RECHERCHE DE LA SPÉCIFICITE D UN ANTICORPS PAR LE TEST D OUCHTERLONY VERSION «PRODUITS DE SUBSTITUTION»

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1 Fiche sujet - candidat La spécificité d un anticorps est liée à sa capacité de liaison avec une molécule donnée présentant des propriétés antigéniques. Le test d immunodiffusion, ou test d Ouchterlony, permet la mise en évidence de cette liaison antigène-anticorps. On cherche à savoir si les anticorps contre l albumine de sérum de bœuf (BSA) ont une spécificité stricte vis à vis de la BSA. Matériel : - une plaque chauffante et une balance électronique sur paillasse professeur, (utilisables par plusieurs groupes si nécessaire) ; - un bécher, une éprouvette graduée ou équivalent 0mL, une coupelle, une pince en bois, un flacon d Agar ; - un flacon d eau distillée, une spatule, pipette 0 ml et pipeteur, deux petites boîtes de Pétri; éventuellement un gabarit de perçage ; - un tube emporte-pièce, un cure-dents, une aiguille lancéolée, un marqueur, un compte-gouttes par produit, des gants ; - sérum de lapin (= S) contenant des anticorps anti BSA (Albumine de Sérum de Bœuf) remplacé par un produit de substitution ; - eau distillée (= E) et 4 solutions d albumine d espèces différentes remplacées par des produits de substitution mimant les albumines extraites de : œuf de poule = O lait de vache = L sérum de bœuf = B sérum de cheval = C - si besoin une lampe de bureau et une petite feuille de papier noir pour observer les résultats. Activités et conditions des activités. Réaliser la partie I du protocole de la fiche technique - candidat. Appeler l examinateur pour vérifier la qualité des boîtes de gel et obtenir éventuellement une boîte de secours. Après lecture du protocole de la fiche technique candidat (partie II et III ), choisir la disposition des produits dans la boîte de Pétri et l indiquer sur le schéma de la fiche réponse candidat. Justifier ce choix. Appeler l examinateur pour vérifier et obtenir éventuellement un document de secours 3. Réaliser les parties II et III du protocole de la fiche technique candidat. Appeler l examinateur pour obtenir les résultats 4. Représenter sur la fiche réponse le résultat fourni. Réaliser, en utilisant le modèle de la fiche réponse, deux schémas qui expliquent au niveau moléculaire la formation ou l absence d un arc de précipitation. 5. Déterminer, à l aide des résultats fournis, si les anticorps ont une spécificité stricte vis à vis de la BSA. 6. Ranger le poste de travail. Capacités et principaux critères d'évaluation Réaliser une manipulation d après un protocole Comprendre la manipulation Réaliser une manipulation d après un protocole Traduire des informations par des schémas Adopter une démarche explicative Gérer et organiser le poste de travail Barème

2 Fiche technique - candidat Principe de la méthode d Ouchterlony C est l immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible s il n y a pas de réaction entre les deux solutions. Quand il y a réaction entre les solutions, il se forme un arc de précipitation visible à l œil nu. Celui-ci est dû à l interaction entre de nombreux anticorps et les antigènes spécifiques, entraînant la formation d un complexe immun. NB : le temps de réaction avec les produits véritables est de l ordre de 4h ; vous manipulez ici sur des produits de substitution mimant les réactions réelles mais permettant une lecture des résultats au bout de 40 min, permettant l évaluation de votre manipulation. Cependant, après avoir réalisé le protocole, vous disposerez, pour lire les résultats, d une boîte préparée à l avance. de précipitation PROTOCOLE - NB : organiser votre poste de travail pour manipuler proprement I - Préparation d un gel d Agar à couler dans deux boites de Pétri pour test d Ouchterlony (une boite pour s exercer). Organiser le poste de travail pour manipuler proprement.. Peser dans la coupelle 0,g d Agar prélevés à l aide de la spatule. 3. Verser 4 ml de tampon puis l Agar dans le Bécher et dissoudre soigneusement l Agar avec la spatule. 4. Chauffer le mélange en remuant à la spatule jusqu à ce que le mélange devienne limpide et arrêter au tout début de l ébullition. 5. Retirer à l aide de la pince en bois et attendre une minute pour manipuler le Bécher sans se brûler. 6. Pipeter 5 ml de gel d Agar chaud et fluide et le verser dans une boîte de Pétri. 7. Egaliser le niveau et supprimer rapidement les bulles. 8. Recommencer pour la deuxième boîte de Pétri (boîte pour s exercer). 9. Ne pas remuer les boîtes avant prise du gel d Agar : environ 5 min. II- Préparation du test. Creuser les puits nécessaires dans le gel d Agar d une boîte de Pétri.. Utiliser le gabarit ci-contre (ou celui fourni) pour répartir les puits nécessaires. S exercer avec la deuxième boîte pour creuser les puits avec l emporte-pièce. 3. Utiliser le cure-dent pour éliminer les disques de gélose si nécessaire. III- Réalisation du test. Marquer sur la boîte de Pétri la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de l anticorps étudié avec les différents antigènes proposés.. Remplir les puits : le produit, prélevé dans un tube avec un compte goutte propre, doit être déposé dans le puits approprié sans débordement ni bulles et sans endommager le gel d agar. S exercer avec la boîte d apprentissage et de l eau distillée. 3. Observer les résultats fournis sur fond noir et en éclairage rasant. Gabarit de perçage dans le gel d Agar

3 Fiche réponse - candidat ETABLISSEMENT : Classe : NOM : Prénom : Schéma à compléter Modèle de l anticorps pour la schématisation SCHEMAS A rendre à l issue de l épreuve Utiliser le verso si nécessaire

4 Fiche barème d évaluation Capacités et critères d évaluation (en gras, évaluation pendant de la séance) Barème Noms des candidats - Comprendre la manipulation - puits central avec sérum lapin ; puits périphériques contenant chacun un antigène ou l eau distillée - justification : possibilité de rencontre entre les anticorps du sérum central et tous les antigènes périphériques * * fournir un document de secours au candidat qui ne franchit pas cette étape.. et 3 Réaliser une manipulation d après un protocole - respect des étapes du protocole : pipetage, dissolution, chauffage pour préparation de la gélose - obtention d un gel «propre» (surface égalisée, pas de bulle) - réalisation soignée des 6 puits en respectant le gabarit - marquage efficace des puits sur la boîte - utilisation judicieuse du matériel : à vérifier lors de la manipulation ( compte-goutte par produit, dépôts soignés, qualité du pipetage, dépôt des produits conforme au marquage). S aider également des résultats obtenus pour évaluer. 4- Représenter une observation par un schéma - tracé de l arc correctement placé - schémas soignés, titres pertinents - schéma du complexe immun : traduisant complémentarité Ag-Ac, avec au moins 3 Ag - schéma en l absence d arc : traduisant l absence de complémentarité Ac-Ag 5-Appliquer une démarche explicative pour répondre au problème posé Les anticorps testés réagissent en présence de l albumine de sérum de bœuf (BSA). Ils ne réagissent pas en présence des albumines des autres espèces testées ni même en présence de l albumine de lait de Vache (même espèce). On peut donc estimer qu ils sont strictement spécifiques de la BSA. (NB : on n attend pas du candidat qu il dise qu on ignore si toutes les albumines du Bœuf ont été testées). 6- organisation et rangement de la paillasse comprenant le rangement de la paillasse 3 3 Note /0

5 Fiche laboratoire et évaluateurs / Matériel par poste : - une plaque chauffante et une balance électronique sur paillasse professeur, (utilisables par plusieurs groupes si nécessaire) ; - un bécher, une éprouvette graduée ou équivalent 0mL, une coupelle, une pince en bois, un flacon d Agar ; - un flacon d eau distillée, une spatule, pipette 0 ml et pipeteur, deux petites boîtes de Pétri; éventuellement un gabarit de perçage ; - un tube emporte-pièce, un cure-dents, une aiguille lancéolée, un marqueur, un compte-gouttes par produit, des gants ; - sérum de lapin (= S) contenant des anticorps anti BSA (anti-albumine de Sérum de Bœuf) remplacé par un produit de substitution ; - eau distillée (= E) et 4 solutions d albumine d espèces différentes remplacées par des produits de substitution mimant les albumines extraites de : œuf de poule = O lait de vache = L sérum de bœuf = B sérum de cheval = C - si besoin une lampe de bureau et une petite feuille de papier noir pour observer les résultats. Matériel nécessaire - boîtes de Pétri (verre ou plastique), de diamètre 5 à 6 cm (par candidat boîtes vides pour la manipulation et boîte résultat (fournie à la question 3), cette dernière éventuellement remplacée par la fiche résultat candidat en cas d impossibilité de préparation) - gabarit de perçage des puits : certains lycées utilisent comme gabarit de perçage un couvercle de boîte de Pétri percé de trous, le fournir alors au candidat. - Agar en poudre : g pour 0 boîtes - eau distillée : 00 ml pour 0 boîtes - emporte pièce (pipette ou tube en verre de diamètre 6mm) ; certains lycées utilisent un tube muni d une poire d aspiration, le fournir alors au candidat - aiguille lancéolée et cure-dent - compte-gouttes : un par produit Produits de substitution (présentent le double avantage d un coût minime et d une lecture rapide du résultat) : - eau distillée substitut des solutions «E», «O», «C», «L», - solution de soude (Na + + OH - ) à 0. mol.l - substitut du sérum «S», - solution de sulfate de Zinc (Zn + + SO 4 - ) à 0. mol.l - substitut de la BSA «B». Un arc identique à la formation d un complexe anticorps-antigène se forme entre la soude et le sulfate de zinc au bout de 40 min. Il est stable durant trois heures.

6 Fiche laboratoire et évaluateurs / Préparation des boites de secours Les boîtes peuvent être coulées quelques jours avant l évaluation - dissoudre g d'agar pour 00mL d'eau distillée. Porter à ébullition en remuant constamment puis arrêter le chauffage. - lorsque le flacon peut être saisi dans la main sans se brûler (environ 60 C), couler le gel d agar obtenu, dans les boîtes de Petri, sur une épaisseur d'environ,5 mm, ce qui représente environ 4,5 ml par boîte. - laisser refroidir sur une surface horizontale. Conserver les boîtes au réfrigérateur, dans une boîte fermée hermétiquement et tapissée de papier absorbant humide pour réaliser une atmosphère saturée d humidité. REMARQUES A L ATTENTION DE L EXAMINATEUR Le candidat étudie un résultat fourni, mais la lecture a posteriori des résultats obtenus par lui intervient dans l évaluation de la manipulation. Evaluation de la question L examinateur doit être présent auprès du candidat au moment où celui-ci distribue les produits (point 3 du protocole) dans les puits de manière à noter au plus juste le point de la grille d évaluation. Rôle du document de secours : - Le document de secours n est fourni que si le candidat n a pas placé l anticorps dans le puits central ; on admet toute disposition pour les puits périphériques. - Si le document de secours est fourni, le candidat n obtient pas les points correspondants à la question mais peut continuer l épreuve Le document de secours et le document résultats peuvent être imprimés (impression couleur de bonne qualité) ou affichés à l écran : utiliser alors les documents affichables : 07_I7_B_Pro_66_secours et 07_I7_B_Pro_66_result Prescriptions Autorisations Blouse Gants Lunettes Calculette Papier brouillon Oui, non fournie Oui, fournis non non Fourni par l établissement

7 BOITE PRESENTANT LA DISPOSITION DES PRODUITS DANS LES PUITS Fiche secours - candidat

8 Fiche résultats candidat A n utiliser qu en cas d impossibilité de préparation d une boîte de résultats par le laboratoire BOITE DE RÉSULTATS PRESENTEE SUR FOND NOIR ET ÉCLAIRAGE RASANT