abc 1Ann Biol Clin 2009 ; 67 (1) : 7-21

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1 Abstract. Background. Plasma concentrations of HDL cholesterol (HDL-C) and its major protein component apolipoprotein (Apo) A-I are strongly inversely associated with cardiovascular risk, leading to the concept that therapy to increase HDL-C and ApoA-I concentrations would be antiatherosclerotic and protective against cardiovascular events. The recent failure of the drug torcetrapib, a cholesteryl ester transfer protein inhibitor that substantially increased HDL-C concentrations, has brought focus on the issues of HDL heterogeneity and function as distinct from HDL-C concentrations. Content. This review addresses the current state of knowledge regarding assays of HDL heterogerevue générale abc 1Ann Biol Clin 2009 ; 67 (1) : 7-21 Evaluation au laboratoire de l hétérogénéité et des fonctions des HDL (version française) Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function doi: /abc R. Movva D.J. Rader Tirés à part : J.-L. Beaudeux Résumé. Les concentrations plasmatiques du cholestérol des HDL (HDL-C) et de leur protéine majoritaire, l apolipoprotéine (ApoA-I), sont inversement associées au risque cardiovasculaire, ce qui a conduit au concept qu un traitement visant à augmenter le HDL-C et l ApoA-I pourrait constituer une thérapeutique anti-athéroscléreuse et protectrice contre les évènements cardiovasculaires. Les résultats négatifs obtenus récemment avec le torcetrapib, un inhibiteur de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) qui augmente significativement les concentrations plasmatiques de HDL-C, ont focalisé l attention de la communauté scientifique sur la différence existant entre les concentrations de HDL-C d une part, et l hétérogénéité et les fonctions qualitatives des HDL, d autre part. Cet article analyse l état actuel des connaissances concernant l hétérogénéité des HDL et leurs fonctions, en relation avec la maladie cardiovasculaire. Les HDL sont très hétérogènes : plusieurs sous-fractions peuvent être identifiées sur la base de leur densité, de leur taille, de leur charge et de leur composition protéique. L hypothèse que certaines sous-fractions de HDL pourraient être de meilleurs prédicteurs du risque cardiovasculaire est séduisante. De plus, les HDL possèdent diverses fonctions qui pourraient contribuer à leur effet cardioprotecteur ; parmi celles-ci, la prise en charge de l efflux du cholestérol des macrophages et le transport inverse du cholestérol, les propriétés anti-inflammatoires et stimulatrices de la formation de monoxyde d azote ont été particulièrement étudiées. L importance pour les cliniciens de l évaluation des sous-fractions de HDL et de leurs fonctions impose de mettre à la disposition des biologistes des méthodes validées et applicables en routine de l exploration fine des HDL au niveau plasmatique. Mots clés : HDL, sous-fraction, risque cardiovasculaire, hétérogénéité, fonction, dosage Cet article est initialement paru sous la référence : Movva R, Rader DJ. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem 2008 ; 54 : Il est reproduit en langue française dans les Annales de biologie clinique (Paris) dans le cadre d un partenariat entre la SFBC et l IFCC pour favoriser la diffusion d articles bibliographiques majeurs dans le domaine de la biologie clinique. Traduction : J.-L. Beaudeux, D. Bonnefont-Rousselot <jean-louis.beaudeux@parisdescartes.fr>. Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février

2 revue générale neity and function and their relationship to cardiovascular disease. HDL is highly heterogeneous, with subfractions that can be identified on the basis of density, size, charge, and protein composition, and the concept that certain subfractions of HDL may be better predictors of cardiovascular risk is attractive. In addition, HDL has been shown to have a variety of functions that may contribute to its cardiovascular protective effects, including promotion of macrophage cholesterol efflux and reverse cholesterol transport and antiinflammatory and nitric oxide-promoting effects. Summary. Robust laboratory assays of HDL subfractions and functions and validation of the usefulness of these assays for predicting cardiovascular risk and assessing response to therapeutic interventions are critically important and of great interest to cardiovascular clinicians and investigators and clinical chemists. Key words: HDL, subfraction, cardiovascular risk, cholesterol, heterogeneity, function, measurement Le nombre d infarctus du myocarde est estimé à 1,2 million/an aux États-Unis [1]. L effet bénéfique de thérapeutiques qui permettent la diminution du cholestérol des LDL (LDL-C) plasmatiques [2], en particulier par les statines, a été démontré à la fois en prévention primaire et en prévention secondaire. Malgré cet effet bénéfique antiathérogène des statines, un risque résiduel subsiste. Les études épidémiologiques et prospectives randomisées ont démontré de façon nette une relation inverse entre les concentrations plasmatiques HDL-cholestérol (HDL-C) et les pathologies cardiovasculaires [2]. Dans l étude de Framingham, une augmentation du HDL-C de 10 mg/dl (0,26 mmol/l) conduisait à une diminution significative du risque relatif de mortalité cardiovasculaire de 19 % chez les hommes et 28 % chez les femmes [3]. La prévalence de faibles concentrations de HDL-C, définies par les recommandations du programme national d éducation du cholestérol dans le traitement de l adulte (NCEP ATPIII), à savoir moins de 40 mg/dl ( 1,04 mmol/l) chez l homme et moins de 50 mg/dl ( 1,30 mol/l) chez la femme [4], était de 66 % dans les populations à haut risque de pathologie cardiovasculaire qui étaient sous statines, quelle que soit leur concentration de LDL-C [5]. L analyse post hoc de Barter et al. [6] des résultats de l étude Treating to New Targets, a montré que le HDL-C est un facteur prédictif significatif des événements cardiovasculaires majeurs, même dans les groupes de sujets ayant des concentrations de LDL-C inférieures à 70 mg/ dl (1,81 mmol/l). Une concentration plasmatique faible de HDL-C a donc été démontrée comme étant prédictive d un risque cardiovasculaire, même chez des patients traités par des statines. Malgré le nombre extrêmement important d études observationnelles ayant démontré une relation inverse entre le HDL-C ou les concentrations d ApoA-I et le risque cardiovasculaire, l absence de données consistantes d études interventionnelles posent la question de l intérêt de la détermination des concentrations de HDL-C et d ApoA-I en tant qu indicateur de cause du risque d athérosclérose. Certains syndromes d origine génétique associés à une faible concentration de HDL-C et d ApoA-I n apparaissent pas clairement associés avec un risque accru de pathologie cardiovasculaire précoce. Par exemple, un déficit en lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT) plasmatique ne semble pas augmenter le risque cardiovasculaire malgré des concentrations plasmatiques de HDL-C inférieures à 15 mg/dl (< 0,39 mmol/l) [7]. De même, les sujets hétérozygotes pour la mutation Milano sur le gène de l ApoA-I ne développent pas d athérosclérose précoce malgré des concentrations de HDL-C inférieures à 20 mg/dl (0,52 mmol/l) [8] ; cette observation a également été faite pour la mutation Paris du même gène de l ApoA-I [9]. De même, les mutations sur le gène du transporteur ABCA1 (ATP-binding cassette A1), à l origine de la maladie de Tangier, sont accompagnées de concentrations quasi indétectables de HDL-C et d ApoA-I, mais ne sont pas associées à une augmentation significative de pathologies cardiovasculaires telle que l on pourrait l attendre d un tel phénotype [10]. Il faut noter que les patients ayant un déficit en LCAT et les patients atteints de la maladie de Tangier ont très souvent des concentrations faibles de LDL-C, ce qui pourrait constituer un facteur de compensation par rapport aux faibles concentrations de HDL-C [7, 10]. Ces anomalies génétiques sont toutes associées à une augmentation significative du turn over des HDL, ce qui explique que des mesures ponctuelles seraient moins informatives que les études dynamiques de leur métabolisme [11]. Quoi qu il en soit, ces pathologies illustrent à quel point la mesure 8 Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février 2009

3 HDL heterogeneity and function unique de la masse de HDL n est pas toujours associée à l évaluation du risque cardiovasculaire. Les résultats des études interventionnelles randomisées ciblées sur les HDL ont entretenu la complexité de l évaluation du risque lié aux HDL. Les fibrates et les agonistes du récepteur PPAR-α ont des effets modestes sur l augmentation du HDL-C plasmatique chez l homme, mais les résultats sur la diminution du risque cardiovasculaire sont mitigés. Ainsi, la Helsinki Heart Study [12] et l étude interventionnelle VA-HIT (Veterans Affairs High- Density Lipoprotein Intervention Trial) [13] ont suggéré un effet cardioprotecteur des fibrates. L étude VA-HIT était spécifiquement ciblée sur les sujets de sexe masculain ayant une faible concentration de HDL-C, et elle représente l un des meilleurs exemples de l augmentation du HDL-C par voie pharmacologique, bien que cette augmentation ait été faible et que le bénéfice cardiovasculaire ne puisse y être directement associé. D autres études sur les fibrates telles que la Bezafibrate Infarction Prevention Trial [14] et la Fenofibrate Intervention and Event- Lowering in Diabetes study [15], ont fourni des résultats décevants, même si elles ont pu suggérer un effet bénéfique de l augmentation du HDL-C. L acide nicotinique (niacine) est la molécule la plus efficace actuellement commercialisée pour augmenter le HDL-C, mais les études ayant démontré un effet clinique bénéfique [16, 17] ont été obtenues avant la généralisation des traitements par les statines, et le bénéfice clinique de l acide nicotinique par rapport à ces dernières n apparaît pas significativement supérieur. Certaines études d imagerie, mesurant l épaisseur intima-média (EIM) [18] ou utilisant l angiographie coronarienne [19] ont suggéré un effet bénéfique de l addition de l acide nicotinique à un traitement par une statine. Une méta-analyse des essais cliniques utilisant l ultrasonographie intravasculaire a suggéré que les modifications de volume des plaques athéromateuses étaient associées aux modifications du HDL-C plasmatique [20], ce qui a renforcé l idée que les interventions pharmacologiques pour augmenter le HDL plasmatique pourraient être bénéfiques. L expérience du torcetrapib, un inhibiteur de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP), a profondément remis en question cet intérêt de l augmentation des concentrations de HDL-C dans le but de diminuer le risque cardiovasculaire. Grâce à la capacité du torcetrapib d augmenter significativement le HDL-C, de 50 à 100 % [21, 22], des essais cliniques de phase III utilisant cette molécule ont été mis sur pied. Cependant, la très grande étude clinique Investigation of Lipid Level Management to Understand its Impact in Atherosclerotic Events a été interrompue de façon prématurée en raison d une augmentation de la morbidité cardiovasculaire et de la mortalité totale, malgré l observation d une augmentation du HDL- C de 72 % chez les sujets traités [23]. De plus, les études d imagerie utilisant l ultrasonographie intravasculaire [24] et l ultrasonographie carotidienne pour mesurer l EIM [25] n ont pas révélé d effets positifs du médicament sur les vaisseaux malgré une augmentation similaire du HDL- C. Cependant, l interprétation des résultats cliniques avec le torcetrapib est rendue plus complexe par le fait que cette molécule augmente la pression artérielle et la sécrétion d aldostérone, effet indésirable dont le mécanisme n est pas connu [26]. En effet, un autre inhibiteur de la CETP, l anacetrapib, est capable d augmenter le HDL-C plasmatique de façon plus importante que le torcetrapib (jusqu à 128 %) sans aucun effet sur la pression artérielle [27]. Néanmoins, l expérience du torcetrapib semble indiquer de façon nette que les mesures thérapeutiques uniquement basées sur l augmentation du HDL-C n apparaissent pas appropriées pour assurer une réduction du risque cardiovasculaire. Des progrès récents ont été réalisés pour assurer le dosage fiable du HDL-C et l évaluation qualitative des sousclasses de HDL [28, 29]. A la lumière de ces développements analytiques récents, il est maintenant important d identifier d autres sous-classes et fonctions des HDL, et de trouver de nouveaux marqueurs biologiques, meilleurs prédicteurs du risque cardiovasculaire, et qui pourraient être utilisés pour valider l intérêt de nouvelles thérapeutiques ciblées sur les HDL. Bien sûr, cela impose pour les biologistes de développer et valider des méthodes analytiques de dosage de ces marqueurs biologiques. En plus d être une source pour de nouveaux marqueurs du métabolisme du cholestérol, les HDL ont des fonctions pleïotropes qui incluent des effets anti-inflammatoires, anti-oxydants, anti-thrombotiques, et favorisant la libération de monoxyde d azote. Cet article de revue s attache à présenter des méthodes permettant d évaluer in vitro les sous-fractions de HDL et les fonctions des HDL qui pourraient se substituer aux marqueurs actuels pour mieux apprécier le risque cardiovasculaire. Avancées récentes dans la compréhension du métabolisme des HDL et du transport inverse du cholestérol La régulation moléculaire du métabolisme du HDL et du transport inverse du cholestérol est complexe (figure 1). Plusieurs excellentes revues [30-32] font le point sur les données actuelles de ce métabolisme. L ApoA-I est la protéine majoritaire des HDL présente dans la quasi-totalité des particules de type HDL. Elle est synthétisée à la fois au niveau hépatique et au niveau intestinal. L ApoA-I est Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février

4 Les HDL sont des macromolécules complexes constituées de lipides (phospholipides et cholestérol non estérifié en surface, cholestérol estérifié et triglycérides en profondeur) et protéines (apolipoprotéines et autres protéines en plus faible quantité). De nombreuses sous-fractions de HDL peuvent être identifiées dans le plasma, sur la base de leur différence de densité, de taille, de charge électrique ou de composition chimique. Il est particulièrement intéressant de savoir à quel point certaines sousfractions de HDL pourraient présenter une plus grande capacité à prévoir le risque cardiovasculaire que la déterrevue générale sécrétée sous la forme d une lipoparticule très pauvre en lipides qui acquiert rapidement des phospholipides et du cholestérol non estérifié des mêmes tissus qui ont permis sa synthèse, via le transporteur ABCA1, pour former les particules discoïdales de HDL [33]. Ces HDL naissantes se chargent en cholestérol libre provenant d autres tissus périphériques ; ce cholestérol est ensuite estérifié en cholestérol estérifié (CE) par la LCAT, enzyme associée aux HDL, générant ainsi les HDL sphériques. La CETP transfère le CE des HDL aux lipoprotéines portant l ApoB en échange de triglycérides. La lipase hépatique et la lipase endothéliale hydrolysent les triglycérides et les phospholipides des HDL, induisant la formation de particules de HDL de plus petite taille. L ApoA-I présente dans les HDL matures est catabolisée par le foie, alors que celle retrouvée dans les lipoparticules pauvres en lipides est catabolisée au niveau rénal. Les HDL sont des acteurs majeurs du processus connu sous le nom de transport inverse du cholestérol, au cours duquel le cholestérol non estérifié des tissus périphériques est récupéré par les HDL, afin de retourner au niveau du foie pour une excrétion biliaire et une élimination dans les fécès. Le transport inverse du cholestérol est un mécanisme physiologique important mais son implication dans la protection contre la maladie athéroscléreuse, et donc celle des HDL, mérite encore d être définitivement prouvée. La cellule macrophagique est le type cellulaire le plus important pour participer à l efflux de cholestérol, et Intestine BA FC FG CE SR-BI Liver LDLR PLTP Feces BA, FC A-I LCAT HL, EL CETP ABCG1 A-I FC LXR FC FC ABCA1 A-II Macrophage la régulation moléculaire de cet efflux à partir des macrophages a été particulièrement étudiée. Le transporteur ABCA1 est un élément contributif dans l efflux du cholestérol des macrophages vers les lipoparticules d ApoA-I pauvres en lipides qui servent d accepteur. Un autre membre de cette famille, ABCG1, codé par le gène ABCG1, favorise l efflux du cholestérol des macrophages vers les HDL matures. L expression de ABCA1 et ABCG1 est régulée positivement par le récepteur X nucléaire hépatique (LXR), qui est activé par les oxystérols, produits du métabolisme macrophagique du cholestérol. Afin de terminer le processus de transport inverse du cholestérol, à l issue de l efflux du cholestérol des tissus périphériques, le cholestérol doit être capté par le foie selon deux voies majeures : la voie des récepteurs Scavenger de type B1 (SR-BI) cette voie est particulièrement importante chez les rongeurs qui sont naturellement déficients en CETP et la voie de la CETP qui assure le transfert des esters de cholestérol vers les lipoprotéines contenant de l ApoB qui sont ensuite captées par le foie. Cette voie est particulièrement importante chez l homme pour la capture du cholestérol estérifié issu des HDL. L efflux du cholestérol et son transport inverse par les HDL sont les mécanismes majeurs par lesquels les HDL assurent une protection contre l athérosclérose, mais d autres propriétés de ces lipoparticules ont été mises en évidence ces dernières années qui participent également à l athéroprotection des HDL. Ces propriétés sont notamment des effets anti-oxydants et anti-inflammatoires [34], ainsi qu une action antithrombotique et initiatrice de la production endothéliale de monoxyde d azote NO [35]. Ainsi, le concept selon lequel les particules HDL possèdent des fonctions pléïotropes contre l athérosclérose, qui ne sont pas nécessairement révélées par la simple mesure de la concentration du HDL-C, a favorisé l intérêt d évaluer les sous-fractions de HDL et leurs fonctions pour définir plus précisément le risque associé au HDL. B CE TG VLDL/LDL Hétérogénéité des HDL et mesure des sous-fractions de HDL Figure 1. L ApoA-I est synthétisée par l intestin et le foie formant des lipoparticules HDL naissantes par captation des molécules lipidiques. Les HDL naissantes favorisant l efflux du cholestérol des macrophages via ABCA1 ; les HDL matures le réalisent via ABCG1. Le cholestérol est estérifié en cholestérol estérifié (CE) au niveau plasmatique ; le cholestérol libre (FC) et le CE sont transportés au niveau hépatique soit directement par SR-BI soit indirectement par des lipoprotéines contenant l ApoB via la CETP. Le contenu des HDL est modifié en permanence par la lipase hépatique (HL, la lipase endothéliale (EL) et la protéine de transfert des phospholipides (PLTP). BA : acides biliaires. FC : cholestérol libre. A-I : apolipoprotéine A-I. A-II : apolipoprotéine A-II. LXR : récepteur X hépatique. LDR : récepteur des LDR. TG : triglycérides. 10 Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février 2009

5 HDL heterogeneity and function mination du HDL-C, et à permettre une meilleure évaluation des études interventionnelles ciblées sur les HDL. Les patients atteints de maladie coronarienne ont généralement des HDL plus petites et plus denses, suggérant que les HDL de plus grande taille assurent une plus grande protection contre la maladie cardiovasculaire. Cependant, les données indiquant la capacité de sous-classes de HDL à prédire le risque cardiovasculaire ne sont pas apparues concluantes. La méthode classique de séparation des fractions de lipoprotéines est basée sur leurs différences de densité. En 1951 Lindgren et al. ont pour la première fois identifié deux sous-classes de HDL par ultracentrifugation analytique, sur la base de leur flottabilité [36]. Les HDL 2, qui ont une densité comprise entre 1,063 et 1,125 g/ml, sont constituées de particules de grande taille et riches en cholestérol ; les HDL 3, de densité comprise entre 1,125 et 1,210 g/ml, sont des petites particules pauvres en lipides. Havel et al. ont décrit pour la première fois la séparation des lipoprotéines par ultracentrifugation séquentielle, utilisant l augmentation progressive de la densité saline [37]. Les fractions lipoprotéiniques ainsi obtenues ont été divisées selon les groupes de densité suivants : < 1,019, 1,019-1,063, et >1,063 g/ml ; ces différents groupes ont ensuite été respectivement nommés VLDL (very low density lipoproteins), LDL (low density lipoproteins), et HDL (high density lipoproteins). Même après 50 ans, l ultracentrifugation par gradient de densité est toujours la méthodologie de choix et de référence pour l isolement des lipoprotéines. Des méthodes plus simples telles que l utracentrifugation préparative [38] ou la précipitation sélective ont par la suite été développées. L ultracentrifugation préparative permet d obtenir la sous-fraction HDL 3 de façon directe après une simple étape à la densité de 1,125 g/ml ; la sous-fraction HDL 2 est ensuite calculée par différence à partir des HDL totales et de la sousfraction HDL 3. La précipitation sélective des sousclasses HDL 2 et HDL 3 a été développée en tant que méthode analytique moins astreignante [39] ; elle a l avantage de ne nécessiter aucun appareillage spécialisé et peut être appliquée à des séries d échantillons traités simultanément [40]. La question majeure est de savoir si la séparation des sous-fractions de HDL selon leur densité peut fournir une information plus importante que le simple dosage du HDL-C pour l évaluation du risque cardiovasculaire. Une controverse existe encore pour savoir si l effet antiathérogène des HDL peut être attribué à une ou plusieurs des sous-fractions de HDL et quelle est l importance relative du cholestérol porté par les HDL 2 ou les HDL 3. Dans les études Kupio [41] et Quebec City Suburbs Study [42], la fraction HDL 2 a été retrouvée inversement corrélée avec l existence d une pathologie cardiovasculaire. La fraction HDL 3 présentait une association inverse plus importante avec des pathologies cardiovasculaires dans la Physician s Health Study [43], dans l étude CAE Philly and Speedwell de suivi sur cinq ans [44], et dans l étude Caerphilly de suivi sur neuf ans [45]. Les résultats de ces études n apportent donc aucune preuve de l intérêt de la détermination en routine des sous-fractions de HDL dans un objectif d évaluation graduelle du risque de pathologie cardiovasculaire. Les résultats discordants de ces multiples études peuvent être attribués à l utilisation de méthodologies analytiques différentes, à des différences ethniques des populations, ou à la probable hétérogénéité des sous-fractions, en relation avec des fonctions physiologiques différentes. La technique d ultracentrifugation en gradient de densité vertical VAP (Vertical Auto Profile) est une technique d ultracentrifugation qui permet la séparation de toutes les lipoprotéines en moins d une heure [46]. L analyse VAP permet une séparation très rapide des lipoprotéines en utilisant un rotor vertical, les lipoprotéines étant séparées selon l axe horizontal plus court du tube d ultracentrifugation et non pas verticalement, comme c est le cas dans l ultracentrifugation séquentielle qui fait généralement appel à un swinging rotor. Cette méthode est un test sensible pour la mesure des sous-classes de HDL. Cependant, peu de données existent à ce jour concernant les sous-fractions de HDL déterminées par la méthode VAP et le risque cardiovasculaire. La méthode VAP, propriété de la société Atherotech, est réservée aux laboratoires spécialisés référents. Les sous-fractions de HDL peuvent également être séparées en fonction de leur taille. La méthode originale par électrophorèse en gel utilisant un gradient de polyacrylamide et en conditions non dénaturantes (GGE) associe également la densitométrie automatisée [47]. Une revue détaillée de cette méthodologie à été publiée récemment [48]. Bien que les méthodes soient maintenant éprouvées et reproductibles, peu de données existent concernant les sous-classes de HDL déterminées par GGE et la capacité à mieux prédire les pathologies cardiovasculaires que les concentrations plasmatiques de HDL-C. La GGE développée par la société Berkeley Heart Laboratories, est disponible. La charge électrique est une autre propriété importante qui permet la séparation des sous-classes de HDL. L électrophorèse des lipoprotéines en conditions non dénaturantes a été utilisée depuis longtemps comme une technique classique pour la séparation analytique des lipoprotéines, et les HDL migrent pour former la bande α des lipoprotéinogrammes. La séparation des HDL par électrophorèse bidimensionnelle (incluant une séparation basée sur la charge et une séparation basée sur la taille des lipoparticules) a montré une plus grande hétérogénéité, incluant des HDL migrant en pré-β-1, pré-β-2 et pré-α, en complément des Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février

6 revue générale lipoparticules migrant en position α [49]. L électrophorèse bidimensionnelle a permis de séparer au moins 12 souspopulations de HDL contenant l ApoA-I. Une corrélation négative statistiquement significative a été également observée entre les lipoparticules HDL de type α-1, riches en cholestérol et de grande taille, et la maladie cardiovasculaire [50]. Dans l étude de Framingham [51], les cas de maladie cardiovasculaire étaient associés à une augmentation des sous-classes de HDL pré-β-1 et α-3, et à une concentration plus faible des sous-classes α-1, pré-α-3 et pré-α-1. Les concentrations α-1 et pré-α-3 étaient reliées de façon inverse alors que les concentrations de lipoparticules α-3 et pré-α-1 avaient une association positive avec la prévalence de maladies cardiovasculaires, après ajustement des données sur les marqueurs de risques cardiovasculaires habituels. Les HDL α-1 étaient plus fortement reliées à la maladie cardiovasculaire, chaque augmentation de 1 mg/dl (0,03 mmol/l) des HDL α-1 entraînant une diminution du risque relatif de maladies cardiovasculaires de 26 % (P < 0,0001). De telles corrélations significatives et négatives ont également été observées dans l étude HDL Athérosclerosis Treatment Study [50] et l étude VA-HIT [50, 52]. Inversement, l étude VA-HIT a démontré une corrélation positive entre les événements cardiovasculaires et les concentrations des sous-classes α-3 et β-1 des lipoparticules de petite taille et peu riches en lipides [52]. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est une autre méthode rapide pour l évaluation des sous-fractions de HDL [53]. Chaque sous-classe de HDL émet des signaux RMN différents, dont l amplitude individuelle peut être précisément mesurée ; ces amplitudes sont directement proportionnelles au nombre de particules de chaque sous-classe émettant le signal, indépendamment de la variation de composition lipidique de la lipoparticule. Ainsi les particules de HDL quantifiées par RMN peuvent être classées en trois tailles : grandes, moyennes et petites. Les données actuellement disponibles indiquent une relation entre les sous-classes de HDL déterminées par RMN et le risque cardiovasculaire. Dans l essai interventionnel Pravastatin Limitation of Atherosclerosis in the Coronary Arteries [54], les concentrations de particules HDL de grande taille et de petite taille ont été retrouvées inversement corrélées avec la progression de la maladie artérielle coronarienne mise en évidence par angiographie, indépendamment de la concentration plasmatique du HDL-C et des autres lipides. Dans l essai VA-HIT [55], les concentrations des particules de HDL totales et petites déterminées par RMN, se sont avéré être des prédicteurs indépendants d événements cardiovasculaires secondaires. Dans l essai MultiEthnic Study of Atherosclerosis, le nombre total de particules de HDL était significativement associé avec l athérosclérose carotidienne et de façon plus importante que le HDL-C [56]. Cependant, une récente étude ayant analysé l association du HDL-C et de la taille des particules déterminée par RMN avec le risque cardiovasculaire après ajustement de l ApoA-I et de l Apo B [57] a montré des résultats inattendus. Bien que les concentrations de HDL-C et la taille des particules HDL soient généralement inversement corrélées avec le risque cardiovasculaire, les plus fortes concentrations de HDL-C et la taille de particules des HDL ont été retrouvées associées positivement avec les événements cardiovasculaires, après correction par les valeurs d ApoA-I et d ApoB. L analyse des lipoprotéines par RMN est diffusée par la société Liposciences. Composition des HDL en apolipoprotéines et autres protéines La protéine la plus abondante des HDL, l ApoA-I peut être mesurée au niveau plasmatique par de nombreuses méthodologies. L intérêt de la concentration plasmatique d ApoA-1 pour une meilleure prédiction de la maladie cardiovasculaire comparativement au HDL-C est une question importante, en raison de la corrélation très étroite entre l ApoA-I et le HDL-C. Néanmoins, plusieurs études prospectives réalisées sur de larges cohortes ont suggéré que les concentrations d ApoA-I sont plus prédictives d une maladie cardiovasculaire future que les concentrations de HDL-C [58]. De plus, après correction des données par le HDL-C, les concentrations plasmatiques d ApoA-I restaient inversement corrélées avec le risque cardiovasculaire [57]. Il est donc possible que les concentrations d ApoA-I aient un pouvoir prédictif de risque cardiovasculaire supérieur au HDL-C, mais cette notion n a pas encore été prise en compte dans les recommandations nationales. Signalons enfin que de nouvelles stratégies d intervention thérapeutique qui augmentent les concentrations d ApoA-I peuvent avoir un effet supérieur à celles qui augmentent le HDL-C, mais cette supériorité reste à ce jour théorique et mérite d être confirmée. La seconde protéine la plus abondante dans les HDL est l ApoA-II, et les données concernant cette protéine dans le risque cardiovasculaire restent contradictoires. Une étude de cas contrôle ancillaire de la grande étude European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition in Norfolk a démontré que les concentrations d ApoA-II sont très étroitement et inversement corrélées aux événements cardiovasculaires même après ajustement par les risques cardiovasculaires traditionnels, le HDL-C et l ApoA-I [59]. Ces résultats viennent contredire les études réalisées in vivo chez la souris [60] montrant que l ApoA- II peut avoir un effet pro-athérogène, qui n a donc pas été mis en évidence chez l homme. 12 Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février 2009

7 HDL heterogeneity and function Les HDL peuvent être séparées en deux sous-classes primaires selon la composition de leurs apolipoprotéines majoritaires : les HDL contenant uniquement de l ApoA- I (LpA-I) et celle contenant à la fois de l ApoA-I et de l ApoA-II (LpA-I :A-II) [61, 62]. Dans la population générale, la LpA-1 correspond approximativement à un tiers et la LpA-1 :A-II approximativement à deux tiers des HDL totales [63]. Les lipoparticules de type LpA-I sont principalement retrouvées au sein des HDL 2, alors que les lipoparticules LpA-I :A-II sont préférentiellement retrouvées au niveau des HDL 3 [64]. La valeur prédictive de ces lipoparticules dans la maladie cardiovasculaire est très discutée. Plusieurs études indiquent que les sujets ayant une pathologie cardiovasculaire ont une concentration de LpA-I diminuée [43, 65], alors que d autres études ont démontré une diminution à la fois de LpA-I et LpA-I :A-II [66-68]. Dans l étude de Framingham et l étude VA- HIT [69], la quantification des sous-classes LpA-I et LpA- I :A-II par électro-immunodosage n a pas apporté d informations supplémentaires sur le risque cardiovasculaire chez les hommes, en comparaison aux déterminations lipidiques habituelles. Les particules de HDL portent un grand nombre de protéines additionnelles qui sont en concentrations beaucoup plus faibles que l ApoA-I et l ApoA-II. D autres apolipoprotéines sont connues pour être associées aux HDL ApoA-IV, ApoC-I, C-II, C-III, et ApoE. La plupart de ces apolipoprotéines sont échangeables entre les lipoprotéines et peuvent aussi être associées aux lipoprotéines contenant de l ApoB. C est pourquoi la mesure de la concentration totale de ces apolipoprotéines n apparaît pas spécifique de leur concentration dans les HDL, mais elle peut être réalisée après précipitation préalable des lipoprotéines contenant de l ApoB et mesure des apolipoprotéines d intérêt dans le surnageant. Cette approche a été utilisée pour montrer que l ApoC-III des HDL semble être un déterminant important de la progression de l athérosclérose [70]. Une récente étude ayant mis en œuvre une approche protéomique pour l analyse du contenu protéique a montré que les HDL portent physiologiquement un grand nombre de protéines impliquées dans l inflammation, l activation du complément et les processus immunitaires [71]. Une Effet du cholestérol et transport inverse Effets anti-apoptotiques Effets antithrombotiques HDL Figure 2. Propriétés antiathérogènes des HDL. Effets anti-inflammatoires Effets anti-oxydants Amélioration des fonctions endothéliales telle observation renforce l idée que les HDL ont un rôle en tant que composants du système immunitaire. A titre d exemple, les HDL peuvent être considérés comme le support pour l assemblage d un complexe protéique contenant l ApoL-I et une protéine haptoglobin-related qui assure un pouvoir lytique important vis-à-vis du trypanosome [72]. Ce concept pourrait expliquer les variations très importantes de compositions protéiques entre les sujets ; cette observation valide l approche d une détermination précise du contenu des HDL en protéines, à relier à leur fonctionnalité et donc à leur association avec le risque athérosclérose. Mesure de l efflux du cholestérol et du transport inverse du cholestérol Les propriétés des HDL qui pourraient contribuer à leurs effets antiathérogènes et cardioprotecteurs sont présentées dans la figure 2. Toutefois, l hypothèse la plus largement admise est que les HDL et l ApoA-I protègent du processus athéroscléreux en favorisant l efflux du cholestérol des cellules, en particulier des macrophages de la paroi artérielle, et en facilitant le transport inverse du cholestérol (TIC), qui permet le retour du cholestérol au niveau hépatique pour son excrétion biliaire et son élimination fécale. Il apparaît aujourd hui que si le TIC est un mécanisme concourant à l athéroprotection, son importance n est toujours pas formellement démontrée. Cependant, de nombreuses études ont cherché à comprendre les mécanismes de régulation moléculaire du TIC. Plusieurs études ont montré que le taux de transport inverse n est pas toujours relié à la concentration plasmatique du HDL-C et de l ApoA-I, suggérant que la mesure du TIC ou de ses composants peut apporter une information additionnelle sur le plan clinique. Concernant le processus athéroscléreux, le TIC est particulièrement important pour les cellules macrophagiques pariétales artérielles ; le paragraphe suivant s attache donc à présenter les méthodes analytiques permettant l analyse de ce TIC d origine macrophagique. Capacité d efflux du cholestérol La fonction athéroprotectrice la plus reconnue des HDL et de l ApoA-I est de favoriser l efflux du cholestérol des cellules, en particulier des macrophages qui représentent le type cellulaire à l origine de l accumulation du cholestérol au sein de la plaque athéromateuse. De nombreuses études se sont focalisées sur les mécanismes moléculaires à l origine de cet efflux. Le transporteur ABCA1 favorise l efflux du cholestérol vers des lipoparticules pauvres en lipides et porteuses d ApoA-I, les pré-β-hdl, qui servent Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février

8 revue générale d accepteurs [73]. Les macrophages issus de souris éteintes pour le gène ABCA1 présentent un efflux de cholestérol significativement diminué, et la transplantation de moelle osseuse déficiente en ABCA1 entraîne une augmentation significative du processus athéroscléreux [74]. Plus récemment, un autre membre de la famille des gènes ABC, ABCG1, a été identifié comme promoteur de l efflux du cholestérol des macrophages vers les lipoparticules HDL matures [75, 76] qui constituent la forme la plus abondante des HDL au niveau plasmatique. ABCA1 et ABCG1 fonctionnent de façon coopérative pour favoriser l efflux de cholestérol et le TIC [77], ce qui est en accord avec la récente observation montrant que les souris déficientes en ABCA1 et ABCG1 développent une athérosclérose accélérée [78]. Bien que SR-BI ait montré son effet facilitateur de l efflux du cholestérol in vitro de macrophages vers les HDL matures [79], son rôle dans le TIC macrophagique in vivo ne semble pas quantitativement important [77]. Les niveaux d expression macrophagique d ABCA1 et ABCG1 sont modulés par les récepteurs nucléaires LXR (Liver X receptor) α et β. Un agoniste synthétique du récepteur LXR favorise le TIC in vivo [80], bien qu ayant un faible effet sur les concentrations plasmatiques de HDL-C [81]. Des récepteurs LXR synthétiques sont également capables d inhiber ou d entraîner une régression des lésions athéroscléreuses [82-84]. Des concentrations plus élevées de HDL-C circulant ont longtemps été considérées comme favorisant l efflux cellulaire du cholestérol et donc conférant une meilleure athéroprotection. Cette observation peut être néanmoins remise en cause par l absence de relation entre les caractéristiques génétiques du métabolisme des HDL et l athérosclérose, de même que par l expérience de l inhibiteur de la CETP, le torcetrapib. En effet, de très importantes variations du HDL-C selon les individus existent à l égard de leurs capacités d efflux du cholestérol ex vivo [85, 86], et il a été montré que même après normalisation, certaines particules HDL apparaissent plus efficaces que d autres à favoriser cet efflux [87]. Ainsi, la mesure de la capacité d efflux du cholestérol d un sérum humain ou de HDL isolées pourrait être une méthode très intéressante pour déterminer la fonction des HDL, car elle pourrait mettre en évidence des différences interindividuelles ou en réponse à de nouvelles thérapeutiques. De tels essais ont été développés et appliqués en recherche clinique. Les cellules (souvent des macrophages) sont marquées avec du cholestérol tritié, puis exposées à du sérum total humain dilué, du sérum appauvri en lipoprotéines contenant de l ApoB, ou des HDL isolées, pendant un temps défini après lequel le comptage de la radioactivité dans le milieu, et celui restant associé aux cellules, est déterminé pour calculer le pourcentage d efflux [88]. Une autre approche consiste à déterminer la masse de cholestérol apparue dans le milieu de culture après incubation avec un agent accepteur [87]. Une troisième approche, indirecte, consiste à mesurer la capacité du sérum à diminuer le cholestérol disponible au niveau intracellulaire pour son estérification par l ACAT [89]. De grands facteurs de variabilité existent dans ces méthodes : le type cellulaire du donneur, la nature de l accepteur (sérum total, sérum appauvri en ApoB ou HDL isolées), le mode de lecture (cholestérol tritié, mesure de la quantité en masse du cholestérol, ou indicateur indirect telle que l activité ACAT) et les voies d efflux du cholestérol qui sont étudiées (ABCA1, ABCG1, SR-BI ou diffusion passive). La mesure de la capacité d efflux du cholestérol est de plus en plus utilisée dans les études précliniques [85, 90-92] afin de vérifier l effet d une intervention génétique ou d un traitement pharmacologique sur la capacité d efflux, indépendamment des concentrations de HDL-C. L application aux études cliniques humaines est moins répandue mais également de plus en plus utilisée. Dans une étude de petite taille utilisant des fibroblastes comme cellules donneuses et du sérum de sujets de sexe masculin devant subir une angiographie coronaire en tant qu accepteur, la diminution du pool de cholestérol intracellulaire disponible pour l ACAT a été retrouvée corrélée avec l évolution cardiovasculaire des sujets, alors que l efflux total mesuré par un traceur radioactif de cholestérol ne l était pas [86]. Les HDL isolées de patients présentant un déficit en CETP sont apparues plus efficaces pour induire un efflux de cholestérol cellulaire que les HDL de sujets sains [87], et les HDL de patients traités avec de fortes doses de l inhibiteur de CETP torcetrapib sont apparues également plus efficaces pour favoriser cet efflux [93]. La mesure de la capacité d efflux du cholestérol de sérum ou de HDL apparaît conceptuellement très intéressante et son utilisation devrait se développer dans les laboratoires pour évaluer l efficacité pharmacologique de nouvelles thérapeutiques. Cependant, il reste à démontrer sa relation avec la prévalence des pathologies cardiovasculaires et avec l évolution de ces pathologies ; il convient également de déterminer si ces relations apparaissent indépendantes des concentrations plasmatiques du HDL-C ou de l ApoA-I. De plus, il conviendra de standardiser la méthode de quantification de cette capacité d efflux, au regard des paramètres précédemment cités. Estérification du cholestérol par la LCAT La voie classique de TIC met en jeu l estérification du cholestérol sortant des cellules périphériques avant son transport au niveau hépatique [94]. La LCAT est une enzyme associée aux lipoprotéines, responsable de l esté- 14 Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février 2009

9 HDL heterogeneity and function rification du cholestérol libre en cholestérol estérifié dans le compartiment plasmatique. Le déficit en LCAT est associé avec des concentrations significativement diminuées de HDL-C alors que la surexpression de la LCAT chez des souris ou des lapins entraîne une augmentation significative des concentrations de HDL-C. Le cholestérol estérifié, très hydrophobe, va se positionner au cœur de la particule de HDL, participant ainsi à son augmentation progressive de taille. Il en résulte également une diminution du cholestérol libre à la surface de la lipoparticule, qui permet de maintenir un gradient du cholestérol libre des cellules vers les HDL [95]. Bien qu une activité augmentée de la LCAT ait longtemps été considérée comme athéroprotectrice, les données expérimentales sont peu nombreuses et contradictoires. Les patients déficients en LCAT ne développent pas d athérosclérose accélérée et il a été rapporté qu un déficit de la fonction LCAT était associé à une augmentation de l épaisseur intima-media carotidienne [96]. En théorie donc, la mesure de l activité LCAT au niveau plasmatique pouvait être un test fonctionnel permettant d avoir une information supplémentaire sur la prédiction d un risque cardiovasculaire. Cependant, les méthodes permettant la mesure de l activité LCAT ne sont pas standardisées. Une approche utilise l incubation d un substrat exogène, constitué de phospholipides et d ApoA- I et contenant du cholestérol libre radiomarqué, avec le plasma de sujet, suivi par la séparation du cholestérol libre et du cholestérol estérifié, et la détermination du pourcentage de cholestérol qui a été estérifié. Cette méthode, appelée communément «détermination de l activité LCAT», est mieux corrélée avec la mesure de la masse de la protéine LCAT. Une deuxième approche consiste à mélanger directement du cholestérol libre radiomarqué avec le plasma ; après incubation et séparation, le pourcentage de cholestérol estérifié est déterminé. Cette méthode, appelée habituellement «détermination du taux d estérification du cholestérol», apparaît beaucoup plus dépendante de la distribution systémique des lipoprotéines et de leur métabolisme intravasculaire. Aucune de ces méthodes n a été appliquée à ce jour à grande échelle dans des études cliniques destinées à déterminer la relation entre l activité LCAT ou le taux d estérification du cholestérol et la prévalence ou l évolution de maladies cardiovasculaires. La méthode la plus étudiée dans les essais chez l homme est probablement l étude du taux d estérification fractionnée sur les HDL (fractional esterification rate on HDL ou FER HDL ). Ce test fonctionnel mesure le taux d estérification médié par la LCAT du cholestérol libre spécifiquement lié aux HDL dans des plasmas dépourvus de lipoprotéines contenant l ApoB. Dans un modèle logistique multivarié, le FER HDL est apparu être un prédicteur significatif de la présence de pathologies cardiovasculaires documentées par l angiographie [97]. Les plus petites particules de HDL ont le taux d estérification plus rapide alors que les plus grandes particules ont le plus faible taux d estérification [98]. Ainsi, le FER HDL apparaît être un élément de mesure indirecte de la taille des lipoparticules de type HDL. Si un dosage standardisé de la masse de LCAT (protéine) devait être développé, celui-ci pourrait être le plus simple à appliquer dans des études de population à grande échelle, afin de déterminer s il constitue un élément prédictif des maladies cardiovasculaires, indépendamment des concentrations de HDL-C ou d ApoA-I. La mesure de la masse ou de l activité de la LCAT pourrait donc représenter une autre approche d évaluation de la fonction des HDL en vue de prévoir le risque cardiovasculaire. Transfert des esters de cholestérol par la CETP La CETP assure le transfert des esters de cholestérol depuis les HDL vers les lipoprotéines contenant de l ApoB, en échange de triglycérides. Puisque les lipoprotéines contenant de l ApoB sont principalement catabolisées au niveau hépatique, cette voie de la CETP est importante dans le transport inverse du cholestérol issu des HDL vers le foie chez l homme [99]. En revanche, l activité CETP entraîne une diminution des concentrations de HDL-C, et cette activité est directement liée à l expression du gène de la CETP, dont la variabilité est à l origine de variations de la concentration de HDL-C chez l homme. Le caractère pro- ou anti-athérogène de la CETP est actuellement débattu, et va conditionner le développement d inhibiteurs pharmacologiques de cette enzyme. Plusieurs études ont rapporté une association entre la masse de CETP plasmatique (protéine) et l évolution de la maladie cardiovasculaire. Des concentrations élevées de CETP apparaissent liées à la maladie cardiovasculaire [100], à la progression de la maladie cardiovasculaire documentée par angiographie [101], et à la progression de l épaisseur intima-média carotidienne [102], et à un plus jeune âge des sujets faisant un infarctus myocardique initial de la maladie cardiovasculaire [103]. Dans l étude clinique European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition in Norfolk, des concentrations plus élevées de la (CETP) protéine ont été reliées à une augmentation du risque d apparition d événements cardiovasculaires, mais uniquement chez les sujets ayant une concentration élevée des triglycérides plasmatiques [104]. Les résultats d autres études n ont pas confirmé ce rôle de la CETP comme facteur de risque positif de maladies cardiovasculaires [ ]. La mesure de l activité de la CETP, plutôt que sa masse, pourrait être plus informative car d autres facteurs peuvent influencer les Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février

10 revue générale taux de transfert des esters de cholestérol ; cependant, les méthodes de dosage de l activité CETP ne sont pas actuellement utilisables de façon courante. Dans un nombre très limité d études, une activité élevée de la CETP a été associée avec une athérosclérose ou un risque cardiovasculaire [103, 108, 109]. Des études complémentaires apparaissent nécessaires, mais il n est pas exclu que la détermination de l activité CETP puisse affiner l évaluation du risque cardiovasculaire de façon indépendante des concentrations d HDL-C. Evaluation des fonctions antioxydantes et anti-inflammatoires des HDL Des propriétés complémentaires de l efflux du cholestérol ont été découvertes ces dix dernières années, pouvant contribuer aux effets anti-athérogènes des HDL (figure 2). Les propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires des HDL apparaissent particulièrement importantes dans les fonctions générales de ces lipoparticules. Activité paraoxonase et capacité antioxydante des HDL La paraoxonase (PON1) est une esterase/lactonase associée aux HDL dont le nom dérive de son principal substrat utilisé in vitro, le paraoxon. La PON1 hydrolyse en fait une multitude de lipides modifiés, notamment oxydés. Son activité semble participer au moins en partie au rôle antioxydant des HDL ; la PON1 protège à la fois les HDL et les LDL de la peroxydation lipidique [110, 111]. L activité PON1 peut être mesurée par différentes méthodes : la plus utilisée est la détermination cinétique de la formation du paranitrophénol à partir du substrat de l enzyme, le paraoxon [112]. Une diminution de la taille des lésions artérielles a été observée chez des souris transgéniques chez lesquelles a été inséré le gène de la PON1, alors qu une athérosclérose accélérée a été observée chez les souris éteintes pour le même gène [113, 114]. Chez l homme, l activité PON1 est inversement reliée au risque cardiovasculaire. Dans la Caerphilly Prospective Study, l activité PON1 a été retrouvée comme facteur prédictif des événements coronariens, indépendamment de tous les autres facteurs de risque coronariens, et notamment le cholestérol HDL-C [115]. Le D-4F, un peptide mimant l ApoA-I, augmente l activité PON1 chez des souris déficientes en récepteur des LDL soumises à un régime de type occidental et après infection par le virus influenza [116]. La mesure de l activité PON1 pourrait donc être un biomarqueur des fonctions protectrices des HDL et du risque cardiovasculaire indépendamment de la concentration du cholestérol des HDL. Les HDL ont la capacité d inactiver les phospholipides oxydés, en particulier grâce à leur activité PON1, mais également via d autres enzymes et propriétés des HDL. C est pourquoi une méthode de mesure de la capacité oxydante globale des HDL pourrait avoir un intérêt en recherche et en clinique. Une méthode en système acellulaire utilise la dichlorofluorescéine comme élément de mise en évidence des produits de peroxydation lipidique [117]. Des phospholipides oxydés et la dichlorofluorescéine sont ajoutés aux HDL, puis incubés : le degré de fluorescence est alors proportionnel à la capacité des HDL d inactiver les phospholipides oxydés. Cette méthode, qui demande une standardisation et une validation, pourrait évaluer le pouvoir antioxydant global des HDL. Propriétés anti-inflammatoires des HDL évaluées par l inhibition de l expression des molécules d adhésion endothéliales Les cytokines pro-inflammatoires favorisent l expression des molécules d adhésion par les cellules endothéliales, qui contribuent au recrutement des leucocytes circulants et à leur pénétration au niveau de l intima artérielle. Les HDL inhibent la surexpression des molécules d adhésion endothéliales induite par les cytokines proinflammatoires [34]. La capacité de HDL à inhiber cette surexpression des molécules d adhésion est appréciée par mise en contact des lipoparticules avec des cellules endothéliales puis stimulation de ces dernières par une cytokine pro-inflammatoire et quantification des molécules d adhésion telles que VCAM-1. Des études précliniques ont démontré l intérêt potentiel de cette approche dans l évaluation de l efficacité d interventions thérapeutiques [34]. Cependant, les données disponibles sont actuellement très restreintes, et démontrent une très grande variabilité interindividuelle sur la capacité d HDL isolées à inhiber l expression endothéliale des molécules d adhésion, et cela indépendamment des concentrations plasmatiques du HDL-C. Une étude réalisée chez l homme a montré qu un régime riche en graisses saturées diminue significativement la capacité des HDL isolées à supprimer l expression endothéliale de molécules d adhésion intercellulaires induite par le TNF-α (mesurée par l expression de ICAM-I et VCAM-I), alors qu un régime riche en acides gras polyinsaturés augmente cette capacité des HDL [118]. Cette méthode utilisant une culture cellulaire endothéliale doit être standardisée et nécessite d être validée avant son utilisation comme outil 16 Ann Biol Clin, vol. 67, n o 1, janvier-février 2009

11 HDL heterogeneity and function d évaluation de la maladie athéroscléreuse et de prédiction des événements cardiovasculaires indépendamment du HDL-C plasmatique. Mais elle apparaît également comme une méthode fiable d évaluation de la fonction anti-inflammatoire des HDL et, en tant que telle, est susceptible de fournir des informations intéressantes. Autres propriétés potentiellement antiathérogènes des HDL Les HDL possèdent différentes autres propriétés qui peuvent contribuer à leurs effets anti-athérogènes (figure 2). Il s agit en particulier de la capacité à stimuler la production endothéliale du NO et donc de limiter le dysfonctionnement endothélial artériel [35, 119]. Les études observationnelles ont montré une relation inverse entre les concentrations de HDL-C et le dysfonctionnement endothélial [120, 121]. Le mécanisme de cet effet apparaît dépendre de l activité endothéliale de SR-BI et pourrait donc impliquer l efflux endothélial du cholestérol en tant que phénomène déclenchant [35]. Les variations interindividuelles de la capacité des HDL à favoriser la production endothéliale du NO ne sont pas connues, mais la mise au point d une méthode permettant cette détermination apparaît très intéressante. Quelques données suggèrent que la capacité des HDL à favoriser la production de NO est dépendante, au moins partiellement, de la sphingosine- 1-phosphate, récepteur endothélial des lysophospholipides [3, 122] suggérant que la teneur des HDL en sphingosine- 1-phosphate pourrait influencer cette fonction des HDL. Ainsi, la mesure de la sphingosine-1-phosphate des HDL pourrait être un moyen d évaluer leur fonction de stimulation de la production du NO endothélial. Les HDL ont également des propriétés antithrombotiques [35] à la fois sur la coagulation et sur les fonctions plaquettaires. La mesure des propriétés anticoagulantes des HDL serait fastidieuse et sujette à variations. L idéal serait de disposer d un panel de marqueurs biologiques fortement corrélés avec la fonction des HDL et dont la mesure permettrait d apprécier les propriétés fonctionnelles de ces HDL. nouvelles thérapeutiques ciblées sur les HDL. D importants progrès ont été réalisés pour assurer le développement de méthodes robustes et reproductibles d évaluation des sous-classes de HDL, et plusieurs d entre elles sont actuellement commercialisées. Néanmoins, les données scientifiques sont pour l instant très faibles pour préconiser l évaluation des sous-fractions de HDL plutôt que le cholestérol HDL-C lui-même dans l évaluation prédictive de la maladie cardiovasculaire. La seule exception est peut-être l ApoA-I, qui pourrait être plus intéressante que le HDL-C pour cette prédiction. Par opposition aux robustes méthodes de biochimie évaluant les sousfractions de HDL, l évaluation au laboratoire des fonctions des HDL est à ce jour balbutiante. Des méthodes in vitro ont été développées dans différents laboratoires de recherche, mais apparaissent difficiles à mettre en œuvre, non standardisées et trop peu validées pour être applicables au diagnostic clinique. Il est donc important de poursuivre les efforts dans ce domaine, en particulier de développer des méthodes standardisées utilisables facilement dans de grandes populations, afin de déterminer un risque prédictif indépendant du HDL-C. Les espoirs vont aujourd hui vers la détermination massique de composants des HDL reflétant fidèlement leurs fonctionnalités variées. Au final, un ensemble de dosages représentatifs de l hétérogénéité et de la fonction des HDL pourrait être utilisé pour la prédiction du risque cardiovasculaire, mais un tel outil devrait être inclus dans les recommandations nationales d évaluation du risque cardiovasculaire, avant que son usage soit répandu en pratique quotidienne. En revanche, les tests fonctionnels des HDL pourraient vraisemblablement être utilisés assez rapidement pour évaluer précocement l intérêt thérapeutique de nouvelles approches pharmacologiques ciblées sur les HDL. Le développement de méthodologies robustes d évaluation des fonctions des HDL et leur validation pour la prédiction du risque cardiovasculaire et en réponse aux interventions thérapeutiques, apparaissent donc aujourd hui particulièrement importants à la fois dans le domaine de la recherche vasculaire, de la biochimie clinique et pour l industrie pharmaceutique. Conclusion La détermination des concentrations plasmatiques du HDL-C, bien qu ayant une valeur prédictive des événements cardiovasculaires d athérosclérose déterminés dans de grandes cohortes de sujets, apparaît donc clairement insuffisante pour appréhender la variation fonctionnelle des particules de HDL et le risque cardiovasculaire attaché à ces fonctions. De plus, les concentrations de HDL-C sont tout à fait insuffisantes pour évaluer l efficacité de Références 1. Thom T, Haase N, Rosamond W, et al. Heart disease and stroke statistics-2006 update : a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation 2006 ; 113 : e85-e Gordon DJ, Rifkind BM. High-density lipoproteins-the clinical implications of recent studies. N Engl J Med 1989 ; 321 : Wilson PW, Abbott RD, Castelli WP. High density lipoprotein cholesterol and mortality. The Framingham Heart Study. 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