T.P. 2 : TECHNIQUES SPECIALES DE MICROSCOPIE OPTIQUE AVEC DES APPLICATIONS EN MEDECINE : L EXAMEN EN IMMERSION, LA MICROSCOPIE SUR FOND FONCÉ

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1 T.P. 2 : TECHNIQUES SPECIALES DE MICROSCOPIE OPTIQUE AVEC DES APPLICATIONS EN MEDECINE : L EXAMEN EN IMMERSION, LA MICROSCOPIE SUR FOND FONCÉ I - L examen en immersion, notions générales La partie la plus importante d un microscope, c est l objectif, car de ses qualités dépend la qualité de l image. L objectif est formé de plusieurs lentilles serties dans un tube métallique. La lentille inférieure est plan convexe, sa face plane vers l objet, et s appelle lentille frontale. Sa force de grossissement est dans un rapport direct avec l ampleur de l angle d ouverture, c est-à-dire, avec l angle formé par les rayons de lumière divergentes extrêmes, qui, partant du point zéro, situé sur l objet, pénètrent dans la lentille (la figure 2.1). La force de grossissement d un objectif est d autant plus grande que le diamètre de la lentille frontale est plus petit. Un espace de moins 1,5 mm doit toujours rester entre l objet et la lentille frontale. Cet espace peut être libre (de l air), dans le cas des objectifs secs, ou, il peut être occupé par un liquide, dans le cas des objectifs à immersion. L indice de réfraction (n) peut être proche ou égal à celui du verre : l eau (n=1,33), l huile de cèdre (n= 1,51). Dans le cas des objectifs secs, une grande partie des rayons qui partent d un point 0 de l objectif, dont l oblicité face à l axe optique du système dépasse un certain angle, subiront une réflexion totale lorsqu elles gagnent la face supérieure de la lamelle (qui couvre l objet placé sur la lame). Par conséquent, seulement une partie du cône lumineux pénètre dans l objectif, le reste étant perdu. Dans le cas des objectifs à immersion, si l on introduit entre la lentille frontale et la lamelle, de l huile de cèdre, ayant un indice de réfraction de 1,51, égal à celui du verre, les phénomènes de réflexion, comme d ailleurs, ceux de la réfraction de la lumière, seront éliminés. Tous les rayons de lumière qui partent du point 0 et gagnent la lentille frontale, quel que soit leur oblicité, pénètrent dans le microscope et contribuent à la formation de l image. Les objectifs à immersion donnent une image beaucoup plus lumineuse que les objectifs secs parce qu elles reçoivent tous les rayons du cône de lumière correspondant à l angle d ouverture. En plus, la force de grossissement des objectifs à immersion est supérieure à celle des objectifs secs. Il s ensuit que les détails de structure des objets peuvent être mieux observés, car la résolution des objectifs à immersion est meilleure (voir le travail 1). 1

2 Fig 2.1.A. Les phénomènes de réfraction et de réflexions des rayons lumineux qui viennent de l objet dans le cas de l objectif sec. B. L élimination de ces phénomènes Au microscope ML4 les trois objectifs secs grossissent respectivement de 10 fois, 20 fois et 40 fois, mais l objectif à immersion (noté HI) de 90 fois. Le système à immersion (détails) A la suite de la réfraction et de la réflexion, grâce au passage du verre à l air, une partie des rayons de lumière qui proviennent de l objet microscopique (préparé) se perdent, ne pénètrent pas l objectif (les rayons de type 1 de la figure 2.2) En posant sur la lamelle en verre un liquide à un indice de réfraction proche de celui du verre, par exemple de l huile de cèdre (n= 1,51) et en descendant le système du microscope jusqu à ce que la lentille frontale de l objectif plonge dans de l huile, ces rayons passent presque sans être déviés, pénétrant l objectif (voir le rayon 2), tout en contribuant ainsi à l amélioration de la qualité de l image. Les objectifs à immersion sont des objectifs spéciaux, certains au système téléscopique afin de réaliser plus facilement un rapprochement de la préparation, sans détruire la lamelle de verre. La force d agrandissement de ces objectifs peut être de 60, 90, 100 fois. 2

3 Les microscopes modernes peuvent avoir des oculaires qui grossissent jusqu à fois, tandis que les objectifs à immersion grossissent fois, comme des systèmes intermédiaires d agrandissement (entre l objectif et l oculaire). Ainsi le grossissement final au microscope peut atteindre fois, et la prise en photo de l image et le grossissement de celle-ci peut atteindre des valeurs encore plus élevées. En plus, en utilisant comme source de lumière, une lampe à lumière ultra-violette, on peut obtenir des résolutions jusqu à 1,1 mm pour le grossissement final (après avoir fait la prise des photos et le grossissement de l image) de de fois. L examen en immersion a des applications médicales importantes, parmi lesquelles : l étude des bactéries, les examens hématologiques, les examens cytogénétiques. La technique de l examen en immersion La préparation sera posée au centre du champ microscopique et on règle l image à l aide de l objectif 20 fois. On relève ensuite le tube en manoeuvrant la vis macrométrique, de sorte qu il reste un espace libre de 2 cm entre la préparation et l objectif. Il faut ajouter ensuite une goutte d huile de cèdre sur la lamelle, et tout en regardant du côté latéral, on descend le tube à l aide de la vis macrométrique jusqu à ce que l objectif pénètre dans la goutte d huile. En regardant à nouveau à travers l oculaire, on descend lentement le tube à l aide de la vis macrométrique jusqu à l apparition de l image. On continue ensuite la mise au point précise à l aide de la vis micrométrique. Des préparations d examen à immersion a) Le frottis des cellules de la muqueuse buccale (coloré à la fuchsine), dans le noyau desquelles on observe la chromatine sexuelle (le corpuscule de Barr). Il faut dégraisser à l alcool sanitaire 3 lames de verre propres. Après avoir fait l hygiène de la cavité buccale par quelques rinçages à l eau, le sujet ouvre la bouche et à l aide d une lame, la muqueuse de la face latérale du vestibule buccal sera frottée, tout en écartant ainsi les cellules mortes. La lame qui contient les cellules prélevées est mise en contact avec une lame propre, et par un mouvement de glissement tout au long de la lame propre, on étale les cellules, en obtenant ainsi le frottis. La lame est laissée ensuite à sécher quelques minutes. Le frottis sera coloré à l aide de fuchsine basique, par l immersion de la lame, à tour de rôle, dans : 1) méthanol pur, minutes 2) méthanol 70% 3) eau distillée, 10 minutes 4) fuchsine basique, minutes La lame sera rincée à l eau du robinet afin d éliminer l excès de colorant, ensuite elle sera introduite dans 5) méthanol, 1 minute. A étudier : le corpuscule de Barr. Il a l aspect d un petit triangle coloré en violet foncé, ayant la base à la périphérie du noyau où il peut avoir une forme semi-lunaire ou de coupole avec la surface convexe vers l intérieur du noyau, mais toujours tangent à la périphérie du noyau. Le reste du noyau est pâle, avec une teinte rose-violet et présente des granules de chromatine. b) Le frottis sanguin, coloré à l hématoxyline-éosine, afin d observer les cellules rouges (sans noyau) et les différents types de globules blancs (à observer la forme du noyau, le rapport nucléocytoplasmique et les granulations de certaines cellules blanches). 3

4 II - La microscopie sur fond foncé Elle repose sur le phénomène Tyndall, qui consiste dans la dispersion de la lumière par des particules très petites, qui se trouvent dans la suspension et qui, de cette façon deviennent visibles, semblables aux particules de poussière qui se trouvent dans un rayon de lumière très forte. Dans le cas où on utilise une méthode d illumination dans laquelle le fascicule qui sert à illuminer l objet, ne pénètre pas directement dans le microscope, la preuve est illuminée par des rayons obliques par un condenseur spécial (cardioïde ou paraboloïde), et dans l objectif ne pénètrent que les rayons dispersés par les particules qui se trouvent dans la suspension (fig. 2.3.). Le fascicule incident est dans chaque cas limité par un diaphragme (D) aux ouvertures convenablement choisies. De cette façon apparaissent des points brillants sur fond noir, qui correspondent aux particules jusqu à 0,003 µm, de 1000 fois plus petites que la limite de résolution du microscope optique. On peut ainsi observer des particules dans le cytoplasme des cellules vivantes, qui ne peuvent être vues dans la microscopie habituelle. Fig La dispersion des rayons de lumière par une particule Fig L orientation des rayons de lumière vers un condenseur cadioïde (a) et vers un condenseur paraboloïde (b). D= diaphragme circulaire ; L= la lame; l= la lamelle; lm= le milieu d immersion La microscopie sur fond foncé est aussi utilisée pour l examen des cellules vivantes (microbes, protozoaires) qui peuvent être également vues au microscope habituel, mais dont les particularités apparaissent plus clairement sur fond foncé. Par exemple, l étude des spirochètes permet le diagnostic de certaines maladies parmi lesquelles, la syphilis. D autre part, cette méthode est également pratiquée pour les préparations à contraste blanc. L image de la préparation apparaît lumineuse sur fond foncé. Ce procédé repose sur l effet produit par le condenseur, dû au phénomène de diffraction de la lumière (dans la préparation), réalisée par une illumination latérale. 4

5 L examen sur fond foncé peut être également fait au microscope habituel, auquel la préparation aux particules en suspension est placée dans une cuve de verre latéralement illuminée. Ce procédé s appelle l ultra-microscopie. Le schéma du procédé est présenté à la figure 2.5. Le fascicule de lumière (F) est concentré par la lentille (L) sur une cuve de verre (C) dans laquelle se trouvent, en suspension, des particules ultra-microscopiques. La lumière diffusée par une certaine particule atteindra l objectif 0 du microscope et formera, dans le plan local, un cercle de diffraction. Selon la présence du cercle, on pourra constater la présence de la particule et son mouvement. Les particules sont visibles comme des étoiles brillantes sur fond foncé. L ultra-microscopie permet l observation de certaines particules ayant des dimensions jusqu à 0,003 µm (30 A ). Il est à remarquer qu à mesure qu on avance vers la limite de résolution du microscope, le rassemblement entre l objet et l image disparaît du point de vue géométrique. Celle-ci s applique aussi pour la microscopie sur fond foncé et à l ultra-microscopie. La préparation à examen sur fond foncé : La préparation à examen sur fond foncé : des cellules de Spirulina plantesis (une algue verte-bleuâtre). A étudier : des cellules réunies entre elles par une structure en forme de spirale, brillante sur fond noir, qui tourne lentement autour de son axe. 5