Jean Pierre Siffroi Service d Histologie, Biologie de la Reproduction et Cytogénétique Hôpital Tenon, Paris

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1 Jean Pierre Siffroi Service d Histologie, Biologie de la Reproduction et Cytogénétique Hôpital Tenon, Paris

2 Population générale: 0,4% des individu ont un caryotype anormal Population des hommes infertiles: qq % à 10% des sujets présentent une anomalie du caryotype (x10 à 20) % variant principalement selon les chiffres du spermogramme pris en compte: plus ils sont bas, plus le risque augmente Consensus pour réaliser le caryotype en dessous de 10M spz/ml

3 Recherche des causes cytogénétiques d infertilité: intérêts multiples Connaissance fondamentale des gènes impliqués et de leur site d action nombre +++ Intérêt diagnostique pour les patients «utilité de connaître la raison de son infertilité» Intérêt pronostique pour les grossesses «l anomalie est-elle transmissible par AMP?»

4 Anomalies chromosomiques et spermatogenèse Anomalies de nombre Anomalies de structure Syndrome de Klinefelter Marqueurs chromosomiques Translocations Robertsoniennes Inversions Double Y Translocations réciproques

5 Syndrome de Klinefelter Syndrome de Klinefelter homogène 47, XXY Syndrome de Klinefelter en mosaïque 47, XXY/46,XY Azoospermie Oligozoospermie Fécondité naturelle? IAD Biopsie testiculaire Négative Positive ICSI Risque pour la descendance? IAD

6 Ségrégation théorique des gonosomes dans les gamètes X X Y X X Y XX XY XY 2 fois plus de spz 23, X que de 23, Y Autant de formes normales que de disomiques Formes disomiques 24, XY > 24, XX En fait, les formes disomiques ne dépassent pas les quelques % et des spz 24, YY sont retrouvés

7 X Y 18

8 Nécessité de vérifier le taux d aneuploïdies de façon individuelle lorsque c est possible 13 21

9 Hypothèse de l environnement testiculaire Spermatogonies XY Erreur en méïose I 24,XY 22, / 24,YY 24,XX Erreur en méïose II 23,X 23,Y Variabilité inter-individus très probable

10 Conduite à tenir pour la prise en charge d un sujet Klinefelter en AMP Oligozoospermie FISH sur spz possible Azoospermie BT et congélation des spz Evaluation du risque individuel ICSI «à l aveugle» Proposition de DPN voire de DPI

11 Double Y Phénotype normal mais fréquence augmentée chez les hommes infertiles Interactions possibles dans la formation de la vésicule sexuelle lors de l appariement en bivalents YY ou XY Elimination de l Y surnuméraire et gamètes normaux Marqueurs chromosomiques p q NORs Chromosomes acrocentriques 13, 14, 15, 21, 22 Pas de phénotype pathologique Intéractions de régions chromosomiques non appariées avec la vésicule sexuelle

12 Translocations Robertsoniennes Fréquence 8 à 10 plus grande chez les hommes infertiles

13 Tri 13 Tri 14 Fausses couches ou polymalformés ;14 Région d asynapsis et d interaction possible avec la vésicule sexuelle Blocage en méïose

14 Translocations réciproques

15 ou Trisomies et monosomies partielles pour les segments transloqués FCS ou polymalformés Point de cassure dans un gène majeur impliqué dans la gamétogenèse? Caractère aléatoire des translocations: QUOIQUE! Région d asynapsis Association avec la vésicule sexuelle Blocage en méïose par extension de l inactivation de l X aux segments autosomiques ou réactivation de l X

16 Etude Olesen et al. Mol. Hum. Reprod., 2001;7:11-20 Banques de données 14 testis expressed transcripts TETs TET1 TET2 TET11 TET7 265 cas de translocations réciproques chez des hommes infertiles 7 points de cassure chromosomique 6 points de cassure chromosomique 13 points de cassure chromosomique Homologue Tpx1 de rat (interactions cellules germinales - Sertoli) 3 points de cassure chromosomique

17 Inversions paracentriques A B C D E A B D C E A B C C D D E A B E Asynapsis Aneusomie de recombinaison chromosome dicentrique et blocage en méïose A B C D B A

18 En pratique: quand demander le caryotype d un homme infertile? Devant une azoospermie non obstructive ou une oligozoospermie < 10M spz/ml idiopathique La conduite à tenir dépendra ensuite de l anomalie dépistée

19 Bras court P 11.3 PAR1 Région pseudo-autosomale Centromère Bras long Q 11.2 Région euchromatique du bras long Zone Non recombinante NRY 12 Hétérochromatine PAR2 Région pseudo-autosomale 2

20 Premières images de caryotype après marquage en bandes: bandes Q par coloration à la quinacrine Forte fluorescence de la région hétérochromatique Polymorphisme ++ et observation de chromosomes Y non-fluorescents

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22 23 Mb 8 Mb 14,5 Mb ~ 40 Mb 1 Mb 400 Kb Recombinaisons intra-chromosomiques très fréquentes NRY (Non Recombining Y) devient MSY (Male Specific Y)

23 Autre particularité des régions «ampliconic» = existence de 8 palindromes massifs couvrant 5,7 Mb, soit un quart de MSY Identité bras à bras de 99,94% à 99,997% Taille des bras de 9 kb à 1,45 Mb Palindromes imparfaits: existence d un segment central non dupliqué

24 Au total: La région MSY renferme 156 unités de transcription dont la moitié code pour des protéines. Parmi ces 78 gènes, 60 appartiennent à des familles (9) et 18 sont en copie unique, le tout pour 27 protéines ou familles de protéines dont 11 sont exclusivement ou préférentiellement exprimées dans le testicule. Parmi les 78 restantes, non transcrites, 13 sont en copie unique et 65 se répartissent en 15 familles différentes

25 Chromosome Y et fertilité P Q H Délétion Yq ter Iso Yp Iso dic Yp t(y;a) r(y) Y normal Infertilité par perte d une partie plus ou moins importante de la partie proximale du bras long (Facteur AZF) Description par Tiepolo et Zuffardi (1976) de chromosomes Y non fluorescents (cf bandes Q) chez 6 patients azoospermiques

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27 SRY SRY X La fréquence des iso-dicentriques (Yp) est probablement sous-estimée chez les hommes infertiles

28 % à 15% des hommes présentant une azoospermie ou oligozoospermie extrême de nature non obstructive sont porteurs d une délétion moléculaire dans les intervalles 5 ou 6 Perte de gènes constituant le facteur AZF Caractère non chevauchant de ces microdélétions 6 3 loci AZF 7 AZFa intervalle 5 SCO AZFb intervalles 5-6 Arrêt en méïose AZFc intervalle 6 phénotype variable

29 Plusieurs questions Fréquence des microdélétions chez les hommes infertiles Mécanismes d apparition et types de microdélétions Existence de mosaïques germinales Stabilité des chromosomes Y délétés

30 Fréquence des microdélétions du chromosome Y chez les hommes infertiles Etude collaborative avec l Institut Pasteur (1996) 131 patients 83 azoospermies 39 oligozoospermies sévères 7 oligozoospermies modérées 2 asthénozoospermies 46 infertilités idiopathiques 85 infertilités avec facteur causal identifiable

31 Etude en aveugle par PCR avec 22 marqueurs STS couvrant les 3 locus AZF 21 délétions retrouvées (16%) 7 délétions terminales visibles au caryotype (mosaïque 45,X associées +++) 14 délétions moléculaires 9 chez les patients azoospermiques ou oligozoospermiques idiopathiques (19%) 5 chez les patients avec facteur causal autre (7%)

32 Gènes impliqués dans le phénotype et mécanisme d apparition des microdélétions L exemple d AZFa centromère HERV15 USP9Y 1 mutation ponctuelle décrite Azoospermie mais pas SCO Recombinaison homologue HERV15 DBY UTY SCO dans les délétions car perte conjointe d USP9Y et de DBY Excision, délétion

33 HERV15 HERV15 HERV15 Mécanisme plus vraisemblable: recombinaison homologue non allélique entre chromatides soeurs HERV15 HERV15 HERV15 HERV15

34 Nature Genetics, 2001, 29,

35 L origine des séquences palindromiques requiert des événements chromosomiques liés à la fréquence importante des recombinaisons dans MSY recombinaison aboutissant à des duplications en tandem (par l intermédiaire de séquences Alu) inversion du segment dupliqué: retournement et formation d un palindrome

36 823 patients avec une infertilité idiopathique de nature non obstructive: 54 délétions «classiques» AZFc étudiés au niveau moléculaire 47 délétions b2/b4

37 Des recombinaisons entre palindromes sont également responsables des délétions AZFb et AZFb+c P5/P1 proximal: AZFb 6,2 Mb - 32 gènes P5/P1 distal: AZFb+c 7,7 Mb - 42 gènes Les locus AZFb et c se chevauchent Il s agit des plus grandes délétions interstitielles définies au niveau moléculaire

38 Délétions AZF = infertilité Apparition de novo chez des sujets dont les pères ont un Y normal Jamais rencontrées chez les contrôles normospermiques (Attention au polymorphisme des STS utilisés) Quelques descriptions de transmission familiale pour des délétions d AZFb et d AZFc (Rôle de l âge comme facteur aggravant?) Existe t il des délétions agissant comme de simples facteurs de prédisposition au développement d une infertilité?

39 L organisation en palindromes d AZFc laisse prévoir d autres types de délétions 689 hommes 22 délétions gr/gr Polymorphisme?

40 L organisation en palindromes d AZFc laisse prévoir d autres types de délétions 689 hommes 22 délétions gr/gr et 1 délétion b1/b3

41 Les délétions gr/gr favoriseraient d autres recombinaisons 22 délétions gr/gr confirmées en FISH: 2 associées à une duplication b2/b4!

42 D2b Equilibre entre la disparition des délétions gr/gr par sélection et leur survenue par recombinaison (événement répété 14 fois au cours de l histoire)

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44 Stabilité mitotique des chromosomes Y porteurs de microdélétions Iso Yp r(y) Anomalies de structure de l Y: association très fréquente avec un clone 45,X Iso dic Yp Délétion Yq ter Même observation pour les grandes délétions terminales La même instabilité est-elle rencontrée dans les chromosomes Y porteurs d une microdélétion? Conséquences pour la pratique de l ICSI

45 Etude de 14 patients porteurs d une délétion du bras long de l Y Groupe 1: 6 patients tous azoospermiques Mosaïque détectable au caryotype Groupe 2: 8 patients azoospermiques (4) ou oligozoospermiques (4) Caryotype 46,X,del(Y) homogène % de cellules 45,X de 24% à 82% Etude en FISH avec sondes centromériques X et Y dans les lymphocytes % de cellules 45,X de 0% à 9,3% (contrôles: 0,34%)

46 Etude en FISH sur spermatozoïdes chez 3 des 4 patients oligozoospermiques La diminution des spermatozoïdes Y/18 et l augmentation des formes nullisomiques pour l X et l Y prouvent que ces spermatozoïdes proviennent de cellules 45,X ou que le chromosome Y a été perdu pendant la spermatogenèse

47 Conséquences de l instabilité des Y délétés sur la descendance des hommes traités par ICSI Spermatozoïde fécondant nullisomique pour l X et l Y Syndrome de Turner homogène Spermatozoïde fécondant Y mais Y instable Mosaïque constitutionnelle 45,X/46,X,del(Y) survenant avant la détermination du sexe Syndrome de Turner Ambiguités sexuelles Garçon normal Patientes Turner en mosaïque 45,X/46,XY +30% de chromosomes Y délétés! (Patsalis et al. Lancet 2002;360: )

48 En pratique: Toujours commencer par le caryotype (5ml sur héparine, consentement) Rechercher les microdélétions dans les oligozoospermies sévères (< 2M) ou les azoospermies idiopathiques (+ si recherche) Prise de sang 10ml EDTA, consentement Conseil génétique sur les conséquences du diagnostic FISH sur spermatozoïdes chez les oligozoospermiques (et sur biopsie testiculaire chez les azoospermiques) DPN?