopreserved human tissue-engineered skin substitutes for pharmaceutical studies perspective Sarah Dubois Declercq 1,2, Laetitia Angers 1,2, Marielle Robert, Jessica Jean 1,2 and Roxane Pouliot 1,2 Affiliations : 1 Centre LOEX de l Université Laval, Génie tissulaire et régénération : LOEX - Centre de recherche FRSQ du Centre hospitalier affilié universitaire de Québec, Aile-R, e rue, Québec, Québec, Canada, G1J 1Z4. 2 Faculté de Pharmacie, Université Laval, Québec, Québec, Canada, G1V 0A6. Running head: Cryopreservation of human skin substitutes Address for reprint request: Roxane Pouliot, Ph.D. (Corresponding author) Centre LOEX de l'université Laval, Génie tissulaire et régénération : LOEX - Centre de recherche FRSQ du Centre hospitalier affilié universitaire de Québec, Aile-R, e rue, Québec, Québec, Canada, G1J 1Z4 Tel: (1) ext Fax: (1) [email protected] 43

64 Abstract Purpose: Currently, different three-dimensional models of skin reconstructed in laboratory are commercially available and seem to be the best models to represent in vivo skin conditions. Storage among time of those skin substitutes is highly desired to make their utilization more convenient. A banking system of cryopreserved substitutes could be a conceivable solution. This study evaluated the effects of cryoconservation at 20 C over a period of 2 months on structural and physicochemical properties of human skin substitutes produced by tissue engineering. Methods: Skin substitutes were produced using to the self-assembly approach based on the capacity of fibroblasts to secrete or to produce their own extracellular matrix in vitro. Characterization of frozen skin substitutes was performed by infrared spectroscopy and by percutaneous absorption analysis to test the permeability of the tissue and to compare the physicochemical properties of a frozen stratum corneum with an unfrozen counterpart of our skin substitute. Results: Infrared spectroscopy analysis showed no significant differences of the lipid conformation of skin substitutes but permeability analysis revealed a significant increase of benzoic acid penetration for frozen skin substitutes. Conclusions: This study showed that freezing samples for a medium-term period does not damage stratum corneum lipids organization of skin substitutes but affected functionality of the stratum corneum barrier. 44

65 Introduction Located at the interface between human body and exterior environment, skin is particularly exposed to pathogens and to chemical or mechanical injuries [1]. However, because of its large surface area and its structural and functional complexity, regenerating a complete human skin (including a proper epidermis, dermis and hypodermis) is a big challenge. Over the past years, different human skin substitute models have been elaborated in order to treat severely burned patients and chronic cutaneous wounds [2]. Furthermore, skin substitutes have been also widely used in fundamental researches for various dermopharmacology and toxicology investigations [2, 3]. In order to be good models, skin substitutes needed to have properties and characteristics as close as possible of skin ones [4]. Over the past years, use of animals in fundamental and applied research has also been subject to social debates and to the creation of more restrictive legislations, such as the Seventh Amendment to the Cosmetic Directive introduced by the European Union [5]. Utilization of skin substitutes to perform tests allowed to eliminate or at least to reduce the necessity of those controversy tests on animals. Moreover, as animal skin is not similar to human one, to replace it by a skin model with characteristics closer to human skin ones could improve the validity of performed tests [6]. In order to be efficient and to rapidly have access to skin substitutes, optimized storage methods are needed [7]. The impact of various freezing conditions has been tested on animal and human skins in various conditions. Different methods were used for the frozen storage. While Burch et al. used Petri dishes with cotton soaked with a solution of sodium chloride [23] Astley et al. rolled their skin biopsies in sterile gauzes soaked with a salt solution (Hank's balanced salt) and stored them in capped containers [28]. Bronaugh et al. used sealed plastic bag [24] and Swarbrick et al., aluminum foils [25]. Among all tests available to evaluate the integrity of skin tissues followed storage by freezing, permeability analysis is one of the most used in the literature. 45

66 Various factors may influence on skin absorption level, such as biological factors linked to skin characteristics and physicochemical factors linked to the characteristics of the studied substances [8, 9]. Actually, molecules diffuse through the skin by various pathways such as the transepidermic pathway or the transannexiel pathway [10]. The first one implies the diffusion of the chemicals directly through the skin by two different modes: 1) diffusion by transcellular migration through keratinocytes of stratum corneum layer or 2) diffusion by intercellular way through intercellular spaces. The second one implies the diffusion of the chemicals through air follicles and sweat ducts. Stratum corneum is therefore the most important layer implied in the skin permeability. This layer is mainly constituted of corneocytes that are terminally differentiated keratinocytes. Those cells are interlocked in an intercellular matrix of lipids and are mainly constituted of ceramides, cholesterol and free fatty acids [11]. The specific organization of those lipids plays an important role in the barrier functionality of the stratum corneum [12]. This organization may be quantified by ATR-FTIR analysis [13]. Permeability analysis has been performed on different animal s frozen skin such as pig [14, 15], rat [16, 17] mouse [18], cattle [19], monkey [20], and dog [21]. These studies showed in most of the case an augmentation of the caffeine and testosterone penetration flux into porcine skin [22]. As animal skin differs from human skin, the results of these studies need to be interpreted cautiously. Accordingly, other experiments have also been performed on frozen human skin using various penetration agents such as water [23, 24], chromone acid [25], m-deet [26], organic solvents [27] and T-2 toxin [20]. While the ones using water and organic solvents showed no impact, the other ones using chromone acid, m-deet and T-2 toxin showed variation of the penetration flux as well as a decreased permeability. Some of the developed skin substitutes have also been tested for cryopreservation. Different methods were used for epidermal substitutes cryopreservation such as use of dimethyl-sulfoxide [7, 29, 30] and trehalose as cryoprotectants [7]. Dimethyl-sulfoxide has also been tested on dermal substitutes [31, 32]. Cells viability was measured to evaluate the 46

67 impact of those cryoprotectants. However, at our knowledge, percutaneous analysis of frozen skin substitutes has never been described. In this study, we evaluated the impact of cryopreservation on some physical properties and functionalities of skin substitutes produced by the self-assembly method. Fresh and frozen normal human skin biopsies were also analyzed and used as controls. We showed that cryopreservation of these skin substitutes affected the functionality of the stratum corneum barrier while no effects were noted on lipid organization of the frozen skin substitutes. Permeability to benzoic acid of normal human skin used as controls was also not affected by cryopreservation. These interesting results opened up future research opportunities to further study the properties and characteristics of our skin substitutes. 47

68 Material and methods Patients Skin samples used to generate primary human cell banks were derived from breast reduction surgeries of Caucasian females aged between 18 and 38 years old (cell populations: 18, 22 and 38. Biopsies used as control were obtained also from breast reduction surgeries. Subjects were Caucasians females aged between 26 and 58 years old (skin biopsies: 26, 38, 49 and 58). This study was conducted in agreement with the Helsinki declaration and performed under the guidelines of the research ethics committee of the Centre hospitalier affilié universitaire de Québec. All patients were given adequate information to provide written consent. Cell culture media Fibroblasts were cultured in the high-glucose Dulbecco-Vogt modification of Eagle s medium (DMEM) (Life technologies, Burlington, Canada) supplemented with 10% fetal calf serum (Hyclone, Logan, USA), 100 UI/ml penicillin G (Sigma, Oakville, Canada) and 25g/mL gentamicin (Schering Canada, Pointe-Claire, QC, Canada). Keratinocytes were cultured in a combination of high-glucose DMEM with Ham s F12 (3:1) supplemented with 5% Fetal Clone II serum (Hyclone), 5g/ml insulin (Sigma, Oakville, Canada), 0.4g/ml hydrocortisone (Calbiochem), M cholera toxin (Sigma), 10 ng/ml human epidermal growth factor (Austral Biological, San Ramon, CA), 100 UI/ml penicillin G (Sigma) and 25 g/ml gentamicin (Schering Canada). Cell culture Fibroblasts and keratinocytes were extracted from skin biosies using respectively collagenase and trypsin as previously described [33][34. Cells were frozen at -150 C until needed. Keratinocytes (passage 1) were seeded at 8 x 10 3 cells/cm 2 on a feeder layer of irradiated 3T3 mouse fibroblasts. Fibroblasts were seeded at 4 x 10 3 cells/cm 2 and used at passage 6 for skin substitute s production. All cultures were incubated at 37 C in an 8% CO2 environment and changed three times a week with the media previously described in the cell culture media section. 48

69 Production of tissue-engineered substitutes Skin substitutes were produced using the self-assembly method, as previously described [35]. Briefly, the fibroblasts were cultured in the presence of ascorbic acid at a concentration of 50 g/ml (Sigma) to form manipulatable sheets. After 28 days, dermal sheets were carefully detached of flasks with curved forceps and superimposed two by two. After a week, the keratinocytes (passage 2) were seeded on the dermal superimposed sheets to form a new epidermal layer. After 7 days of growth, the substitutes were raised at the airliquid interface and cultured for 21 days in order to induce the formation of the stratum corneum. All culture media were changed three times a week. Freezing of skin substitutes and human biopsies At the end of the skin substitutes production, some skin substitutes were wrapped in aluminum foils, without cryopreservation agent, and frozen directly at -20 C for 2 months. A sample of each fresh human biopsy was frozen in the same conditions before to be tested. In the hours between the operation and the frozing process, human biopsies were kept in the transport medium at 4 C. Skin substitutes and skin biopsies were transferred at 4 C, 24 hours before analysis. ATR-FTIR experiments Infrared spectra of human skin and substitutes produced with the self-assembly method were obtained using a Golden Gate TM (Specac Ltd, Londin, UK) single reflection diamond attenuated total reflection. The infrared spectra were recorded with a Nicolet Magna 850 Fourier transform spectrometer (Thermo-Nicolet, Madison, WI) equipped with a narrow band mercury-cadmium-telluride (MCT) detector and a germanium-coated KBr beam splitter. 128 interferograms were acquired at each temperature, co-added and Fourier transformed using a Happ-Genzel apodization function to give a spectral resolution of 4 cm -1 in the spectral range of 4000 to 750 cm -1. All data were processed with the Grams/AI 8.0 software (Galactic Industries Corporation, Salem, MA). This spectral region corresponded to the CH2 stretching band vibrations was baseline-corrected using a cubic 49

70 function and the frequency peak position was determined using the center of gravity at the top 10% of the bands. Percutaneous absorption Percutaneous absorption was measured by the standard Franz diffusion cell technique as described by Franz (Franz, 1975). Briefly, samples were clamped tightly between the two glass chambers of the diffusion cell (FDC-100 Standard, 0.63 cm 2 surface area O-ring; Crown Glass, Somerville, NJ). Receiver compartment was filled with media (DMEM supplemented with penicillin G (Sigma), gentamicin (Schering), and 0.5 mg/ ml of fungizone (Bristol-Myers Squibb Canada, Montréal, Québec, Canada) and maintained at 37 C with a water jacket. One hundred microliters of 14C benzoic acid (0,005 mci/100l/chamber) (MP Biomedicals) was deposited on the substitute. Samples were taken at selected intervals (1, 2, 4, 6, 8, and 24 h) with a 5 ml syringe prolonged by a catheter (31 2 FR Tom Cat Length 41 2) and were conserved at 4 C until needed. Radioactivity was determined with a scintillation counter Beckman LS 6000 SC (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) by adding 0.5 ml of sample to 4.5mL of scintillation fluid Scintisafe TM 30% (Fischer Scientific Ltd., Québec, Québec, Canada). Statistical analysis Infrared data, cumulative amounts data and normal human skin fluxes data were analyzed using the analysis mixed model with a transformation in log. Skin substitutes fluxes data were analyzed using the Mann Whitney model. A significant level of 0.05 was selected to confer statistical significance. For cumulative amounts data, significant differences were analyzed at each hour using a 95% confidence interval. Results were analyzed with the SPSS Statistics program (version 21). Effect size for all data was measured using SPSS Statistics program (version 21). 50

71 Results Percutaneous absorption Kinetics of percutaneous absorption for human skin In fresh human skin biosies (figure 1a), fluxes were with an almost continuous aspect during all 24 hours (0.27 ± 8.34 x 10-5 mg/cm 2 /h at 1h and 1.76 ± 2.38 x 10-5 mg/cm 2 /h at 6h) with a small augmentation observed at 8 h and 24h (3.60 ± 6.24 x 10-5 mg/cm 2 /h and 3.59 ± 5.83 x 10-5 mg/cm 2 /h). Frozen human skin fluxes showed the same tendency, with augmentation at 8 h (1.38 ± 3.16 x 10-4 mg/cm 2 /h) and at 24h (1.68 ± 1.25 x 10-5 mg/cm 2 /h). No significant differences were observed between fluxes on fresh and frozen normal human skin biopsies. Kinetics of percutaneous absorption for tissue-engineered skin substitutes In tissue-engineered skin substitutes (figure 1b), fluxes of fresh skin substitutes were in a plateau during all first 24h (2.44 ± 1.61 x 10-5 mg/cm 2 /h at 1h and 6.90 ± 7.71 x 10-5 mg/cm 2 /h at 24h). Fluxes of frozen skin substitutes increased in the first hours to reach a steady state between 2h and 6h (19.03 ± 8.69 x 10-5 mg/cm 2 /h at 2h and ± x 10-5 mg/cm 2 /h at 6h). After, fluxes increased until 24h (44.84 ± 6.54 x 10-5 mg/cm 2 /h). Significant differences were observed at 1h, 2h, 4h, 6h, 8h and 24h compared to fresh skin substitutes. Permeability of normal human skin As shown in table I, there was no statistically significant effect of freezing on cumulative amount (f(1,15)=1.057), p=0.320). After 1 h, no significant statistical differences were observed in cumulative amount of benzoic acid between fresh and frozen skin biopsies 51

72 (0.17 ± 0.20 x 10-5 g and 0.06 ± 0.08 x 10-5 g). Similar results were observed after 2h (0.63 ± 0.75 x 10-5 g and 0.22 ± 0.34 x 10-5 g), 4h (2.11 ± 2.71 x 10-5 g and 0.66 ± 0.98 x 10-5 g), 6h (4.33 ± 5.67 x 10-5 g and 1.43 ± 2.34 x 10-5 g), 8h (8.87 ± x 10-5 g and 3.17 ± 6.32 x 10-5 g) and 24 h (45.03 ± x 10-5 g and ± x 10-5 g). Permeability of tissue-engineered skin substitutes As shown in table II, there was a significant statistical effect of freezing on cumulative amount on benzoic acid. After 1h, a significant statistical difference was observed in cumulative amount of benzoic acid between fresh and frozen skin substitutes (1.54 ± 1.02 x 10-5 mg and 5.87 ± 4.10 x 10-5 mg) (f(1,16)=26.279), p 0.001). Significant differences were also observed after 2h, 4h, 6h, 8h and 24h, with cumulative amounts of benzoic acid for frozen skin substitutes that were respectively 4.7, 5.2, 5.3, 6.1 and 6.4 times higher compared to cumulative amounts of benzoic acid detected in fresh skin substitutes. ATR-FTIR spectroscopy of fresh and frozen normal human skin biospies The lipid organization of stratum corneum for each sample was analyzed by ATR-FTIR spectroscopy. Frequencies of the symmetric CH2 mode of vibration were measured between 28 C and 80 C. At 28 C, no significant differences in term of lipid composition and organization were observed between fresh and frozen skin biopsy 23 ( ± 0.07 cm -1 and ± 0.31 cm -1 ). Similar results were obtained for fresh and frozen skin biopsy 38 ( ± 0.73 cm -1 and ± 0.09 cm -1 ) for fresh and frozen skin biopsy 49 ( ± 0.07 cm -1 and ± 0.24 cm -1 ) and for fresh and frozen skin biopsy 58 ( ± 0.18 cm -1 and ± 0.42 cm -1 ). For higher temperatures, no significant differences were observed at 80 C for fresh and frozen skin biopsy 23 ( ± 0.42 cm -1 52

73 and ± 0.51 cm -1 ), for fresh and frozen skin biopsy 38 ( ± 0.87 cm -1 and ± 0.58 cm -1 ), for fresh and frozen skin biopsy 49 ( ± 0.08 cm -1 and ± 0.42 cm -1 ) and for fresh and frozen skin biopsy 58 ( ± 0.32 cm -1 and ± 0.56 cm -1 ). No significant differences were observed between this temperatures range. ATR-FTIR spectroscopy of fresh and frozen skin substitutes The lipid organization of stratum corneum of fresh and frozen skin substitute was also analyzed by ATR-FTIR spectroscopy. Frequencies of the symmetric CH2 mode of vibration were measured between 28 C and 80 C. At 28 C, no significant differences lipid organizatkion and composition were observed between fresh and frozen skin substitutes 18 ( ± 0.33 cm -1 and ± 0.19 cm -1. Similar results were obtained for fresh and frozen skin substitutes 22 ( ± 0.09 cm -1 and ± 0.44 cm -1 ) and for fresh and frozen skin substitutes 38 ( ± 0.18 cm -1 and ± 0.19 cm -1 ). For higher temperatures, no significant differences were observed at 80 C for fresh and frozen skin substitutes 18 ( ± 0.40 cm -1 and ± 0.34 cm -1 ), for fresh and frozen skin substitutes 22 ( ± 0.17 cm -1 and ± 0.55 cm -1 ) and for fresh and frozen skin substitutes 38 ( ± 0.56 cm -1 and ± 0.26 cm -1 ). No significant differences were observed between this temperatures range. 53

74 Discussion Skin substitutes, produced by the self-assembly method, are composed by a dermal fibroblast sheet and an epidermal keratinocyte layer. The method is based on the capacity of fibroblasts to produce their own extracellular matrix. It allows the production of skin substitutes free of exogenous material [36]. The epidermal layer is fully differentiated with a well defined stratum corneum showing a good barrier function [37]. The necessity to have a fast access to skin substitutes for both for clinical uses (graft) [38] and for applied research (to replace tests on animals) is of high importance [7]. As production of our skin substitutes required 63 days of culture, cryoconservation of skin substitutes over a 2 months period could allow us to have substitutes readily available in any time to perform pharmaceutical studies. Cryopreservation could be one alternative to store skin substitute among time. The present study was designed to evaluated the impact of medium-term freezing at -20 C on the functionality and the structural aspect of the stratum corneum barrier of tissue-engineered skin substitutes produced by the self-assembly method. We demonstrated that it is possible to preserve our tissue-engineered skin substitutes by cryopreservation up to 2 months without significant differences in the structural properties of stratum corneum lipids organization but with significant differences in barrier functionality. Permeability of skin biopsies and skin substitutes can be determined using percutaneous absorption techniques such as Franz diffusion cell system [39]. This method allowed the determination of the penetration profile of a molecule through the skin. In this study, we followed the penetration profiles of benzoic acid through skin biopsies and our skin substitutes. For skin substitutes, our results demonstrated that the cutaneous barrier of skin substitutes to benzoic acid is significantly affected by cryopreservation with a medium to high size effect according to Cohen s convention (f 2 =0,25). Detceted cumulative amounts of benzoic acid are significantly increased for frozen skin substitutes as soon as after 1h, revealing changes in the barrier functionality by the cryopreservation process. As cumulative amounts of benzoic acid are not significantly different for fresh and frozen skin biopsies, substitutes seem therefore to be less resistant to cryopreservation than normal skin. Penetraton fluxes showed same tendency, with no difference between fresh and frozen 54

75 normal human skin substitutes, but with a difference among all 24h between fresh and frozen skin substitutes ATR-FTIR results showed a well organization of the lipids in both fresh and frozen skin substitutes with no significant differences observed between them. We demonstrated that it is possible to preserve our tissue-engineered skin substitutes by cryopreservtion up to 2 months without significant variations in stratum corneum lipids organization (p=0,636). At human body temperature, lipids are in a crystalline solid state [40], with alkyls chains mostly in trans conformation. Variation in some parameters such as of pressure and temperature can break the lipid organization, leading to a phase transition to get a gel or a crystalline liquid phase. In those phases, lipids are more in a left conformation. Frequencies of the CH2 symmetric stretching vibration obtained by infrared spectroscopy are characteristic of this lipids organization. A higher frequency showed a less organized system and vice versa [41]. Frequencies were measured between 28 C and 80 C for fresh and frozen skin substitutes and normal human skin biopsies. Within this temperature range, th frequencies increased at the same level for both fresh and frozen skin substitutes. Skin biopsies, used as controls, shown the same results. We can therefore conclude that the structural function of the stratum corneum barrier is not affected by the freezing process, oppositely to the barrier functionality. The impact of cryopreservation on skin permeability has already been evaluated by other groups, and showed no difference in the permeability to water and organic solvents for normal human skin [23, 24, 27]. However, it is known that cryopreservation can caused ice crystals formation [42]. This process could perturb the integrity of our skin substitutes. A slow cooling of skin substitutes until reaching the desired cryopresesrvation temperatures could reduce the size of ice crystals and therefore their impact. Nevertheless, cryopreservation at lower temperatures requires use of cryopreservation agents such as DMSO and glycerol to help the conservation of cells integrity. As our cryopreservation studies are for pharmaceutical studies perspective, use of these cryopreservation agents 55

76 must be avoided because cryopreservation agent are known to increase skin permeability [43, 44]. Our results showed that skin biopsies are not affected by cryopreservation oppositely to skin substitutes produced by the self-assembly method. Even if our skin substitutes have already many similar structural and physicochemical properties than normal human skin, some differences remained and would need to be further investigated. Among them could be the stratum corneum lipid composition. Differences in this composition could possibly affected functionality of the skin and therefore its capacity of adaptation to physical shock such as cryopreservation. 56

77 Conclusion Results obtained in this study suggested that lipid organization of the stratum corneum of skin substitutes produced by the self-assembly method is not significantly affected by cryopreservation at -20 C over a 2 months period. A significant increase in skin substitutes permeability to benzoic acid was however observed. This suggested that the barrier function of the stratum corneum is affected by the freezing process but that its structural integrity is conserved. Some differences between the stratum corneum lipid composition of our skin substitutes and normal human skin may potentially be implied in the lower functionality conservation after freezing observed for our skin substitutes and are subject to actual researches in our group. 57

78 2.3. Legend to Figures Figure 1a. Fluxes of benzoic acid through fresh (NHS) and frozen normal human skin (FNHS). The samples were taken after 1, 2, 4, 6, 8 and 24 hours. The results were confirmed with biopsies of three different patients and their frozen counterparts (n=2 or 3 technical replicates for each biopsy) Figure 1b. Fluxes of benzoic acid through fresh (SS) and frozen skin substitutes (FSS). The samples were taken after 1, 2, 4, 6, 8 and 24 hours. The results were confirmed with cells from 3 different patients used to produce the skin substitutes and their frozen counterparts (n=3 technical replicates for each cell line) Figure 2a. Temperature dependence of the frequency of the CH 2 symmetric stretching vibration of normal human skin (NHS) and frozen normal human skin (FNHS) obtained fallowing ATR-FTIR spectroscopy analyses. The results were confirmed with biopsies of four different patients and their frozen counterparts (n=3 technical replicates for each biopsy) Figure 2b. Temperature dependence of the frequency of the CH 2 symmetric stretching vibration of skin substitute (SS) and frozen skin substitute (FSS) produced by the self-assembly method obtained fallowing ATR-FTIR spectroscopy analyses. The results were confirmed with cells from three different patients used to produce the skin substitutes and their frozen counterparts (n=3 technical replicates for each cell line) 2.4. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge Isabelle Gendreau and François Dominique Scott for their contribution. This study was supported by the Canadian Institutes of Health Research (MOP-86498; MOP-90283). RP was recipient of a research fellowship from the Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ), Québec, QC, Canada. LA was recipient of postgraduate scholarships from Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (CRSNG) and from the Fonds de recherche du Québec Nature et technologies (FRQNT). SDD was recipient of a postgraduate scholarships from the Fonds d Enseignement et de Recherche (FER), Faculty of Pharmacy, Université Laval. 58

79 2.5. Tables and figures Table I. Cumulative amount of benzoic acid through fresh and frozen skin biopsies Time (h) Patient Fresh skin biopsies Cumulative amount (x10-5 g) 1 Frozen skin biopsies ± ± ± ± ± ± 0.03 Mean 0.17 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.05 Mean 0.63 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.15 Mean 2.11 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.15 Mean 4.33 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.12 Mean 8.87 ± ± ± ± ± ± ± ± Mean ± ± All data presented are the mean ± standard deviation of biopsy replicates of the patient. The results were confirmed with biopsies from three different patients and their frozen counterparts (n=3 technical replicas for each biopsie) 2 n = 2 replicas 59

80 Table II. Cumulative amount of benzoic acid through fresh and frozen skin substitutes Time (h) Cells population Cumulative amount (x10-5 g) 1 Fresh skin substitutes Frozen skin substitutes ± ± ± ± ± ± 2.42 Mean 1.54 ± ± 4.10* ± ± ± ± ± ± 7.18 Mean 3.81 ± ± 7.72* ± ± ± ± ± ± Mean 8.24 ± ± 16.71* ± ± ± ± ± ± Mean ± ± 2.84* ± ± ± ± ± ± Mean ± ± 46.09* ± ± ± ± ± ± Mean ± ± All data presented are the mean ± standard deviation of substitutes replicates of the cell line. The results were confirmed with cells from three patients used to produce the skin substitutes and their frozen counterparts (n=3 substitutes for each cell line). *Significant at

81 Figure 1a. Flux of fresh and frozen skin biopsies f 0,0005 0, ,0004 NHS FNHS Flux (μg/cm 2 /h) 0, ,0003 0, ,0002 0, ,0001 0, Time (h) 61

82 Figure 1b. Flux of fresh and frozen skin substitutes 0,0005 SS 0,0004 FSS Flux (μg/cm 2 /h) 0,0003 0,0002 0, Time (h) 62

83 Figure 2a. CH 2 stretching band vibrations of fresh and frozen skin biopsies stratum corneum 2855 NHS 23 FNHS 23 Frequency (cm 1) NHS 38 FNHS 38 NHS 49 FNHS 49 NHS 58 FNHS Temperature ( C) 63

84 Figure 2b. CH 2 stretching band vibrations of fresh and frozen skin substitutes stratum corneum SS 18 FSS 18 SS 22 FSS 22 SS 38 FSS 38 Frequency (cm-1) Temperature ( C) 64

85 2.6. References 1. Maziere JC. Histo-Physiologie de la peau et lipides cutanés-structure de l'épiderme et particularités du métabolisme des lipides en relation avec la fonction barrière hydrique de la peau. Oléagineux, Corps gras, Lipides July;4(4): Dougherty WR, Chalabian JR. Skin substitutes. The Western journal of medicine Jun;162(6): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Auxenfans C, Fradette J, Lequeux C, Germain L, Kinikoglu B, Bechetoille N, et al. Evolution of three dimensional skin equivalent models reconstructed in vitro by tissue engineering. European journal of dermatology : EJD Mar-Apr;19(2): PubMed PMID: MacNeil S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature Feb 22;445(7130): PubMed PMID: Fentem J, Chamberlain M, sangster B. The feasibility of replacing animal testing for assessing consumer safety: A suggested future direction. Alta-Alternative to Laboratory Animals Dec;32(6): Welss T, Basketter DA, Schroder KR. In vitro skin irritation:facts and future. State of the art review of mechanisms and models. Toxicology in Vitro Jun;18(3): Chen F, Zhang W, Wu W, Jin Y, Cen L, Kretlow JD, et al. Cryopreservation of tissue-engineered epithelial sheets in trehalose. Biomaterials Nov;32(33): PubMed PMID: Jean J. Application dermopharmaceutiques: développement d'un modèle de substituts cutanés psoriasiques par génie tissulaire. Québec: Université Laval; Melissopoulos IA, Levacher C. La peau: structure et physiologie. Doc T, editor. Paris p. 10. Schaefer H, Redelmeier TE. Skin barrier: principles of percutaneous absorption. Karger, editor p. 11. Kenneth AW. Dermatological and Transdermal Formulation. Press C, editor. Wales p. 12. Bernard G, Auger M, Soucy J, Pouliot R. Physical characterization of the stratum corneum of an in vitro psoriatic skin model by ATR-FTIR and Raman spectroscopies. Biochimica et biophysica acta Sep;1770(9): PubMed PMID: Golden GM, Guzek DB, Harris RR, McKie JE, Potts RO. Lipid thermotropic transitions in human stratum corneum. The Journal of investigative dermatology Mar;86(3): PubMed PMID: Hawkin GS, Reifenrath WG. Development of an in vitro model for determining the rate of chemicals applied to skin. Fundamental and Applied Toxicology Mar;4(2):

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89 3. Analyses des lipides épidermiques 69

90 3.1. Mise en contexte La méthode d auto-assemblage développée au LOEX permet de produire des substituts cutanés bicouches et exempts de matériel exogène qui reproduisent différentes caractéristiques histologiques de la peau normale humaine. Toutefois, des études sur certains aspects du substitut sont encore nécessaires afin de compléter la caractérisation de ces derniers. De telles études permettront de cibler les caractéristiques à améliorer afin d augmenter encore davantage la ressemblance des substituts cutanés avec la peau normale humaine. La composition lipidique de l épiderme de la peau est un de ces aspects qui méritent d être étudiés en raison de son rôle crucial au niveau de la fonction barrière de la peau. Le LOEX s était précédemment intéressé à la composition lipidique de sa génération de substituts cutanés produits sur gel de collagène (Auger, et al., 2000), mais celle des substituts produits par la méthode d auto-assemblage n a pas été analysée en détail. Les analyses avaient été réalisées par chromatographie sur couche mince afin de comparer les lipides présents dans la peau normale humaine à ceux du substitut. Cela avait permis de montrer une diminution de la quantité d acides gras libres dans la couche cornée des substituts sur gel de collagène par rapport à la quantité présente dans la couche cornée de la peau normale humaine. Le groupe de recherche du Dr Pouliot a modifié la méthode d auto-assemblage afin de produire un substitut de peau à phénotype psoriasique. Comme vu dans le chapitre 1, il y a une modification au niveau des lipides entre une peau saine et une peau atteinte par cette pathologie. Il est donc également d intérêt de comparer la composition lipidique d un substitut sain avec celle d un substitut psoriasique afin de voir si les mêmes différences sont observables Matériel et méthodes Extraction et culture cellulaire Les banques de cellules humaines utilisées pour cette étude ont été produites par d anciens membres du groupe de recherche à partir de biopsies de peau obtenues suite à des 70

91 chirurgies esthétiques telles que des réductions mammaires et des redrapages. Toutes les recherches ont été conduites en accord avec la déclaration d Helsinki et réalisées selon les exigences du comité d éthique du Centre hospitalier affilié universitaire de Québec. Les patients avaient préalablement reçu les informations pertinentes pour donner leur consentement écrit. Les fibroblastes (cellules du derme) et les kératinocytes (cellules de l épiderme) ont été extraits selon un protocole utilisant de la thermolysine et, respectivement, de la collagénase (Auger, et al., 1995) et de la trypsine (Germain, et al., 1993). Brièvement, la biopsie de peau est tout d abord rincée à plusieurs reprises dans un tampon phosphate (PBS). Elle est par la suite coupée en petits morceaux qui sont déposés dans un pétri contenant une solution de thermolysine à une concentration de 500 μg/ml. Les morceaux de peau y sont laissés entre 12 et 16 heures à 4 C. Après ce délai, l épiderme peut être séparé mécaniquement du derme. Les morceaux de derme sont par la suite placés dans une solution de collagénase H à une concentration de 0,125 U/ml pendant 3 à 4 heures alors que les morceaux d épiderme sont mis dans de la trypsine à une concentration de 0,05 % contenant 0,01 % d EDTA pendant 20 à 30 minutes. Les extractions se font à 37 C sous agitation et sont arrêtées par l ajout du milieu adéquat (DME ou DME-Ham). Les cellules sont récupérées par centrifugation, ensemencées pour prolifération et congelées à différents passages pour utilisation future Méthode d auto-assemblage Une semaine avant le début de la production des substituts cutanés, des fibroblastes en passage 4 sont décongelés et ensemencés en flacons pour prolifération pendant 1 semaine (Jean, et al., 2009). Par la suite, ils sont trypsinés et ensemencés dans du milieu de culture Eagle (DMEM) contenant 10% de sérum de veau fœtal, 100 U/ml de pénicilline G (Sigma, Oakville, Canada) et 25 μg/ml de gentamicine (Schering Canada, Pointe-Claire, QC, Canada) (Jour 0). De l acide ascorbique à une concentration de 50 mg/ml est également ajouté au milieu afin de favoriser la production de collagène par les fibroblastes, ce qui permet d obtenir des feuillets manipulables. Les cultures sont gardées à l incubateur à 37 C 71

92 avec un taux de CO2 de 8% et le milieu de culture est changé 3 fois par semaine. Les fibroblastes sont laissés ainsi en culture pendant 28 jours. Les feuillets de fibroblastes produits sont alors pelés et superposés deux par deux (Jour 28). Ils sont laissés en culture une semaine dans le même milieu contenant toujours de l acide ascorbique. Au moment de superposer les feuillets, des kératinocytes à passage 1 sont décongelés et mis en culture pour prolifération pendant 1 semaine sur un tapis de fibroblastes de souris 3T3 irradiés. Ils sont ensuite ensemencés sur les feuillets de fibroblastes (Jour 35) dans du milieu de culture DME-HAM (DMEM et HAM F12 3 :1) supplémenté avec 5 % de sérum Fetal Clone II, 5 μg/ml d insuline, 0,4 μg/ml d hydrocortisone (Calbiochem), M de toxine du choléra (Sigma), 10 ng/ml de facteur de croissance épidermique (Austral Biological, San Ramon, CA), 100 UI/ml de pénicilline G (Sigma) et 25 μg/ml de gentamicine (Schering Canada). Les substituts sont laissés en culture pendant 1 semaine avant d être mis en montage airliquide (Jour 42). Cette étape consiste à laisser les fibroblastes, soit le derme, dans le milieu de culture alors que les kératinocytes, soit l épiderme, sont en dehors de ce dernier, en contact avec l air. Ce montage permet d obtenir une meilleure différenciation de l épiderme. Les substituts sont laissés en air-liquide pendant 3 semaines, puis les biopsies et analyses peuvent être réalisées (Jour 63). La méthode de production est la même pour les substituts sains et lésionnels, seule la population cellulaire choisie variant Isolation de l épiderme À la fin de l expérience, l épiderme est séparé mécaniquement du derme. Pour les substituts, un racloir est utilisé alors que pour la peau normale humaine, celle-ci est tout d abord chauffée à 60 C dans de l eau pendant 1 min avant que l épiderme ne soit pelé avec des pinces. Pour les analyses par chromatographie sur couche mince, l épiderme est extrait immédiatement tandis que pour les analyses par chromatographie gazeuse il est conservé dans une solution de saline 0,9 % à -80 C jusqu aux analyses. 72

93 Analyses chromatographiques Analyses par chromatographie sur couche mince (HPTLC) Des analyses par chromatographie sur couche mince ont tout d abord été réalisées suivant une procédure établie précédemment par des membres du LOEX. Après la séparation mécanique de l épiderme du derme, les lipides sont extraits selon un protocole adapté de Bligh et Dyer (Bligh & Dyer, 1959). À chaque étape d extraction, le surnageant est collecté et conservé. Tableau 3.1 Étapes d extraction des lipides Étape Solvant Durée Température 1 Chloroforme :méthanol (1 :2, v :v) 1 h Température pièce 2 Chloroforme :méthanol :eau (1 :2 :0,5, v :v :v) 1 h 37 C 3 Chloroforme :méthanol (1 :2, v :v) 1 h Température pièce 4 Chloroforme :méthanol (2 :1, v :v) 1h Température pièce 5 Chloroforme 1h Température pièce Suite à ces extractions, deux lavages des surnageants collectés sont effectués, le premier avec du KCl 2,5% et de l eau et le deuxième avec du chloroforme. Les phases inférieures sont collectées après chaque lavage, combinées et évaporées. Les lipides obtenus sont conservés sous azote dans un vial en verre à -20 C jusqu aux analyses par chromatographie sur couche mince. Pour effectuer ces dernières, les échantillons de lipides recueillis et les standards sont repris à 100 mg/ml dans du chloroforme. Les standards suivants, qui sont conservés à -20 C également, ont été utilisés : Tableau 3.2 Liste des standards pour les analyses par HPTLC Nom du standard L-α-phosphatidylcholine L-α-phosphatidyléthanolamine Galactocérébroside Céramide à acide gras non hydroxylé Identification Sigma #P MG Sigma #P7943-5MG Sigma #C MG Sigma #C2137-5MG 73

94 Sel de sodium du sulfate de cholestérol Lanostérol Cholestérol Acide oléique Trioléine Sigma #C MG Sigma #L5768-1MG Sigma #C MG Sigma #O1008-1G Sigma #T MG Des plaques de 10 x 20 cm (HPTLC : gel de silice, 200 mm, Merck, M ) ont été utilisées pour effectuer les analyses. Ces plaques sont préalablement lavées avec un mélange de méthanol et d acétate d éthyle (60 :40, v /v), puis avec un mélange de chloroforme, d acétate d éthyle et d éther diéthylique (30 :20 :50, v /v /v). Trois systèmes de développement ont été testés, soit un pour les lipides totaux en une dimension, un pour les lipides totaux en deux dimensions et un pour les céramides en une dimension (Ponec & Weerheim, 1990). Une fois le développement fini, les plaques, sont colorées au sulfate de cuivre 10% et séchées à 180 C entre 5 et 15 minutes Analyses par chromatographie gazeuse Après homogénéisation dans de la saline 0,9 %, l épiderme est extrait dans un mélange de chloroforme/méthanol (2 :1, v/v) en présence de deux standards, soit un de phosphatidylcholine C 15 :0 (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) et un de triglycérides C 17 :0 (Sigma Inc., Bellefont, PA). Ces derniers serviront à calculer le pourcentage de récupération. Après l extraction, les lipides se retrouvent dans la phase inférieure de chloroforme. Cette dernière est prélevée et évaporée sous azote. La phase supérieure est ensuite réextraite afin de maximiser la récupération des lipides. Par la suite, les lipides évaporés sont resuspendus dans un mélange de choloroforme/méthanol (75 :25, v/v) et sont mis à migrer sur une plaque de chromatographie sur couche mince. Le solvant utilisé pour la première élution est un mélange d éther d isopropyle et d acide acétique (96 :4, v/v). Cette élution est arrêtée lorsque le front de solvant atteint le milieu de la plaque chromatographique. Une deuxième élution est ensuite effectuée avec un mélange d éther de pétroléum, d éther diéthylique et 74

95 d acide acétique (90 :10 :1, v/v/v). L élution est arrêtée lorsque le front de solvant atteint le haut de la plaque chromatographique. La plaque est alors colorée à l idode. Suite aux deux élutions, les lipides se séparent en 7 bandes sur la plaque chromatographique : Figure 3.1 Séparation des lipides sur plaque chromatographique Les bandes des triglycérides et des phospholipides ont été prélevées pour cette étude et ces derniers ont par la suite été soumis à une méthylation, réaction qui consiste à couper le glycérol et à ajouter un groupement méthyle sur les chaines d acide gras afin de former des esters de méthyle. Ces derniers étant des molécules volatiles, cela rend leur analyse possible par chromatographie en phase gazeuse. La méthylation se fait par l ajout d un mélange de méthanol/benzène (4 :1, v/v) et de chlorure d acétyle aux échantillons de lipides. Après 1h30 de chauffage, la réaction est arrêtée par l ajout de K2CO3, le mélange est centrifugé 15 minutes et la phase supérieure est récupérée. Selon les échantillons, il est possible que celle-ci doive être concentrée avant l analyse par chromatographie en phase gazeuse. Cette dernière est réalisée à l aide d un chromatographe HP 5890 (Hewlett Packard, Toronto, Canada) et d un détecteur à ionisation de flamme. 75

96 Analyses statistiques Les résultats ont été analysés par t-test (α=0,05) après vérification de la normalité avec le test W de Shapiro-Wilk (StatPlus). Les tests de puissance ont été effectuées avec G*Power. Pour les analyses chromatographiques, 3 populations cellulaires saines et trois populations cellulaires psoriasiques ont été utilisées pour produire des substituts. Deux substituts par population ont par la suite été analysés. Des biopsies de peau saine provenant de 3 patients différents ont été utilisées comme contrôle, à raison de 2 échantillons analysés par biopsie Résultats et discussion Méthode d analyse En raison de nombreuses contraintes techniques et de nouvelles opportunités, l analyse des lipides strictement par chromatographie sur couche mince a été remplacée par une analyse par chromatographie sur couche mince afin de séparer les différentes classes de lipides, suivie d une analyse par chromatographie en phase gazeuse. Celle-ci donne des résultats plus fiables et précis et permet, à l aide de standards, de quantifier les quantités de lipides dans chaque échantillon. Les analyses des lipides effectuées sur des biopsies de peau de même que sur des substituts sains et psoriasiques produits par la méthode d auto-assemblage ont permis d obtenir des informations sur deux aspects différents : 1) Les lipides manquants ou en excès dans les substituts de peau saine par rapport à ceux dans la peau normale humaine et 2) Les différences entre le contenu lipidique des substituts sains et des substituts psoriasiques. N ayant pas d analyses lipidiques de biopsies de peau psoriasique, les résultats obtenus au point 2 ont été comparés aux données de la littérature afin de voir si les substituts psoriasiques produits par la méthode d auto-assemblage présentent les mêmes changements de composition lipidique. Les données recueillies suite aux analyses chromatographiques sont présentées de deux façons différentes. Pour chaque échantillon, les mêmes acides gras sont analysés. La 76

97 quantité de chacun est tout d abord donnée en terme de pourcentage par rapport aux autres lipides analysés. La deuxième valeur consiste en la quantité de chaque lipide ramenée en milligramme par gramme de tissu. Différentes autres données obtenues à partir de ces valeurs sont également fournies sous ces deux formes, telles que les quantités d oméga-3 et 6, d acides gras monosaturés, polysaturés, cis et trans, etc. Pour la comparaison entre les biopsies de peau et les substituts de peau saine, les comparaisons ont été effectuées avec les données en terme de pourcentage. Effectivement, la quantité de lipides totaux par gramme de tissu présents dans un substitut est inférieure à celle présente dans la peau normale humaine. Utiliser les données en mg/g de tissu ne permettrait pas de tenir compte de ce point. L utilisation des données en pourcentage permet de faire des comparaisons en terme de proportion entre les lipides présents dans la peau et ceux présents dans le substitut. Pour ce qui est de la comparaison entre les substituts de peau saine et les substituts de peau psoriasique, ce sont les données en pourcentage qui ont également été utilisées. En effet, bien que l on compare deux échantillons beaucoup plus semblables, il reste que la quantité de cellules pour une même masse d échantillon n est pas nécessairement la même, ce qui peut biaiser les résultats donnés en mg par g de tissu. Au total, 42 acides gras ont été analysés dans la fraction «phospholipides» et dans la fraction «triglycérides». Tableau 3.3 Acides gras analysés par chromatographie en phase gazeuse Acides gras saturés 14 :0 (Acide myristique) 16 :0 (Acide palmitique) 18 :0 (Acide stéarique) 20 :0 (Acide arachidique) 22 :0 (Acide béhénique) Cis 24 :0 (Acide lignocérique) Acides gras monoinsaturés Trans 77

98 9c-14:1 n5 (Acide myristoléique) 9c-16 :1 n7 (Acide palmitoléique) 7c-18 :1 n11/6c-18 :1 n12 9c-18 :1 n9 (Acide oléique) 11c-18 :1 n7 (Acide vaccénique) 12c-18 :1 n6 13c-18 :1 n5 8c-20 :1 n12 9t-14:1 n5 9t-16 :1 n7 (Acide palmitélaïdique) 6t-18 :1 n12 (Acide pétrosélaïdique) 9t-18 :1 n9 (Acide élaïdique) 11t-18 :1 n7 (Acide transvaccénique) 11c-20 :1 n9 (Acide gondoïque) 13c-22 :1 n9 (Acide érucique) 15c-24 :1 n9 (Acide nervonique) Acide gras polyinsaturés n3 Cis Trans 9c12c15c-18 :3 n3 (Acide α-linolénique) 9t12t15t-18 :3 n3 6c9c12c15c-18 :4 n3 (Acide stéaridonique) 11c14c17c-20 :3 n3 (Acide homo-α-linolénique) 5c8c11c14c17c-20 :5 n3 5c8c11c14c17c-20 :5 n3 (Acide timnodonique) 13c16c19c-22 :3 n3 7c10c13c16c19c-22 :5 n3 4c7c10c13c19c-22 :6 n3 (Acide cervonique) Acides gras polyinsaturés n6 Cis Trans 9t12c-18 :2 n6 9t12t-18 :2 n6 (Acide linolélaïdique) 9c12c-18 :2 n6 (Acide linoléique) 9t12c-18:2 n6 6c9c12c-18 :3 n6 (Acide γ-linolénique) 11c14c-20 :2 n6 8c11c14c-20 :3 n6 (Acide dihomo-γ -linolénique) 5c8c11c14c-20 :4 n6 (Acide arachidonique) 13c16c-22 :2 n6 7c10c13c16c-22 :4 n6 (Acide adrénique) 78

99 4c7c10c13c16c-22 :5 n6 (Acide d Osbond) Analyses par HPTLC L analyse des lipides par chromatographie sur couche mince a permis de confirmer que l extraction des lipides épidermiques des substituts cutanés par la méthode de Bligh et Dyer (Bligh & Dyer, 1959) est possible. L analyse visuelle des plaques chromatographiques obtenues permet de cibler des différences au niveau de l intensité entre les substituts sains et la peau normale humaine. Toutefois, le manque de résolution permet difficilement de définir exactement quels lipides sont touchés et encore moins de quantifier ces différences. En raison de nouvelles opportunités, la méthode de chromatographie n a pas été optimisée davantage. Figure 3.2 Exemple d une TLC obtenue par le système de séparation des céramides en 1D 79

100 Analyses par chromatographie en phase gazeuse des lipides épidermiques d une peau saine et des substituts sains Phospholipides Aucune différence significative n a été observée entre la proportion d acides gras saturés dans l épiderme des substituts sains et dans la peau normale humaine. Cependant, une diminution significative (p=0,01064) de la proportion d oméga-6 totaux a été observée dans l épiderme des substituts par rapport à la peau humaine. Cette diminution touche plus spécifiquement les acides oméga-6 polyinsaturés cis (p=0,00947) et semble être principalement causée par une forte diminution significative de la proportion d acide linoléique (p=0,02177) Biopsie de peau Substitut sain Proportion (%) * * * * p<0,05 Figure 3.3 Proportion des lipides épidermiques des biopsies de peau et des substituts sains dans la fraction «Phospholipides» (n-6 : acides gras oméga-6; n-3 : acides gras oméga-3; S : acides gras saturés; P: acides gras polyinsaturés; M : acides gras monoinsaturés) 80

101 L absence de différences significatives entre les proportions d acides gras saturés des substituts et de la peau normale humaine constitue un point positif pour nos substituts cutanés. En effet, une augmentation de la proportion des acides gras saturés au dépend des polyinsaturés a un effet négatif sur la fluidité des membranes cellulaires. Due à l absence ou au moins grand nombre d insaturations, les chaines latérales aliphatiques des acides gras vont s organiser davantage parallèlement, causant une augmentation du nombre d interactions entre les chaines. Ce plus grand nombre d interactions diminue la fluidité membranaire. À l opposé, lorsqu il y a présence d insaturations, l organisation parallèle est brisée, diminuant le nombre d interactions et donc permettant à la membrane d être plus fluide (Cartwright, et al., 1985). Par ailleurs, la diminution significative de la proportion d acide linoléique est une observation intéressante en raison du rôle de cet acide et de ses métabolites dans l inflammation. Figure 3.4 Structure de l acide linoléique L acide linoléique, un oméga-6, est considéré comme un acide gras essentiel puisque, lorsqu il est absent de la diète, il y a apparition de symptômes tels que des dermatites et des problèmes de rein et de foie (Neuringer, et al., 1986). Il s agit d un acide gras polyinsaturé (PUFA) dont la présence est d autant plus importante qu il est le précurseur d une série d autres acides oméga-6 (Neuringer, et al., 1986). On distingue, en plus de cette série, au moins trois autres familles de PUFAs : celle des oméga-3, qui dérive de l acide α- linolénique, celle des oméga-9, qui dérive de l acide oléique, et celle des oméga-7, qui dérive de l acide palmitoléique (Das, 2006). La série des oméga-6 est en compétition avec celle des oméga-3 puisque les mêmes enzymes sont impliqués dans le métabolisme des différents acides gras composant ces deux séries. 81

102 Figure 3.5 Série des oméga-3 et 6 (Tirée de (Schmitz & Ecker, 2008)) 82

103 Dans le corps humain, l acide linoléique sera tout d abord transformé en acide ϒ- linoléique, une composante mineure des membranes cellulaires, qui lui-même sera rapidement converti en acide dihomo-ϒ-linoléique. Cet acide gras, bien que ne s accumulant pas beaucoup, produit différents métabolites dont la prostaglandine PG1 qui a un rôle anti-inflammatoire (Aragona, et al., 2005). L acide dihomo-ϒ-linoléique sera par la suite converti en acide arachidonique. Ce dernier constitue le métabolite le plus important de l acide linoléique en raison tant de sa quantité que de son activité biologique. Il est de plus lui-même le précurseur de différents métabolites tels que la prostaglandine PGE2 et l acide 12-hydroxyeicosatétranoïque (12-HETE) qui ont un effet pro-inflammoire. Alors que la prostanglandine est produite par l action de cyclo-oxygénase, le 12-HETE résulte de l action de l enzyme 12-lipoxygénase. L acide linoléique est également important dans la fonction barrière de la peau. En effet, il rentre dans la composition du céramide EOS, dont la présence est essentielle pour avoir la bonne distance entre les bicouches lipidiques (Groen, et al., 2010). 83

104 Figure 3.6 Métabolites des acides oméga-6 (Tirée de (Kendall & Nicolaou, 2013)) Triglycérides Du côté des acides gras de la fraction «triglycérides», une diminution significative (p=0,00148) de la proportion d oméga-6 totaux a également été observée dans l épiderme des substituts cutanés par rapport à la peau normale humaine. Cette diminution touche plus spécifiquement les acides oméga-6 polyinsaturés cis (p=0,0051) et, tout comme pour la fraction «phospholipides», semble être principalement causée par une forte diminution significative de la proportion d acide linoléique (p=0,007). 84

105 Biopsie de peau Substitut sain Proportion (%) * * * 10 0 * p<0,05 Figure 3.7 Proportion des lipides épidermiques des biopsies de peau et des substituts sains dans la fraction «Triglycérides» (n-6 : acides gras oméga-6; n-3 : acides gras oméga-3; S : acides gras saturés; P: acides gras polyinsaturés; M : acides gras monoinsaturés) Analyse par chromatographie en phase gazeuse des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques Phospholipides Aucune différence significative n a été observée entre les proportions des différents groupes d acides gras des substituts sains et psoriasiques. Toutefois, lorsque l on compare de façon individuelle les différents acides analysés, on peut observer une tendance vers une augmentation de la proportion d acide arachidonique pour les substituts psoriasiques. Cette tendance est intéressante puisqu une augmentation de la quantité d acide arachidonique libre a précédemment été observée dans les peaux psoriasiques par comparaison à une peau saine. Une augmentation de la quantité de 12-HETE et de PGE2 a aussi été observée 85

106 (Hammarström, et al., 1975). L augmentation du 12-HETE serait potentiellement causée par une dérégulation entre la proportion des enzymes 15-lipoxygénase et 12-lipoxygénase. Une diminution de la première engendre une augmentation de la seconde et, par conséquent, de la quantité de 12-HETE produit. Un traitement aux rayons ultraviolets permet d ailleurs de diminuer l activité de la 15-lipoxygénase, ce qui vient réguler à la baisse la production du métabolite pro-inflammatoire 12-HETE (Yoo, et al., 2008) Substitut psoriasique Substitut sain Proportion (%) Figure 3.8 Proportion des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques dans la fraction «Phospholipides» (n-6 : acides gras oméga-6; n-3 : acides gras oméga-3; S : acides gras saturés; P: acides gras polyinsaturés; M : acides gras monoinsaturés) Triglycérides Dans la fraction «triglycérides», aucune différence significative n a été observée entre les proportions des différents groupes d acides gras. Toutefois, lorsque ces derniers sont regroupés en fonction de leur longueur de chaine, une augmentation significative de la 86

107 quantité d acides gras à 18 carbones a été observée. Cela vient corroborer ce qui avait été trouvé précédemment lors d une étude portant sur des peaux hyperkératosiques et pour lesquelles une diminution des longueurs de chaine avait été observée. Cette diminution suggérerait d ailleurs une maturation incomplète des acides gras dans ce type de pathologie (Nicollier, et al., 1986) Substitut psoriasique Substitut sain Proportion (%) * p<0,05 Figure 3.9 Proportion des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques dans la fraction «Triglycérides» (n-6 : acides gras oméga-6; n-3 : acides gras oméga-3; S : acides gras saturés; P: acides gras polyinsaturés; M : acides gras monoinsaturés) 87

108 Quantité (mole) 0,0003 0, ,0002 0, ,0001 0, * p<0,05 Substitut psoriasique Substitut sain * * * Longueur de chaine Figure 3.10 Longueur de chaines des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques dans la fraction «Triglycérides» 3.4 Conclusion Une première caractérisation des lipides épidermiques des substituts cutanés sains et psoriasiques produits par la méthode d auto-assemblage a pu être effectuée. Cette étude a permis de comparer les substituts sains avec la peau normale humaine afin d évaluer si la composition lipidique de nos substituts s apparente à celle d une peau humaine et de cibler les lipides manquants ou en excès. Les résultats obtenus montrent tout d abord qu il n y a pas de différences significatives dans la proportion d acide gras saturés. Cela constitue un point positif pour nos substituts étant donné qu une variation en proportion d acides gras insaturés/saturés influence la fluidité membranaire. Par ailleurs, la principale différence entre le substitut cutané et la peau humaine se situe au niveau de la proportion en acide linoléique, qui est significativement réduite dans le substitut. Étant donné le rôle de cet acide dans l efficacité de la fonction barrière, il est essentiel de palier à ce déficit. Lors de 88

109 l étude, une comparaison a également été effectuée entre les substituts cutanés sains et psoriasiques. Peu de différences significatives ont été observées entre les deux, seule une augmentation des acides gras C :18 dans la fraction «Triglycérides» des substituts psoriasiques ayant été obtenue. Ce résultat, à la lumière des résultats obtenus dans la comparaison entre le substitut sain et la peau humaine, est peu surprenant. En effet, les acides oméga-6 génèrent plusieurs métabolites ayant une activité pro-inflammatoire, dont certains pour lesquels une augmentation a déjà été observée dans les peaux psoriasiques. La faible quantité d acide oméga-6 dans les substituts cutanés nuit probablement, par conséquent, à l expression du processus inflammatoire dans les substituts psoriasiques. Alors qu actuellement seule une tendance à une augmentation non significative de l acide arachidonique dans ces substituts peut être observée, une augmentation de l acide linoléique permettrait sans doute d obtenir cette fois des différences significatives entre les deux substituts et donc, par conséquent, un phénotype psoriasis encore plus marqué. 89

110

111 4. Conclusions 91

112 4.1. Conclusions par objectif Les substituts cutanés produits par la méthode d auto-assemblage développée au LOEX sont intéressants tant pour des applications en milieu clinique qu en recherche appliquée. En effet, le fait qu ils soient complètement autologues, sans matériel exogène, permet de réduire les risques de rejet lors d une greffe en plus d augmenter leur ressemblance avec la peau normale humaine. En outre, leur méthode de production est d autant plus intéressante qu elle permet d obtenir, en plus des substituts cutanés sains, des substituts cutanés ayant un phénotype psoriasique. Les substituts produits par cette méthode ont donc un potentiel pour des études dermopharmacologiques et de toxicité avec des produits destinés aux peaux saines, mais également avec des molécules ou des formulations ayant un potentiel pour le traitement du psoriasis. Toutefois, afin que ces études soient optimales, une bonne connaissance de l ensemble des caractéristiques des substituts produits de même que le développement de méthodes de conservation des substituts cutanés sont souhaitables. L objectif des études présentées dans ce mémoire était donc, dans un premier temps, d investiguer le potentiel de la congélation comme moyen de conservation des substituts cutanés sains sur une période de 2 mois ainsi que, dans un second temps, de caractériser les lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques. Pour ce 2 e objectif, deux comparaisons ont été effectuées, soit une première entre la composition lipidique des substituts sains et celle de la peau normale humaine et une seconde entre la composition lipidique des substituts sains et psoriasiques. Les conclusions suivantes, en lien avec les objectifs de départ, ont pu être tirées : 1) Les impacts d une congélation à -20 C sur certaines caractéristiques physicochimiques des substituts sains produits par auto-assemblage ont été analysés. Plus spécifiquement, la perméabilité de ces substituts à l acide benzoïque de même que l organisation des lipides de leur couche cornée ont été évaluées avant et après la période de congélation de 2 mois. Trois populations cellulaires saines ont été utilisées pour la production de substituts cutanés et trois biopsies de peau normale humaine ont été utilisées comme contrôles pour ces analyses. Les analyses de perméabilité ont été réalisées avec de l acide benzoïque radioactive et un système de cellules de type Franz afin de montrer que la congélation augmente la perméabilité des substituts cutanés. En effet, la quantité cumulée de molécule 92

113 ayant passé au travers des substituts frais et congelés en fonction du temps de même que le flux de cette molécule sont augmentés de façon significative entre 1h et 24h. Les mêmes analyses réalisées sur des biopsies de peau humaine n ont, quant à elles, pas montré de différences significatives tant au niveau de la quantité cumulée que du flux. L organisation lipidique de la couche cornée a également été investiguée par ATR-FTIR afin d évaluer l impact de la congélation sur cette organisation. La fréquence correspondant à l élongation asymétrique du groupement CH2 a été mesurée entre 28 et 80 C. Aucune différence significative n a été observée dans cet intervalle de températures, ni pour les substituts cutanés, ni pour les biopsies de peau humaine. Ces résultats montrent que la fonction barrière de la couche cornée des substituts cutanés est affectée par le processus de congélation même si l organisation de ses lipides n est pas perturbée de façon détectable. L ensemble de ces résultats permet de conclure que la congélation des substituts cutanés avec la méthodologie utilisée dans cette étude ne constitue pas une voie envisageable pour la conservation des substituts cutanés produits par la méthode d auto-assemblage. 2) La composition des lipides épidermiques des substituts sains et psoriasiques produits par la méthode d auto-assemblage a été analysée par chromatographie en phase gazeuse. Trois populations cellulaires saines et trois populations cellulaires psoriasiques ont été utilisées pour la production de substituts cutanés. La composition lipidique de l épiderme de trois biopsies de peau normale humaine a aussi été analysée. Deux différentes comparaisons ont été effectuées et ont permis de cibler des différences et ressemblances entre la composition lipidique des fractions phospholipides et triglycérides des échantillons. La première comparaison, effectuée entre les substituts sains et la peau normale humaine, a permis de montrer une diminution significative de la proportion d acide linoléique dans les substituts cutanés. Elle a également permis de montrer que la proportion d acides gras saturés et insaturés est conservée dans ces mêmes substituts. La deuxième comparaison, effectuée entre les substituts cutanés sains et psoriasiques, a permis de montrer une tendance à une accumulation de l acide arachidonique dans les phospholipides des substituts psoriasiques. Également, une augmentation significative des acides gras C :18 dans la fraction «Triglycérides» des substituts psoriasiques a pu être observée. L ensemble de ces résultats permet de conclure que nos substituts cutanés sains présentent des ressemblances avec la 93

114 peau normale humaine, mais ont une importante lacune au niveau de la quantité d acide linoléique. En raison de l importance de ce dernier et de ses métabolites dans la fonction barrière et dans l inflammation, il est souhaitable de pallier à ce manque. Cela permettra, nous l espérons, d augmenter la présence des marqueurs d inflammation et donc le phénotype psoriasique dans les substituts pathologiques Limitations La principale limitation de cette étude se trouve au niveau du nombre de réplicas et de la variation biologique entre les échantillons. En effet, afin d obtenir une meilleure puissance et donc possiblement davantage de résultats significatifs, il faudrait augmenter le nombre de populations cellulaires utilisées pour produire les substituts cutanés et le nombre de réplicas techniques pour chaque population. Une telle augmentation n est toutefois pas toujours possible d un point de vue technique. Du côté de la variation biologique, cette limitation reste en bonne partie hors de contrôle, le comportement des cellules et de leur processus de prolifération/différenciation étant bien souvent imprévisible Perspectives Les résultats de cette étude amènent plusieurs perspectives pour des travaux futurs. Tout d abord, l analyse de l impact de la congélation a permis de conclure que la méthode utilisée n était pas compatible avec nos substituts cutanés. De nouvelles méthodes de congélation des substituts devront donc être investiguées ou bien d autres alternatives envisagées. Une possibilité consiste à développer un calendrier de production de substituts cutanés en décalé afin d avoir des substituts frais disponibles en tout temps. Les résultats des analyses des lipides épidermiques, quant à elles, ont permis de cibler une lacune au niveau de la proportion d acide linoléique dans les substituts cutanés. Dans les travaux futurs, une supplémentation de cet acide dans le milieu de culture devrait donc être envisagé afin d augmenter la présence de ce dernier dans les substituts. Suite à cette modification du protocole de production des substituts, de nouvelles analyses des lipides épidermiques pourront être envisagées afin d évaluer l impact de la supplémentation sur les 94

115 substituts sains et psoriasiques. Également, une analyse des lipides spécifiques à la couche cornée serait pertinente afin d évaluer si les lipides diffèrent entre les substituts sains et pathologiques. Plus spécifiquement, la proportion du céramide EOS sera du plus grand intérêt en raison de son implication importante dans la fonction barrière. 95

116

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