THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1 sous le sceau de l Université Européenne de Bretagne. pour le grade de DOCTEUR DE L UNIVERSITÉ DE RENNES 1

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1 ANNÉE 2014 THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1 sous le sceau de l Université Européenne de Bretagne pour le grade de DOCTEUR DE L UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Mention : Biologie Ecole doctorale Vie-Agro-Santé (VAS) présentée par Jocelyn PLASSAIS Préparée à l unité de recherche IGDR UMR 6290 CNRS-UR1 Institut de Génétique et Développement de Rennes Composante universitaire Sciences de la Vie et de l Environnement Thèse soutenue à Rennes le 1 er Décembre 2014 Identification de gènes impliqués dans des maladies génétiques chez l Homme et le chien : de la dermatologie à la neurologie devant le jury composé de : Pr. Éric LE GUERN PU-PH, UMRS 1127, UMR 7225-CNRS Hôpital Pitié Salpêtrière, Paris / rapporteur Pr. Laurent TIRET Professeur DVM, Université Paris-Est, EnvA UMR955 INRA-EnvA, Maisons-Alfort / rapporteur Pr.Véronique DAVID PUPH, CHU Pontchaillou UMR 6290, IGDR, Rennes / examinateur Pr. Michel GEORGES PU-DR, Université de Liège GIGA, Liège / examinateur Pr. Alain DUPUY PU-PH, CHU Pontchaillou Rennes / examinateur Dr. Catherine ANDRE Chargé de Recherche (CR1) au CNRS, UMR 6290, IGDR, Rennes / directeur de thèse 0

2 Résumé L espèce canine (Canis lupus familiaris) rassemble aujourd hui plus de 350 races issues d une sélection artificielle drastique menée par l Homme au cours des derniers siècles. De ce fait, chaque race peut être considérée comme un isolat génétique développant chacune des affections génétiques et ce, de manière spontanée avec parfois de très fortes fréquences. Ainsi, l espèce canine constitue un modèle puissant pour identifier les gènes et allèles responsables de ces affections homologues à certaines maladies génétiques humaines. Ma thèse s est déroulée autour de deux grands axes. Mon premier projet a porté sur la recherche des causes génétiques de deux kératodermies plantaires chez le terrier irlandais et le dogue de Bordeaux. Concernant les terriers irlandais, ce projet fut mené par l équipe du Pr. Tosso Leeb de l université de Berne, en collaboration avec le laboratoire Antagene. En combinant plusieurs analyses d association tout génome (GWAS : «Genome Wide Association Study») et des techniques de séquençage NGS (Next Generation Sequencing), un nouveau gène muté responsable d une hyperkératose plantaire a été identifié. Concernant l hyperkératose plantaire des dogues de Bordeaux, nous avons génotypé plus de SNPs sur plus de 200 dogues. Une analyse de liaison génétique paramétrique sur 68 d entres eux dont 14 atteints, a permis d identifier un locus de 20 Mb sur le chromosome 9 contenant un cluster de kératines. En combinant les données cliniques, histologiques, immunohistochimiques et génétiques, en comparaison avec l Homme, la kératine 16 s avérait le meilleur gène candidat. Son séquençage complet a permis d identifier une mutation complexe générant une protéine tronquée. Des analyses complémentaires de PCR quantitatives ont révélé que ce gène muté était sous exprimé chez les individus atteints. Ce travail a donc abouti non seulement, à l identification d une mutation responsable d une kératodermie chez le chien et de ses effets fonctionnels, mais aussi de proposer cette race de chien comme le premier modèle animal spontané de kératodermie focale non-épidermolytique (FNEPPK). En parallèle de ce projet, j ai mené des recherches sur les bases moléculaires d un syndrome d automutilation acrale décrit dans plusieurs races de chiens de chasse. Cette neuropathie est homologue aux neuropathies héréditaires sensitives et autonomes (HSANs) chez l Homme. Elle se caractérise notamment par une perte de sensibilité à la douleur au niveau des membres. Grâce à une approche classique de GWAS, j ai pu identifier un locus de 1,5 Mb chez le chien, dont l orthologue humain n est pas encore décrit chez des patients HSANs. Le séquençage complet de ce locus a mené à l identification d un variant situé dans une région cis-enhancer en amont d un gène candidat. La mise en évidence d une sousexpression du gène candidat indique que ce variant régulateur semblerait modifier l activité de l enhancer. Ces résultats nous permettent de proposer cette mutation comme la cause de ce syndrome chez les chiens de chasse. Cette découverte offre donc de nouvelles perspectives de recherche pour des patients humains atteints de neuropathies héréditaires sensitives. En combinant des approches génétiques complémentaires sur des modèles spontanés de maladies bien caractérisées chez le chien, j ai pu participer à l identification de trois nouveaux gènes, dont deux excellents candidats pour ces maladies homologues humaines. Le troisième représente un vrai modèle spontané de kératodermie K16, ouvrant ainsi des perspectives thérapeutiques qui bénéficieront à l Homme et au chien. - 1-

3 Abstract The dog species (Canis lupus familiaris) contains more than 350 distinct breeds resulting from human drastic selection during the last centuries. Each breed can then be considered as a genetic isolate, developing specific spontaneous genetic diseases with high frequencies. Thus, dogs constitute a powerful model to identify new genes and alleles involved in disorders homologous to human diseases. For my thesis, I worked on two main topics. The first one focused on the search of the genetic causes of two footpad keratodermas in the Irish terrier and the dogue de Bordeaux breeds. Concerning the Irish terrier, the work was conduced by Tosso Leeb s team in the University of Berne, in collaboration with the Antagene Company. Using a Genome Wide Association Study (GWAS) and Next Generation Sequencing (NGS), the mutation in a new gene has been identified in footpad hyperkeratosis in this breed. For the dogue de Bordeaux project, we genotyped more than SNPs on over 200 dogs. We then performed a genetic linkage study with a subset of 68 dogs, including 14 affected dogs. We identified a significant locus of 20 Mb on the canine chromosome 9 containing one keratin cluster. Comparing clinical, histopathological and immunochemistry data, keratin 16 appeared as an excellent candidate. The sequencing of the gene revealed a complex mutation leading to a non-functional truncated K16 protein. Quantitative RT-PCR analyses showed a strong decrease of the level of KRT16 expression in affected footpads. These results led to propose the dogue de Bordeaux footpad hyperkeratosis as the first spontaneous model of focal nonepidermolytic palmoplantar keratoderma (FNEPPK). In parallel, I studied an acral mutilation syndrome described in several hunting dog breeds. This neuropathy corresponds to human hereditary sensory and autonomic neuropathies (HSANs) and is characterized by an insensitivity to pain only in the limb. With a classical GWAS strategy, using 24 affected and 30 unaffected dogs, we identified a 1.5 Mb locus in dogs, the human orthologous locus being still unknown in human patients. Targeted sequencing of this locus revealed one single variant localized in a cis-enhancer region closed to a strong candidate gene. A lower level of expression of the candidate gene in affected dogs seems to show a functional effect of the mutation in the enhancer activity. These results led to propose this variant as the causative mutation for this canine neuropathy, and so this canine model as an opportunity to identify a new human HSAN gene. Combining complementary genetic approaches on spontaneous models of well characterized canine diseases, I did participated to the identification of three new genes, two of which being novel excellent candidates for the homologous human diseases. The third represents a true homologous model of KRT16 human keratoderma, opening the field to the development of new treatments benefiting to both humans and dogs. - 2-

4 Table des Matières Résumé... 1 Abstract... 2 Table des illustrations... 6 Abréviations INTRODUCTION 12 A. L INTERET DE L ESPECE CANINE EN GENETIQUE PAR SON GENOME Un puissant modèle d étude pour l évolution des génomes Apport de la génétique sur l origine du chien Génotypes et races canines Un modèle pour l étude des maladies génétiques humaines Co- sélection de caractères héréditaires : de la beauté à la morbidité Intérêt du chien en tant que modèle génétique Des maladies homologues entre l Homme et le chien Intérêts thérapeutiques et médecine translationnelle B. LES KERATODERMIES : TROUBLES DE LA CORNEOGENESE Les kératodermies palmoplantaires (KPPs) Les formes humaines de KPPs Les kératodermies canines Physiopathologie de la peau Architecture de la peau Les kératinocytes et la cornéogenèse Les structures jonctionnelles Les kératines Génétique des kératodermies Mutations identifiées chez l Homme Gènes codant des kératines Les gènes de structures jonctionnelles Autres gènes décrits Mutations identifiées chez le Chien La parakératose du Labrador retriever Les kératodermies plantaires du terrier irlandais et du dogue de Bordeaux. 50 C. NEUROPATHIES HEREDITAIRES DU SYSTEME SENSITIF ET INSENSIBILITE A LA DOULEUR Les mécanismes périphériques Le nerf périphérique et la notion de nocicepteur Les différents types de fibres nerveuses Neurone et cellule de Schwann : deux types cellulaires complémentaires Le neurone Les cellules de Schwann La myéline Une relation neurone/cellule de Schwann indissociable Facteurs neurotrophiques et leurs récepteurs (Kruger et al. 2010)

5 2. Les neuropathies sensitives héréditaires Les maladies de Charcot- Marie- Tooth (CMTs) Les neuropathies héréditaires sensitives et autonomes (HSANs) Les neuropathies héréditaires sensitives chez le chien Génétique des neuropathies sensitives Les quatre gènes majeurs identifiés dans les CMTs Génétique des HSANs Modèle d étude : les chiens de chasse Le braque allemand Le pointer anglais L English Springer Spaniel L épagneul français RESULTATS 113 A. APPORTS DU MODELE CANIN DANS L IDENTIFICATION DE NOUVEAUX GENES RESPONSABLES DE KERATODERMIES PLANTAIRES : EXEMPLE DU TERRIER IRLANDAIS ET DU KROMFOHRLÄNDER Un chromosome identifié à partir d une étude d association génétique Séquençage ciblé du locus : «Next Generation Sequencing» (NGS) Identification d une mutation causale dans le gène FAM83G B. KERATODERMIE NASOPLANTAIRE DU DOGUE DE BORDEAUX : MODELE D ETUDE POUR LES PACHYONYCHIES CONGENITALES (PC) ET LES KERATODERMIES PALMOPLANTAIRES FOCALES NON EPIDERMOLYTIQUES (FNEPPK) Caractérisation clinique de la KNP du dogue de Bordeaux Étude génétique de la KNP du dogue de Bordeaux Étude d association : un modèle multigénique? Etude de liaison génétique : un locus identifié Sélection d un gène candidat : la kératine Annotation et séquençage Sanger du gène KRT Exploration fonctionnelle de cette mutation Un modèle de Pachyonychie Congénitale 16 ou FNEPPK? C. NEUROPATHIE SENSITIVE DES CHIENS DE CHASSE : MODELE POUR LES NEUROPATHIES HEREDITAIRES HUMAINES ET MISE EN EVIDENCE D UNE MUTATION DANS UNE REGION REGULATRICE D UN GENE CANDIDAT Rappel clinique, recrutement et génotypage Analyses génétiques et identification d un locus associé à la maladie Etude d association et précision du phénotype Confirmation du locus par une étude de liaison génétique Localisation des meilleurs SNPs et gènes candidats Approche multi- race : une histoire commune génétiquement observable Bloc haplotypique et réduction de locus Séquençage ciblé du locus et recherche d un variant causal Validation du variant candidat : une mutation causale? Expression génique et activité enhancer : une mutation inhibitrice? Un effet sur l expression du gène candidat Mise en évidence d une région enhancer chez le chien

6 5. Rôle du LncRNA en amont du gène candidat : un erna Hypothèse générale sur les mécanismes moléculaires mis en œuvre Des perspectives prometteuses DISCUSSION 221 ETUDES DES MALADIES MONOGENIQUES CHEZ L HOMME GRACE AU MODELE CHIEN : SES AVANTAGES ET SES LIMITES Le recrutement: une étape clef dans la réussite d un projet Un silence qui en dit long Importance du diagnostic clinique Etude de l expression des gènes : un challenge particulièrement difficile Etudes génétiques : deux stratégies pour un même objectif chez le dogue de Bordeaux L étude d association sur génome entier (GWAS) L étude de liaison génétique Apport du séquençage haut débit à la recherche en génétique Le séquençage ciblé d un locus Le séquençage complet du génome CONCLUSION 237 Références Bibliographiques Annexes

7 !!! FIGURES!! Table!des!illustrations!et! annexes! Figure!1.! Phylogénie!des!canidés! 13! Figure!2.!! Phylogénie!des!races!de!chiens! 17! Figure!3.! Exemples! de! la! diversité! phénotypique! existante! chez! le! chien! 18! Figure!4.!! Pedigree!de!la!race!dogue!de!Bordeaux! 20! Figure!5.! Les!différents!phénotypes!existants!dans!la!race!Shar"Peï! 21! Figure!6.!! Figure!7.!! Illustration! de! l homologie! clinique! et! génétique! de! l ichtyose! du! golden! retriever! et! de! l ichtyose! humaine! de! type!arci!(autosomal!recessive!congenital!ichthyosis)! 26! Exemples! de! KPPs! (ici! patient! atteint! de! pachyonychie! congénitale!de!type!16)! 34! Figure!8.!! Schéma!représentant!une!coupe!transversale!de!peau! 36! Figure!9.!! Évolution!des!kératinocytes!au!cours!de!la!cornéogenèse! 39! Figure!10.!! Figure!11.!! Figure!12.!! Structures! moléculaires! des! jonctions! d adhérences! (A)! et! des!desmosomes!(b)! 41! Observations!microscopiques!des!réseaux!de!kératines!dans! des! cellules! épithéliales! grâce! à! des! marquages! immunofluorescents! 45! Les! trois! grands! axes! neuronaux! de! la! perception! de! la! douleur! 53! Figure!13a.!! Coupe!longitudinale!du!système!nerveux!périphérique! 54! Figure!13b.!! Coupe!transversale!d une!fibre!nerveuse.! 54! Figure!14.!! Schéma! représentant! les! différentes! terminaisons! nerveuses!présentes!dans!la!peau! 55! Figure!15.!! Neurones!et!cellules!de!Schwann! 57!!! "6"! 0

8 Figure!16.!! Les! grandes! étapes! de! maturation! des! cellules! souches! neuronales! 59! Figure!17.!! La!régénération!axonique! 62! Figure!18.!! Figure!19.!! Figure!20.!! Figure!21.!! Figure!22.!! Figure!23.!! Figure!24.!! Figure!25.!! Schéma! bilan! des! possibles! communications! existantes! entre!les!neurones!et!les!cellules!de!schwann! 63! Classification! des! différentes! formes! de! maladies! de! Charcot"Marie"Tooth! selon! leur! mode! de! transmission! génétique!et!selon!leur!gène!muté! 67! Représentation!de!la!diversité!des!gènes!impliqués!dans!des! formes!de!cmts!(a)!et!d HSANs!(B)! 75! Manhattan! plot! représentant! les! résultats! de! l étude! d association! (GWAS)! de! l hyperkeratose! podale! des! terriers!irlandais! 101! Manhattan! plot! représentant! les! résultats! de! l étude! d association!(gwas)!de!la!knp!du!dogue!de!bordeaux! 115! Représentation! graphique! des! résultats! de! l analyse! de! liaison! génétique! menée! sur! 69! dogues! de! Bordeaux! génotypés! avec! 170! 000! SNPs! répartis! sur! l ensemble! du! génome!(logiciel!superlink)! 116! Représentation! graphique! des! résultats! de! l analyse! de! liaison! génétique! des! SNPs! sur! le! locus! de! 20! Mb! du! chromosome!9! 117! Immunomarquages!des!kératines!1,!6!et!16!sur!des!biopsies! de!coussinets!atteints!et!sains!de!dogues!de!bordeaux! 118! Figure!26.!! Locus!du!CFA!9!des!kératines!canines! 119! Figure!27.!! Identification!d une!mutation!du!gène!krt16! 120! Figure!28.!! Figure!29.!! Manhattan! plot! représentant! les! résultats! de! l étude! d association!(gwas)!chez!l épagneul!francais! 153! Représentation! du! bloc! haplotypique! homozygote! sur! le! locus! du! CFA! 4! défini! par! les! SNPs! ayant! les! meilleurs! p" values!associées!à!la!maladie.! 153! Figure!30.!! Manhattan!plot!des!résultats!des!100!000!permutations! 154! Figure!31.!! Représentation! graphique! du! locus! identifié! sur! le! CFA! 4! (ici,! 10! Mb! représentés)! au! cours! de! l étude! de! liaison! effectuée!sur!22!chiens!génotypés!(dont!10!atteints)! 154!!! "7"! - 1-

9 Figure!32.!! Représentation! graphique! des! distances! génétiques! calculées! entre! les! individus! deux! à! deux! (MDS=Multidimensional!Scaling)! 154! Figure!33.!! Représentation! du! bloc! haplotypique! homozygote! de! 1,5! Mb! sur! le! locus! du! CFA! 4! partagé! par! les! quatre! races! de! chiens!de!chasse! 156! Figure!34.!! Figure!35.!! Annotation!des!ARNs!longs!non!codants!(lncRNA)!du!locus! de!1,5!mb!obtenue!à!partir!des!rnaseq!de!58!chiens! 158! Position! du! variant! AMS! identifié! dans! un! lncrna! situé! en! amont!du!gène!a! 159! Figure!36.!! Représentation! du! bloc! haplotypique! de! 1,5! Mb! homozygote! chez! les! quatre! races! de! chiens! de! chasse! et! hétérozygote!chez!le!terrier!irlandais! 161! Figure!37.!! Structure! du! gène! candidat! A! et! de! sa! protéine! selon! l annotation!du!site!ucsc! 163! Figure!38.!! Niveaux!d expression!du!gène!a!et!du!lncrna!(lncdog1)! 165!!Figure!39.!! Figure!40.!! Figure!41.!! Recherche! des! régions! «!enhancer!»! chez! le! chien! à! partir! d alignements!avec!les!génomes!de!l Homme!et!de!la!souris! 166! Résultats!des!RT"PCRq! montrant! les! niveaux! d expression! du!gène!de!référence!(ppib),!du!lncrna!(lncdog1),!et!des! gènes!a,!b,!c!et!f! 167! Mise!en!évidence!d une!activité!enhancer!du!lncrna!chez!le! chien! 168! Figure!42.!! Schéma! bilan! illustrant! le! mécanisme! moléculaire! possiblement! mis! en! œuvre! dans! l expression! du! gène! candidat! A! (carré! bleu),! et! la! conséquence! d une! mutation! dans!sa!région!cis"régulatrice!(en!vert)! 169!! TABLEAUX!! Tableau!1.!! Liste! des! kératodermies! palmoplantaires! humaines! héréditaires! 32! Tableau!2.!! Liste! des! kératines! associées! à! une! maladie! héréditaire! identifiée!chez!l Homme! 44! Tableau!3.!! Liste!des!gènes!impliqués!dans!des!KPPs!humaines! 46!!! "8"! 8

10 Tableau!4.!! Tableau!5.!! Tableau!6.!! Tableau!7.!! Tableau!8.!! Caractéristiques! morphologiques! et! physiques! des! quatre! types! de! fibres! nerveuses! constituant! le! système! nerveux! périphériques.! 55! Classification! des! différentes! formes! de! HSANs! (d après! Rotthier!et!al.,!2012)! 68! Liste! des! neuropathies! héréditaires! motrices! et! sensitives! canines!recensées!en!2010! 73! Liste!des!neuropathies!héréditaires!sensitives!et!autonomes! canines!recensées!en!2010! 74! Coordonnées!(Broad!CanFam!2,!May!2005)!et!p"values!(test! du! chi"2)! des! 20! meilleurs! SNPs! résultant! de! l étude! d association! 101! Tableau!9.!! Liste!des!10!meilleurs!SNP!liés!à!la!maladie! 116! Tableau! 10.! Valeurs! des! p"values! des! 10! meilleurs! SNPs! associés! au! syndrome!d automutilation!acrale!des!épagneuls!français! 155!! ANNEXES!! Annexe!1.! Principe!du!séquençage!ciblé!par!NGS! 224! Annexe!2.! Questionnaire!clinique!envoyés!aux!propriétaires!de!dogues! 225! Annexe!3.! Annexe!4.!! Annexe!5.!! Photos! de! dogues! présentant! des! symptômes! cliniques! proches! d une! kératodermie! plantaire,! mais! pourtant! non! mutés!pour!le!gène!krt16! 228! Questionnaire!clinique!envoyés!aux!propriétaires!de!chiens! de!chasse! 229! Protocole! d extraction! d ARN! à! partir! de! tissu! conservé! en! RNAlater! 232! Annexe!6.!! Principe!du!ChIP"Seq! 235!!! - 9- "9"!

11 Abréviations ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire AMS : «Acral Mutilation Syndrome» ARN : Acide RiboNucléique CFA : Canis Familiaris chromosome ChIP- Seq : Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)- Séquençage(Seq) CMH : Complexe Majeur d Histocompatibilité CMT : Maladie de Charcot- Marie- Tooth CNG : Centre national de Génotypage CNV : «Copy Number Variation» DCP : Dyskinésie Ciliaire Primitive DMD : «Duchenne Muscular Dystrophy» dntp : désoxynucleotide TriPhosphate DRG : «Dorsal Root Ganglia» EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétracétique ESS : English Springer Spaniel FCI : Fédération Cynologique Internationale FNEPPK : Focal Non Epidermolytic Keratoderma GWAS : «Genome Wide Association Study» HSAN : Hereditary Sensory and Autonomic Neuropathy IASP : Association Internationale pour l Etude de la Douleur Kb : Kilobase - 10-

12 KPP : Kératodermie PalmoPlantaire LncRNA : ARN long non codant LOD : Logarithme des Odds LOF : Livre des Origines Français MAF : «Minor Allele Frequency» Mb : Mégabase MDS : «Multi dimentional Scale» NGF : «Nerve Growth Factor NGS : «Next Generation Sequencing» NRG : Neuréguline Pb : Paire de bases PCR : «Polymerase Chain Reaction» QTL : «Quantitative Trait Loci» RNAseq : Séquençage haut débit d ARN SINE : «Short Interspread Nucleotide Element» SNC : Système Nerveux Central SNP : «Single Nucleotide Polymorphism» UV : Ultra- Violet - 11-

13 INTRODUCTION 12

14 Introduction Figure 1. Phylogénie des canidés Cet arbre phylogénétique est basé sur l analyse de 15 kb de séquences introniques et exoniques. Les couleurs des quatre branches correspondent aux quatre grands taxons de canidés identifiés. Les valeurs de bootstrap sont représentées au niveau de chaque embranchement et le temps de divergence est indiqué en millions d années (Myr). Les noms surlignés correspondent aux espèces représentées à droite de la figure (d après Lindlad- Toh et al., 2005)

15 Introduction A. L INTERET DE L ESPECE CANINE EN GENETIQUE PAR SON GENOME Le chien est le meilleur ami de l Homme mais c est surtout la première espèce domestiquée bien avant les bovidés (Savolainen et al. 2002). Si on observe aujourd hui un chien dans la rue, on est loin de s imaginer qu il est le fruit d une domestication opérée par l Homme, il y a plusieurs milliers d années à partir du loup et qui se poursuit encore avec la création régulière de nouvelles races. En effet, l espèce canine se compose aujourd hui de plus de 350 races définies par des traits morphologiques et comportementaux propres à chacune. Cependant, si le chien représente un modèle original par sa diversité phénotypique inter- races, il est également unique par la très forte homogénéité phénotypique observée au sein de chaque race (Ostrander and Giniger 1997; Galibert et al. 2004; Sutter and Ostrander 2004). A partir de données de séquençage léger du génome canin (Kirkness et al. 2003) et des données de cartographie de gènes grâce à l utilisation d hybrides irradiés (Hitte et al. 2005), la séquence complète du génome canin avec une bonne couverture (7,5x) a pu être publiée en 2005 dans la revue Nature (Lindblad- Toh et al. 2005). Dès lors, de nombreuses études génétiques ont été réalisées non seulement pour rechercher des gènes responsables de traits morphologiques particuliers mais aussi pour identifier des gènes mutés impliqués dans des maladies qui apparaissent de manière spécifique dans certaines races. 1. Un puissant modèle d étude pour l évolution des génomes 1.1. Apport de la génétique sur l origine du chien Le chien, Canis Familiaris, est un mammifère de l ordre des carnivores appartenant à la famille des canidés (Figure 1). Cette famille regroupe 35 espèces en 15 genres. Le chien appartient au genre Canis, qui regroupe également le loup, le dingo, le chacal et le coyote. Toutes ces espèces partagent le même nombre de chromosomes (78 chromosomes essentiellement acrocentriques) et sont théoriquement interfécondes (Vilà et al. 1999)

16 Introduction Si l on sait aujourd hui que tous les chiens descendent du loup, cela n a pas toujours été le cas. En effet, Charles Darwin pensait que le loup, le chacal et le coyote avaient été hybridés pour obtenir les différentes races de chien (Darwin 1860). Au cours de ces dernières décennies, les données de paléontologie associées à des données de biologie moléculaire sur les ADNs mitochondriaux et nucléaires, nous ont permis d en apprendre un peu plus sur les origines ancestrales du chien, ainsi que sur les modalités de sa domestication. En effet, depuis les premières comparaisons morphologiques et comportementales menées par Olsen en 1977, des travaux menés sur l ADN mitochondrial de canidés ont révélé que le chien et le loup partagent une très forte parenté, supérieure à celle observée chez les autres espèces de cette famille (Wayne 1993; Vilà et al. 1997; Leonard et al. 2002; Savolainen et al. 2002; Pang et al. 2009; Thalmann et al. 2013). Des questions restent cependant toujours en suspens quant à la date et la localisation des premiers foyers de domestication. Les premières données archéologiques estimaient cette domestication autour de ans environ (Clutton- Brock 1995) faisant du chien la première espèce domestiquée par l Homme (espèces animales et végétales réunies), et la seule domestiquée au Paléolithique. Cependant, de récentes découvertes remettent en cause cette date. Le plus vieux squelette de chien montrant des marques de différenciation par rapport au loup a été daté à ans avant notre ère (Germonpré et al. 2009) et l étude des ADNs mitochondriaux de fossiles de chiens a révélé que les races modernes de chiens s apparenteraient à ces fossiles, remettant en cause non seulement la date de domestication du chien, mais également son origine géographique (Thalmann et al. 2013). En effet, s il y a bien un point qui fait encore débat aujourd hui, c est l origine géographique de cette domestication. Les premières études menées sur l ADN mitochondrial de plusieurs canidés indiquaient qu un nombre limité de loups femelles d Asie Orientale pouvait être à l origine des chiens domestiques actuels (Vilà et al. 1999; Leonard et al. 2002; Savolainen et al. 2002)

17 Introduction En comparant les fréquences d allèles distribués sur le locus du Complexe Majeur d Histocompatibilité (CMH issu de l ADN nucléaire) entre des populations de loups et des chiens, il semblerait que plusieurs populations de centaines d animaux auraient contribué à la création des chiens actuels, avec des croisements importants (intentionnels ou accidentels) avec d autres canidés sauvages. Plus récemment, des travaux basés sur des polymorphismes nucléotidiques de l ADN nucléaire indiquaient une origine moyen- orientale du chien (vonholdt et al. 2010; Vaysse et al. 2011). Les derniers travaux de l équipe de Robert Wayne, publiés l année dernière dans la revue Science vont dans le sens d une origine européenne du chien, datée vers ans avant notre ère et donc associée à une époque où l Homme n était encore que nomade «chasseur- cueilleur» et non «agriculteur sédentaire» (Thalmann et al. 2013). Cette date est donc la dernière référence actuelle mais sera probablement débattue de nouveau avec de futures découvertes de fossiles de canidés. Concernant les mécanismes mis en jeu lors de la domestication des premiers chiens, plusieurs hypothèses ont été formulées. Par exemple, l idée que l Homme ait sélectionné certains loups pour la défense des ressources ou pour la chasse semble probable. D autres parlent d une proto- domestication, c est- à- dire que les loups auraient profité des déchets alimentaires humains pour se nourrir plus facilement (Coppinger and Coppinger 2001; Galibert et al. 2011). Ce comportement rappelle fortement celui de certains renards ou des ours qui viennent aujourd hui se nourrir directement dans les poubelles des grandes villes notamment les ours polaires. Ces premiers chiens/loups se seraient donc rapprochés des villages humains et certains se seraient laissé approcher par l Homme. Les hommes y auraient ainsi trouvé un avantage, non seulement pour se débarrasser des déchets, mais aussi pour faire fuir d autres animaux nuisibles. Ainsi, cette forme de commensalisme pourrait être à l origine de la domestication du chien par l Homme (Coppinger and Coppinger 2001). La dernière découverte extrêmement enrichissante du point de vue des mécanismes potentiellement mis en jeu lors de la domestication du chien est le changement de régime alimentaire (Axelsson et al. 2013; Arendt et al. 2014). En - 16-

18 Introduction effet, grâce à un re- séquençage complet de génomes de chiens et de loups, 36 régions génomiques ont été identifiées comme des signatures de sélection, c est- à- dire que ces régions génomiques ont été fixées au cours de la création de la lignée Canis lupus familiaris. Dans ces régions, des mutations de gènes impliqués dans la digestion ont pu être mises en évidence et confirmées par PCR quantitatives, montrant une différence significative dans l expression de ces gènes entre le loup et le chien. L hypothèse d un changement de régime alimentaire sélectionnant des individus adaptés pour digérer de nouvelles sources de nourriture obtenues auprès de l Homme a donc été proposée (Axelsson et al. 2013). Cependant, cette découverte est aujourd hui controversée. Il semblerait que ces mutations ne soient que le reflet d un polymorphisme existant déjà dans les autres lignées de canidés (Arendt et al. 2014). Des recherches sont donc en cours pour tenter de confirmer ou non ces observations. Il est intéressant de réaliser des analyses génétiques sur des ADNs anciens. Ainsi, la couleur est un des premiers critères morphologiques sélectionnés de façon naturelle, et peut- être même artificiellement par l Homme au cours de la domestication. En effet, des ADNs extraits à partir de fossiles de chien collectés en Europe par Jean Denis- Vigne (MNHN- Paris) ont permis de mettre en évidence en particulier une mutation du gène MC1R responsable de la couleur claire (Ollivier et al. 2013) Génotypes et races canines Après sa séparation avec le loup, d un point de vue phylogénétique, le chien a connu un second goulet d étranglement du point de vue génétique. Depuis que l Homme a domestiqué le chien, il n a cessé de rechercher des critères morphologiques et comportementaux précis pour satisfaire différents besoins comme l aide à la chasse, la protection des biens et des personnes, ou bien plus récemment celui d avoir un animal de compagnie élégant à regarder. Sélectionnant uniquement les chiens présentant des traits recherchés tels que la taille ou bien une texture de poils particulière, et les utilisant comme reproducteurs majeurs dans chaque race, l Homme a ainsi créé plus de 350 races - 17-

19 Introduction Figure 2. Phylogénie des races de chiens Les comparaisons de marqueurs SNPs analysés par fenêtre de 10 SNPs ont permis d identifier des régions chromosomiques propres à chaque race. Chaque couleur de branche correspond à une fonction particulière du chien (garde, chasse ). Les points indiquent des valeurs de bootstrap supérieures à 95% calculées pour réplicats (d après Vonholdt et al., 2010) - 18-

20 Introduction canines, notamment au cours des XVIIIème et XIXème siècles. La plupart de ces races sont très différentes entre elles et sont réparties en 10 groupes par la Fédération Cynologique Internationale (FCI). Cette classification est principalement basée sur la morphologie et les aptitudes des différentes races sans forcément tenir compte de l historique de leur création. Par exemple, le groupe 1 regroupe tous les chiens de bergers, le groupe 3 rassemble les terriers et le groupe 10 correspond aux lévriers. D autres groupes présentent des phénotypes beaucoup plus variés. Ainsi, on retrouve dans le groupe 2, des chiens ayant des tailles très différentes, dont le pinscher nain mesurant environ 25 cm au garrot pour 5 kg, le dogue de Bordeaux mesurant 65 cm pour 60kg, le dogue allemand (85 cm, 60 kg) ou bien le chien de montagne des Pyrénées (75 cm, 55kg). Grâce aux outils modernes de génétique, cette catégorisation des races peut être retrouvée en comparant certains marqueurs génétiques (marqueurs microsatellites, nucléotides polymorphes). Ainsi, dans des études rassemblant de grandes cohortes de centaines de chiens appartenant à plus de 80 races, les principaux groupes de chiens tels que les races «anciennes», les chiens de type «mastiff», les chiens de bergers et les races européennes d origines récentes, peuvent être génétiquement identifiés grâce à des marqueurs microsatellites (Parker et al. 2004; 2007). Plus récemment, comme le montre la figure 2, les comparaisons de marqueurs SNPs ont permis d identifier des régions chromosomiques propres à chaque race (Boyko et al. 2010; vonholdt et al. 2010; Vaysse et al. 2011), allant jusqu à permettre l identification de gènes impliqués dans certains phénotypes particuliers. S il est un caractère morphologique remarquable et extrêmement variable dans la race canine, c est bien la taille. En effet, si on regarde l ensemble des races de chiens, on peut constater un panel allant de quelques centimètres au garrot (Yorkshire terrier, chihuahua), à plus d un mètre (dogue allemand, lévrier irlandais). Une première étude a permis d identifier le gène IGF1 («Insulin- like Growth Factor 1») comme un gène majeur dans la variation de taille des chiens. En comparant les dimensions mesurées sur les radiographies de 500 chiens - 19-

21 Introduction Figure 3. Exemples de la diversité phénotypique existante chez le chien a. Représentation des différentes textures de poils rencontrées chez les teckels. b. Effet du SINE identifié dans le gène SILV sur la couleur de la robe des chiens. c. Conséquence d une mutation du gène codant la myostatine chez le whippet

22 Introduction d eau portugais, un locus de caractères quantitatifs (QTL : «Quantitative Trait Locus») a été identifié sur le chromosome 15 (Chase et al. 2002; Sutter et al. 2007). Cette région chromosomique a été examinée sur un plus large panel de races de chiens de différentes tailles, confirmant l association de ce QTL avec la taille de chaque race. Les auteurs ont ainsi montré que le gène IGF1 contenu dans ce locus et déjà décrit chez l Homme et la souris pour être impliqué dans les variations de tailles entre individus, l était également chez le chien (Sutter et al. 2007). Par la suite, sept marqueurs proches des gènes IGF1, IGF1R, GHR, HMGA2, SMAD2 et STC2, ont été identifiés permettant ainsi d expliquer les différences de taille observées dans 50 % de la population canine (Hoopes et al. 2012; Rimbault and Ostrander 2012). Une autre découverte est particulièrement intéressante pour expliquer la taille de certaines races présentant des petits membres (chondrodysplasie). En comparant les ADNs de huit races de chiens dont les teckels, le Welsh corgi et le basset Hound avec les ADNs de 64 races présentant une taille standard, ils ont identifié un rétrogène de FGF4 expliquant le phénotype «membres courts» (Parker et al. 2009). L hypothèse d une surexpression de ce gène expliquerait le fait que ces races soient chondrodysplasiques, en interagissant par exemple avec le récepteur FGFR3 décrit comme responsable de formes de nanisme chez l Homme. Un autre caractère pris en compte dans la nomenclature des noms de races de chiens est le pelage. En effet, on rencontre souvent des races qui se distinguent uniquement par leur pelage comme c est le cas pour les teckels au poil ras, long ou dur (Figure 3a). Dans une étude d association regroupant plus de 1000 chiens sélectionnés dans 80 races, trois gènes ont pu être identifiés (Cadieu et al. 2009). Ces 80 races représentaient les différents types de pelage comme le poil ras ou long, raide ou bouclé, lisse ou dur. L équipe du Dr Ostander a également étudié un dernier caractère : le «furnishing» correspondant à la présence de poils au niveau des sourcils, de la moustache et des pattes antérieures, trait particulièrement visible chez le terrier écossais ou les schnauzers. Ainsi, les combinaisons alléliques de ces trois gènes RSPO2, FGF5 et - 21-

23 Introduction KRT71 (respectivement «R- spondin- 2, Fibroblast Growth Factor- 5 et Keratin 71»), ont permis d expliquer le pelage de plus de 95 % des races présentes aux États- Unis (Cadieu et al. 2009). D autres travaux se sont intéressés Concernant cette fois- ci la couleur de la robe des chiens en relation avec une des particularités du génome canin : les SINEs. Ainsi, une insertion de séquence de type SINE a été identifiée au niveau d une jonction intron- exon dans le gène SILV (silver) conduisant à la couleur de robe merle (Figure 3b) observable dans de nombreuses races de chiens comme le dogue allemand, le berger des Pyrénées, le beauceron et les races bergères apparentées aux colleys (colley, berger australien, border collie, Cardigan Welsh corgi ) (Clark et al. 2006; Hédan et al. 2006). Les individus hétérozygotes présentent une couleur de robe diluée au niveau de l eumélanine, tandis que chez les chiens homozygotes mutés, la dilution tend à être complète donnant une dépigmentation totale. L insertion du SINE en sens inverse du gène, créerait l apparition d un nouveau site d épissage, modifiant le transcrit du gène SILV provoquant ainsi un nouveau phénotype (Clark et al. 2006). En effet, les SINEs (Short INterspersed Element) sont des éléments rétrotransposables d environ 200 paires de bases (pb) et environ 50% des gènes canins annotés contiendraient au moins un SINE (Wang and Kirkness 2005). Ces SINEs sont donc très fréquents chez le chien et participent sûrement à la diversité phénotypique de l espèce canine provoquant parfois même des maladies génétiques (Maurer et al. 2012). Il existe de nombreux autres gènes ou loci décrits associés à des traits morphologiques propres à certaines races ou groupe de races comme par exemple la brachycéphalie (tête courte et large au museau aplati) observée chez le boxer, les bouledogues, les carlins, les dogues de Bordeaux (Bannasch et al. 2010; Schoenebeck et al. 2012). Un autre exemple illustre la relation génétique et performance physique chez le chien : l identification d une mutation du gène de la myostatine. Comme chez les bovins, il existe des chiens présentant des muscles hypertrophiés, et plus particulièrement certains whippets nommés - 22-

24 ? Introduction Figure 4. Pedigree de la race dogue de Bordeaux On y voit parfaitement le phénomène de sur- utilisation d étalons champions de beauté dans la reproduction. Sur ce pedigree «en étoiles», chaque rond correspond à une femelle, chaque carré représente un mâle. On peut remarquer qu un premier mâle champion international de beauté s est accouplé avec 13 femelles correspondant aux extrémités de l étoile supérieure. Un de ses fils est devenu champion et a été également accouplé à une douzaine de femelles. Cette pratique est à l origine de l appauvrissement génétique dans les races de chiens, et peut entraîner la dissémination rapide d allèles morbides dans la population

25 Introduction également «Bully- whippets» (Figure 3c). Une mutation du gène MSTN a été identifiée chez ces chiens expliquant ce phénotype si particulier (Mosher et al. 2007). Les individus homozygotes pour cette mutation ne sont pas gardés par les éleveurs. En effet, le whippet appartient au groupe des lévriers et est principalement utilisé comme chien de course. Des chiens présentant donc une hypertrophie des muscles ne peuvent être utilisés comme chiens de course et sont donc la plupart du temps euthanasiés. Chose intéressante cependant, les chiens hétérozygotes présentent une musculature plus importante que le Whippet standard et ont de meilleures performances lors de courses de vitesse. On a donc là une illustration parfaite entre le génome d un individu, son phénotype et ses performances physiques. Ainsi, l espèce canine présente une grande diversité phénotypique entre toutes ses races, mais avec cependant une forte homogénéité phénotypique observable au sein de chacune d elles, reflet d une forte homogénéité génotypique. En effet, pour maintenir les standards morphologiques établis, les éleveurs n utilisent lors des saillies, que des étalons «champion de beauté ou de travail» présentant les critères imposés par le standard de la race. Ainsi, un seul mâle champion peut s accoupler avec plus d une vingtaine de femelles, produisant de ce fait plusieurs centaines de descendants (Figure 4). Cet effet «mâle champion» est d autant plus amplifié par le recours à l insémination artificielle par semence congelée, et ce, encore plusieurs années après le décès du mâle reproducteur. La principale conséquence de cette pratique est une perte progressive de la diversité génétique dans la race. Mais ce n est pas le seul effet car les éleveurs pratiquent très souvent des mariages consanguins. Cette consanguinité entraînant une diminution des hétérozygotes dans la population, les proportions d Hardy- Weinberg ne sont donc pas retrouvées dans les races canines. L homogénéité phénotypique observée et recherchée pour répondre au standard de race découle donc d une homogénéité génotypique, résultat d une dérive génétique orchestrée par la main de l Homme

26 Introduction Figure 5. Les différents phénotypes existants dans la race Shar- Peï (Photo extraite d Olsson et al., 2011) - 14-

27 Introduction Ainsi, par sa structure génétique et son histoire, chaque race peut être considérée comme un isolat génétique, au même titre que certaines populations humaines insulaires ou isolées par leur culture. 2. Un modèle pour l étude des maladies génétiques humaines 2.1. Co- sélection de caractères héréditaires : de la beauté à la morbidité La domestication du chien par l Homme et la création de nombreuses races ont non seulement abouti à des races spécialisées dans des tâches particulières telles que la chasse ou la défense du foyer, mais ont également permis de produire des individus parfaitement homogènes d un point de vue morphologique. L effet de cette sélection artificielle a cependant eu des conséquences néfastes sur l espèce canine. Rendant chacune de ces races de plus en plus homozygote du point de vue génotypique, l Homme a malencontreusement co- sélectionné des allèles impliqués dans des traits morphologiques recherchés, mais aussi des allèles responsables de maladies génétiques (Ostrander and Giniger 1997; Galibert et al. 2004; Sutter and Ostrander 2004). L exemple le plus parlant est sûrement le travail réalisé par l équipe du Dr. Lindblad- Toh sur la race Shar- Peï (Olsson et al. 2011). Cette race, créée à l origine pour la garde et la chasse a rapidement été détournée en chien de combat. De ce fait, plusieurs critères morphologiques ont été sélectionnés pour assurer une meilleure défense du chien. Ainsi, les yeux enfoncés dans les plis de la face, la peau épaisse et ample ont été des critères recherchés et sélectionnés par l Homme, rendant ces traits morphologiques caractéristiques de la race (Figure 5). Suite à une étude comparative entre des Shar- Peïs présentant des plis de peau importants et des individus non plissés dit «type sauvage», Olsson et ses collaborateurs ont identifié une région chromosomique portant une duplication de 16,1 Kb correspondant à un CNV («Copy Number Variant») en amont du gène HAS2 (Hyaluronic Acid Synthase 2) codant une enzyme impliquée dans les voies de régulation de l acide hyaluronique. Ce composant serait à l origine de cette peau épaisse et plissée des Shar- Peïs. Plus le nombre de copies - 15-

28 Introduction du CNV est important et plus le chien présente une peau épaisse et plissée. Malheureusement, ce n est pas le seul caractère associé à ce CNV que les éleveurs ont involontairement sélectionné. En effet, les chiens extrêmement plissés présentent également des épisodes de fièvre extrêmement forte (Olsson et al. 2011). Ce syndrome, plus communément appelé la «Fièvre du Shar- Peï», est une maladie propre à cette race apparaissant chez les individus les plus plissés. Cette étude a permis de révéler une parfaite corrélation entre la sélection de chiens très plissés, les fortes crises de fièvre de ces individus et le nombre de copies du CNV présent en amont du gène HAS2, proposant ainsi un rôle de l acide hyaluronique dans la réponse inflammatoire (Olsson et al. 2011). Cet exemple reflète parfaitement le terme de co- sélection d allèles, illustrant pourquoi aujourd hui, chaque race est prédisposée à développer une ou plusieurs maladies héréditaires, souvent sur un mode monogénique simple, majoritairement récessif Intérêt du chien en tant que modèle génétique. Le modèle souris est le plus couramment utilisé dans les études génétiques, mais à la différence du chien où les maladies se développent de manière spontanée, elles sont le plus souvent induites. De plus, les résultats obtenus sur la souris sont difficilement transposables à l Homme du fait des différences physiologiques et environnementales entre cette espèce et l Homme (Ostrander and Kruglyak 2000). Partageant le même environnement que l Homme, le chien développe des maladies qui apparaissent de manière spontanée avec souvent de fortes prévalences (Giger et al. 2006). Par exemple, chez le dalmatien, 30% de la population présente des problèmes auditifs (Cargill et al. 2004). Il en est de même pour certains cancers comme le sarcome histiocytaire qui touche un bouvier bernois sur quatre et provoque la mort des individus atteints autour de 5-6 ans (Hédan et al. 2011; Shearin et al. 2012). Ainsi, on dénombre aujourd hui plus de 500 maladies héréditaires chez le chien (OMIA ;

29 Introduction Un des points forts du modèle canin est l accès à de larges familles dans lesquelles les traits étudiés ségrègent avec de fortes incidences. Ainsi, à partir du pedigree de chaque chien (représentant quatre générations), on peut dessiner un arbre généalogique de la race et proposer des hypothèses sur le mode de transmission de la maladie. Grâce à ces pedigrees et à l ADN des chiens qui le composent, on peut également mener des études de liaison génétique sur plusieurs générations. C est cette approche que j ai choisi d utiliser pour le projet de recherche sur la kératodermie nasoplantaire du dogue de Bordeaux. Les études de liaison ont été les premières techniques utilisées chez le chien pour rechercher les causes génétiques de traits phénotypiques ou de maladies spécifiques de races (Yuzbasiyan- Gurkan et al. 1997; Acland et al. 1998; Jónasdóttir et al. 2000; Tiret et al. 2003; Hédan et al. 2006). Ces études ont d abord été réalisées en génotypant des marqueurs microsatellites sur des chiens atteints et non atteints appartenant tous à une même famille. Les microsatellites sont de courtes séquences, composées de deux à six nucléotides, répétées en tandem et flanquées de séquences uniques. Le polymorphisme des microsatellites est dû à la variation du nombre de répétitions du motif de base d une génération à l autre qui se produit pendant la réplication de l ADN. Ces séquences sont dispersées tout le long du génome à raison d un microsatellite tous les 50 kb en moyenne chez le chien (Ostrander et al. 1993; Jouquand et al. 2000). Suite au séquençage complet du génome canin, d abord à partir d un grand caniche mâle en 2003 avec une couverture moyenne de 1x, puis à partir d un boxer femelle en 2005 avec une couverture de 6,5x, près de trois millions de nucléotides polymorphes (SNP=Single Nucleotide Polymorphism) ont été découverts, permettant le développement de nouveaux outils technologiques comme les puces à SNPs (Kirkness et al. 2003; Lindblad- Toh et al. 2005; Boyko et al. 2010; Vaysse et al. 2011). Avec la découverte de ces nouveaux marqueurs, une nouvelle approche génétique, le GWAS (Genome Wide Association Study) ou étude d association pangénomique, a été de plus en plus utilisée chez le chien. Il s agit de comparer, non plus des individus appartenant à une seule famille, mais à une grande cohorte de chiens non apparentés, appartenant à la même race dans le cadre - 17-

30 Introduction d une maladie spécifique à la race, ou bien regroupant des individus appartenant à plusieurs races et partageant les mêmes phénotypes. Cette approche a fait ses preuves pour plusieurs domaines de recherche, que ce soit en ophtalmologie, en dermatologie, en cardiologie, en cancérologie, et bien d autres encore (Olsson et al. 2011; Grall et al. 2012; Yokoyama et al. 2012; Ahonen et al. 2013; Karyadi et al. 2013; Tengvall et al. 2013) ou simplement pour des traits phénotypiques tels que la texture des poils, la taille, la couleur de pelage, etc. (Clark et al. 2006; Cadieu et al. 2009; Parker et al. 2009; Boyko et al. 2010; Vaysse et al. 2011; Schoenebeck et al. 2012; Rimbault et al. 2013). J ai choisi d appliquer cette approche dans mon second projet concernant un syndrome d automutilation acrale qui ségrège dans plusieurs races de chiens de chasse partageant une histoire commune, laissant sous- entendre un effet fondateur entre ces races Des maladies homologues entre l Homme et le chien. Suite au séquençage complet du génome canin en 2005, et à la définition de plus de 3 millions de SNPs, des études de grande envergure ont vu le jour dans la petite communauté scientifique de la génétique canine. En 2008, le consortium LUPA ( financé par la commission européenne, a regroupé les cliniciens vétérinaires et les généticiens de 12 pays européens. L objectif de ce consortium était d identifier les déterminants génétiques de malades génétiques complexes (cancers, maladies cardiovasculaires, affections neurologiques) dans l idée de se servir du modèle canin comme modèle d étude pour les maladies génétiques homologues humaines. En effet, la particularité du modèle canin réside non seulement dans l apparition spontanée de certaines maladies génétiques chez le chien, mais aussi dans l homologie de ces maladies avec certaines formes humaines (Galibert et al. 2004; Galibert and André 2008; Karlsson and Lindblad- Toh 2008; Ostrander 2012). Par exemple, on trouve des modèles de nombreuses maladies monogéniques comme des troubles respiratoires, des désordres neuro- sensoriels tels que des rétinopathies, des épilepsies, des myopathies, mais aussi des troubles dermatologiques tels que l épidermolyse bulleuse, des ichtyoses, des kératodermies (Spirito et al. 2006; Beggs et al. 2010; Merveille et al. 2011; Seppälä et al. 2011; Grall et al. 2012)