ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON LES MYCOTOXINES CHEZ LES BOVINS THESE

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1 ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON Année Thèse n LES MYCOTOXINES CHEZ LES BOVINS THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 12 décembre 2008 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par FANGEAT Loïc Né (e) le 30 mars 1984 à CREST (26)

2 ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON Année Thèse n LES MYCOTOXINES CHEZ LES BOVINS THESE Présentée à l UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 12 décembre 2008 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par FANGEAT Loïc Né (e) le 30 mars 1984 à CREST (26) 2

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6 Remerciements : A Monsieur le professeur Gilbert KIRKORIAN De la faculté de médecine de Lyon, Qui nous fait l honneur d accepter la présidence de notre jury de thèse. Hommage respectueux. A Monsieur le Docteur ALVES DE OLIVERA Laurent De l Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Que nous remercions particulièrement pour ses précieux conseils, sa disponibilité et sa bienveillance, Qu il trouve ici le témoignage de notre gratitude et de notre admiration. A Monsieur le Professeur BERNY Philippe De l Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, Qui a accepté de s intéresser à cette thèse et nous a fait l honneur de participer à notre jury. Sincères remerciements. 6

7 A Helena : parce que tu es un soleil dans ma vie. Aux personnes toujours présentent dans mon cœur : Mamie Simone, Pépé et Lulu vous me manquez! A mes grands-parents : parce que vous avez toujours été là pour moi. A mes parents : pour m avoir toujours soutenu, pour votre confiance et votre amour sans faille. A mes deux frangins : les deux êtres les plus chers à mes yeux!!! A la famille Fangeat : de tous vous citer serait trop long mais je passe toujours de bon moment en votre compagnie. A la famille Morel et Venouil : le quartier les Blâches est le fief de cette famille unie dont je suis très heureux de faire partie. A mes amis vétos : A Tony : C est parce qu un grand nombre de choses nous sépare que tant d amitié nous lie. A Nanou : pour ton amitié merveilleuse. A mes ex-colloc : pour cette très belle année passée avec vous. A la clinique de Dampierre sur Salon : Olivier : l excellent Docteur Thiébaud! Merci de votre confiance et de vos enseignements. Pierre : une grande sagesse et un bon vivant. Merci de m avoir si bien accueilli avec «Chattoune»! Mélanie : j adore travailler avec toi ma vieille! Toujours dans la bonne humeur. T es géniale Docteur Raguet! A l équipe de Basket de Crest 7

8 TABLE DES MATIERES : TABLE DES FIGURES TABLE DES TABLEAUX TABLE DES PHOTOS Introduction I. L origine du problème Qu est ce qu une mycotoxine? La prolifération des moisissures a. Conditions environnementales de prolifération des moisissures i. La disponibilité en eau ou activité en eau (Aw) et la température ii. L acidité du milieu iii. La teneur en oxygène du milieu iv. L action des insectes b. L exemple de la fusariose : Les conditions d apparition du risque mycotoxinique a. Le développement de moisissures et la contamination des végétaux par les mycotoxines b. L exemple de la fusariose et de la production de désoxynivalénol (DON) i. Le précédent céréales : ii. Rôle de la variété et de l espèce : iii. Les résidus végétaux : iv. La qualité du sol : Les différentes mycotoxines produites : a. Les mycotoxines d importance internationale i. Aflatoxines ii. Trichothécènes : iii. Zeralenone (ZEA) : iv. Fumonisines (FB) : v. Ochratoxine A (OTA) : vi. La patuline : vi. Les alcaloïdes de l ergot (ou ergolines)

9 b. Mycotoxines d importance régionale i. Les mycotoxines élaborées par Aspergillus fumigatus ii. Les mycotoxines élaborées par Stachybotrys atra iii. Les mycotoxines élaborées par Penicillium roqueforti La contamination des aliments pour ruminants a. Les mycotoxines dans les fourrages i. Dans les foins (aliments secs) ii. Dans les ensilages (aliments humides) b. Les mycotoxines dans les concentrés L importance sanitaire et économique des mycotoxines (sur la santé des animaux de rente et sur les productions agricoles) a. Répartition mondiale et fréquence des atteintes b. Santé et production animales c. Rendement des cultures d. L atteinte des céréales en France II. Devenir et effets toxiques des mycotoxines chez les bovins Métabolisme des mycotoxines chez les Ruminants a. Dans le rumen b. Dans l intestin, le foie et les reins Les effets sur la santé des ruminants a. Effets spécifiques des mycotoxines d importance internationale (tableau 12) i. Aflatoxines : ii. Zéaralénone : iii. Trichothécènes iv. Fumonisine : v. Ochratoxine A : vi. Patuline vii. Les alcaloïdes de l ergot (ergolines) b. Les effets des mycotoxines d importance régionale i. Les mycotoxines produites par Aspergillus fumigatus ii. Les mycotoxines produites par Stachybotrys atra iii. Les mycotoxines produites par Penicillium roqueforti c. Le cas particulier du veau : d. L effet immunodépressif des mycotoxines :

10 i. Etudes in vitro ii. Les problèmes de vaccination e. Les synergies i. Les interactions entre les mycotoxines ii. Les autres facteurs Les voies d élimination a. Urinaires et fécales b. Dans le lait c. Dans les viandes Résumé sur le pouvoir pathogène des mycotoxines chez les bovins et où les détecter III. Les moyens diagnostics et de lutte contre les mycotoxines Moyens diagnostics a. Les problèmes rencontrés pour la détection des mycotoxines dans les stocks d aliment b. Où et quand les doser? i. Le prélèvement «idéal» ii. La directive Européenne 98/53/CE du 16 juillet 1998 [52] iii. Dans les aliments des ruminants iv. Dans les productions animales c. L enjeu d une réponse rapide et fiable i. Le développement des méthodes par kit ii. Kits de détection rapide utilisant la méthode ELISA Les plans de lutte contre les mycotoxines a. Les bonnes pratiques de cultures i. Les rotations ii. Le choix variétal iii. Le traitement des résidus iv. La qualité du sol v. La pulvérisation anti-fongique en dernier ressort vi. Les conditions idéales et les plus exécrables b. Les bonnes pratiques de stockage et de distribution i. Ensilages et aliments humides ii. Aliments secs

11 iii. Gestion des animaux c. Les traitements limitant les effets des mycotoxines : i. Les méthodes chimiques ii. Les méthodes physiques iii. Les ligands d. Les OGM ou le bio comme moyen de lutte? Conclusion :

12 TABLE DES FIGURES : Figure 1 : Influence du ph sur la prolifération de Fusarium proliferatum...22 Figure 2 : Cycle de Fusarium graminearum, un des champignons responsables de la fusariose de l épi...24 Figure 3 : Relation entre activité de l eau et température pour la croissance et la production d aflatoxine...26 Figure 4 : Impact du précédent sur la contamination des cultures par le DON...28 Figure 5 : Impact de la gestion des résidus du maïs sur les fusarioses du blé...29 Figure 6 : Le labour un moyen de traitement des résidus peut-être pas efficace à 100%...30 Figure 7: Les voies de biosynthèse des mycotoxines...32 Figure 8 : Les étapes «à risque» durant la récolte et la conservation des fourrages...45 Figure 9 : Pertes de rendement (exprimées en %) de 10 variétés inoculées artificiellement par Fusarium graminearum...50 Figure 10 : Biotransformations des mycotoxines dans le rumen et évolution de leur toxicité...55 Figure 11 : Pourcentage de disparition de certaines mycotoxines dans différents substrats (enrichis en protozoaires, bactéries ou fluide ruminal traité avec de l OT) par rapport à l activité d un fluide ruminal intact...56 Figure 12 : Métabolisme de l aflatoxine B1 dans le foie...59 Figure 13 : Biotransformation de la ZEA en α-zol (alpha-zéaralénol) par les microsomes hépatiques de différents animaux

13 Figure 14 : Différence de production de lait quotidienne entre des vaches laitières nourries avec des aliments sains et d autres nourries avec des aliments contaminés par 100 ppm de fumonisines 7 jours avant le vêlage et 70 jours après...66 Figure 15 : L effet des mycotoxines sur des cellules mononuclées de bovin de différents âges et différentes races...73 Figure 16 : Représentation des coups de sonde sur le front du silo d ensilage maïs en vu des analyses mycotoxicologiques...83 Figure 17 : Les différentes étapes pour le dosage des différentes mycotoxines en laboratoire...86 Figure 18 : L approche simplifiée avec la HPLC/MS/MS...88 Figure 19 : Structure chimique des molécules de ZEA et de zéranol avec leurs métabolites respectifs...90 Figure 20 : Pays disposant, ou non, d une réglementation concernant les mycotoxines en 2004 au moins pour les aflatoxines B Figure 21 : ELISA type «sandwich»...95 Figure 22 : ELISA type «compétition»...96 Figure 23 : Les bonnes pratiques de culture durant une saison...98 Figure 24 : Stratégie de lutte contre la fusariose de l épi de façon raisonnée Figure 25 : Effet de l ajout de différents additifs dans l alimentation des bovins sur la concentration en aflatoxines dans le lait Figure 26 : Capacité des glucomannanes de Sacchharomyces cervisiae à lier les mycotoxines

14 TABLE DES TABLEAUX : Tableau 1 : Températures caractéristiques de croissance de quelques Aspergillii, Penicillia et Fusarium...21 Tableau 2 : Les concentrations maximales autorisées par la FDA (U.S. Food and drug Administration) pour les aflatoxines totales dans les denrées alimentaires humaines et animales...33 Tableau 3 : Les concentrations maximales autorisées par la Directive /CE du 07 Mai Tableau 4 : Les concentrations maximales recommandées par la Recommandations 2006/576/CE du 17 Aôut Tableau 5 : Les concentrations maximales autorisées par la FDA (U.S. Food and Drug Administration) pour le DON dans le blé et ses produits dérivés...37 Tableau 6 : Principaux champignons et mycotoxines d importance internationale associées (les formules chimiques correspondent aux molécules en caractère gras)...42 Tableau 7 : Principales mycotoxines d importance internationale et conditions d apparition...43 Tableau 8 : Moisissures toxinogènes présentes dans les fourrages conservés...47 Tableau 9 : Répartition naturelle des mycotoxines de Fusarium en France en 1996 et Tableau 10 : La contamination des céréales françaises entre 1999 et Tableau 11 : Le devenir des différentes mycotoxines dans le rumen des bovins...54 Tableau 12 : répercussion possibles des différentes mycotoxines chez les ruminants

15 Tableau 13 : Formes aiguës de mycotoxicoses chez le veau et d'autres animaux domestiques...72 Tableau 14 : Aberrations chromosomiques après exposition de cellules lymphocytes bovines à 2 mycotoxines (ZEA et OTA) durant 72h...74 Tableau 15 : Résidus de mycotoxines dans le lait de vache recevant des aliments contaminés ou des doses orales de toxines fongiques. Les doses sont exprimées en mg/kg de masse corporelle, en concentration (ppm) dans le régime alimentaire, en mg ou g pour les doses orales journalières...79 Tableau 16 : Nombre d échantillons élémentaires à prélever en fonction du poids du lot de céréales...85 Tableau 17 : Comparaison des techniques analytiques...87 Tableau 18 : Résidus possibles chez le porc...91 Tableau 19 : Gamme RIDASCREEN de R-Biopharm pour le dosage des mycotoxines (renseignements obtenus auprès du laboratoire directement)...94 Tableau 20 : Avantages et inconvénients des kits ELISA pour la détection rapide des mycotoxines...97 Tableau 21 : Les facteurs de risque de contamination des céréales par les mycotoxines fusariques Tableau 22 : Les ligands inorganiques pour la lutte contre les mycotoxines) Tableau 23 : action du Q/FIS sur l absorption intestinal des mycotoxines chez le porc

16 TABLE DES PHOTOS : Photo 1 : Epi de maïs atteint de la fusariose de l épi...24 Photo 2 : Pomme atteinte de Penicillium expansum...40 Photo 3 et 4 : Différence entre des grains de triticale sains et des grains contaminés par Claviceps purpurea...41 Photo 5 : Sclérotes de Claviceps purpurea : différence entre aspect intérieur et extérieur

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18 Introduction : Les événements récents qui ont touché à la sécurité alimentaire, comme la crise de la vache folle, les problèmes de nitrate, de pesticides, de dioxines dans les aliments ou encore les problèmes de listériose ou de salmonellose ont contribué à sensibiliser le consommateur ainsi que l ensemble de la filière agroalimentaire aux risques potentiels de certains contaminants microscopiques. Parmi ces contaminants, il en existe certains moins connus du public. C est le cas des mycotoxines, un contaminant produit naturellement dans les aliments par des moisissures et ayant des effets pathogènes tant chez l homme que chez l animal [110]. On a longtemps confiné les mycotoxines aux pathologies provoquées par l ergot de seigle, mais depuis les années 1960 et la découverte de l aflatoxine par des chercheurs britanniques, la question des mycotoxines a pris une importance considérable. Dès lors, de nombreuses mycotoxines ont été découvertes : les dernières en 1988 avec le groupe des fumonisines [179]. De part leurs effets néfastes pour la santé des hommes et des animaux, la lutte contre les mycotoxines est devenue une des préoccupations première en agroalimentaire que ce soit au niveau européen ou mondial. Des plans de sécurité alimentaire ont été mis en place pour gérer et évaluer le risque représenté par les toxines fongiques [157]. Cette étude a pour but de présenter l état des connaissances sur le risque lié aux mycotoxines plus particulièrement pour la filière bovine. Comment les bovins se contaminent? Quels sont les symptômes de ces intoxinations? Les bovins peuvent-ils représenter un risque de concentration des toxines et a fortiori un danger pour l homme? Comment peut-t-on lutter efficacement contre ces contaminations? 18

19 I. L origine du problème 1. Qu est ce qu une mycotoxine? Les mycotoxines sont des métabolites toxiques élaborées par des champignons (micromycètes ou moisissures). Il existe des centaines de mycotoxines différentes qui diffèrent de par leur composition chimique et leurs effets sur les animaux et l homme. Elles sont produites lors de quatre processus différents [179] : Le métabolisme secondaire fongique La bioconversion de composés végétaux (ex : dicoumarol) La réaction de la plante à des agressions (ex : coumestrol) L association plante-champignons (cas des champignons endophytes) Les mycotoxines responsables de toxicité avérée chez l homme et l animal sont principalement issues du métabolisme secondaire [175]. L étude se limitera à celles-ci et à celles que l on retrouve dans les aliments conservés, les mycotoxicoses liées à la consommation d herbe au pâturage ne seront pas traités. 2. La prolifération des moisissures Les mycotoxines sont élaborées lors de la prolifération de moisissures qui sont des champignons qui se développent en colonies multicellulaires par opposition aux levures unicellulaires. Les moisissures se développent sur les végétaux que ce soit dans les champs ou après les récoltes lors du transport, du stockage et même de la distribution des aliments. Une caractéristique majeure des champignons est leur mode de reproduction ; ils produisent un grand nombre de spores, ce qui leur assure un pouvoir de contamination considérable. Les spores sont issues de plusieurs modalités de reproduction sexuée ou asexuée, elles représentent le principal critère de leur classification [157]. Plusieurs espèces de champignons produisent des mycotoxines dans les aliments cependant il est établi que les champignons du genre Aspergillus, Fusarium et Penicillium 19

20 sont les principaux acteurs dans l élaboration des mycotoxines nuisibles pour les animaux d élevage et pour l homme [68]. Les moisissures du genre Claviceps ou Stachybotrys sont elles aussi susceptibles de poser des problèmes dans les élevages [64, 21, 23]. a. Conditions environnementales de prolifération des moisissures Les fourrages et les céréales sont naturellement en contact avec des spores fongiques qui se trouvent à l état latent dans l environnement et notamment dans les sols : c est une contamination tellurique naturelle [13, 21]. Plusieurs facteurs conditionnent le développement des moisissures : i. La disponibilité en eau ou activité en eau (Aw) et la température L a w est un paramètre qui permet de quantifier la quantité d eau disponible et qui dépend à la fois des caractéristiques chimiques et physiques du substrat. Elle varie entre 0 (toute l eau est retenue) et 1 (eau pure) [157]. Les différentes moisissures ont des conditions optimales de développement qui leur sont propre aussi bien pour les températures (tableau 1) que pour l a w. C est le cas des champignons du genre Aspergillus qui se développent normalement dans des milieux où l a w est faible et les températures importantes. De ce fait, on retrouve des infestations par Aspergillus flavus plus fréquemment dans les maïs cultivé dans des conditions de sécheresse et de chaleur. De même, les espèces du genre Penicillium, une moisissure très répandue prolifèrent dans des conditions optimales spécifiques représentées par une a w relativement faible et des températures basses. Ces deux premiers genres se développent donc dans des conditions de faible a w (voisines de 0,7 à 25 ), en conséquent ils sont considérés comme des champignons d entreposage. Au contraire, les champignons du genre Fusarium sont généralement considérés comme des moisissures des champs puisque leurs conditions optimales de développement sont représentées par une humidité importante (a w supérieur à 0,9) durant la période de floraison des cultures. Toutefois, ces principes ne sont pas fixes et c est pour cela que l on retrouve, par exemple, des champignons du genre Fusarium qui 20

21 prolifèrent et produisent des mycotoxines dans certaines conditions que l on retrouve durant le stockage [31, 69, 133] Comme pour les moisissures du genre Fusarium, Claviceps (ou ergot) contamine les plantes au champ. Un temps frais et humide favorise son développement en permettant la germination des sclérotes (organe de conservation de taille et de forme variables) et la production de spores, et en prolongeant la période pendant laquelle les fleurons (petites fleurs élémentaires) restent ouverts sur les plantes [27, 115, 53, 160]. Espèces fongiques Tmin ( C) Topt ( C) Tmax ( C) Aspergillus flavus Aspergillus clavatus Penicillium aurantiogriseum Penicillium purpurogenum Fusarium tricinctum Tableau 1 : Températures caractéristiques de croissance de quelques Aspergillii, Penicillia et Fusarium [117] ii. L acidité du milieu Les moisissures se développent normalement pour de larges gammes de ph compris entre 3 et 8. Comme pour les autres paramètres, il existe des ph pour lesquels la croissance fongique est optimale. Généralement ces ph sont entre 5 et 6 [157]. C est le cas pour la moisissure Fusarium proliferatum dont la croissance optimale est à ph=5,6 [81](figure 1). 21

22 Influence du ph sur la prolifération de Fusarium prolifertum Biomasse en g/l ,2 2,6 3 3,7 4,2 5,6 ph Figure 1 : Influence du ph sur la prolifération de Fusarium proliferatum (Inspiré de [81]) iii. La teneur en oxygène du milieu Les moisissures sont des organismes aérobies qui ont donc besoins d oxygène pour effectuer une croissance normale [99, 157]. Cependant, elles peuvent pour la plupart se développer même si la teneur en oxygène est dix fois plus faible que celle de l atmosphère. Par exemple, Aspergillus flavus peut se développer dans une atmosphère contenant de faible concentration de O 2 (0,5%) ou une forte concentration en N 2 (99%) mais 80% de CO 2 inhibe sa croissance. Il en est de même pour A. ochraceus [120]. Penicillum verucosum est quant à elle moins sensible aux variations de CO 2 [28]. Enfin, l exemple de Fusarium proliferatum montre que pour cette espèce c est la présence d oxygène qui limite son développement [81]. iv. L action des insectes Les plantes sont naturellement protégées contre les contaminations fongiques par leur cuticule et les enveloppes des graines. Cependant, les dommages physiques causés par les insectes, les rongeurs ou les oiseaux aux plantes et aux graines facilitent la pénétration des spores et de ce fait le développement des moisissures [120, 99, 80]. De plus, les insectes servent eux-mêmes de vecteurs pour certaines spores fongiques. C est le cas de la larve de la 22

23 pyrale du maïs en Europe qui est un vecteur de spores de Fursarium [109] ou encore les charançons dont les larves se développent dans l environnement des grains et qui transportent elles aussi des spores de champignons [120]. Sur le corps et dans l intestin de certains coléoptères (mites), il a été retrouvé des spores de différentes moisissures comme Aspergillus flavus, Penicillium brevicompactum, P. chrysogenum, P. cyclopium, P. griseofulvum, Botrytis cinerea, Cladosporium herbarum et Alternaria alternata [75]. Ceci pour montrer que les insectes sont loin de jouer un rôle mineur dans la contamination des aliments aux champs ou dans les zones de stockage. Il est bien évident qu à cause des aléas naturels (climat, hygrométrie, intervention des insectes ) l agriculteur ne peut maîtriser toutes les causes de prolifération des moisissures sur les récoltes et les aliments entreposés. Cependant on perçoit l importance des bonnes pratiques agricoles pour la prévention des risques de contamination des aliments comme le tassage des ensilages qui permet notamment la création de conditions anaérobie au sein du silo. b. L exemple de la fusariose : La fusariose de l épi est une maladie fongique affectant les céréales et due à des champignons du genre Fusarium. Parmi ces moisissures les 4 principales espèces en cause en Europe sont : F. graminearum, F. culmorum, F. poae et F. avenaceum. Comme pour les autres moisissures, la croissance de Fusarium dépend de certaines conditions et notamment des conditions météorologiques de température (> à 15 C) et d humidité (teneur en humidité dans le substrat entre 22 et 25 %) durant la floraison. Lorsque toutes les conditions sont réunies, l infestation est massive et il y a production de grains fusariés qui peuvent engendrer des pertes allant de 30 à 70 % sur la production totale [35](figure 2). 23

24 PLUIES Figure 2 : Cycle de Fusarium graminearum, un des champignons responsables de la fusariose de l épi ( inspiré de [35]) Photo 1 : Epi de maïs atteint de la fusariose de l épi [98] 24

25 3. Les conditions d apparition du risque mycotoxinique a. Le développement de moisissures et la contamination des végétaux par les mycotoxines Lorsque les conditions environnementales le permettent les moisissures produisent, par l intermédiaire d un métabolisme secondaire, des mycotoxines au sein des végétaux. Le métabolisme secondaire diffère du primaire par la nature aléatoire de son activation et par la grande diversité des composés formés et la spécificité des souches impliquées. La production de mycotoxines répond donc à des signaux issus de l environnement qui correspondent ou non à ceux favorables à la croissance de la moisissures en cause [179]. En effet, il est important de souligner que les conditions les plus favorables à la prolifération des moisissures pourraient ne pas coïncider avec les conditions optimales pour la formation des mycotoxines en laboratoires. Par exemple, on a observé que des moisissures de genre Fusarium prolifèrent a des températures comprises entre 25 et 30 C sans produire beaucoup de mycotoxines, alors qu à des températures proches de 0 C une grande quantité de mycotoxines est produite par une population minime de moisissures [79]. Dans une moindre mesure ces résultats sont corroborés par d autres études. Par exemple, la courbe de croissance du champignon du genre Aspergillus dépendant de l activité hydrique et de la température ne coïncide pas avec la courbe de production de l aflatoxine qui est un de ses métabolites secondaires. Ainsi, alors que les conditions optimales de croissance pour la moisissure est de 36 C et un a w de 0,95, celle de la production d aflatoxine est de 33 C et un a w de 0,99 [118] (figure 3). 25

26 Figure 3 : Relation entre activité de l eau et température pour la croissance et la production d aflatoxine [72] Ceci montre que ce n est pas parce que les moisissures sont dans des proportions minimes voire invisibles que l aliment n est pas contaminé par des mycotoxines à des seuils importants et inversement, un aliment moisi peut ne pas être contaminé par des mycotoxines [99, 175]. D autres études montrent que le DON (désoxynivalénol) se retrouve dans les échantillons prélevés qu ils soient ou non contaminés par des champignons. Le même constat est observé pour d autres mycotoxines analysées comme la ZEA (zéralénone) ou la toxine T- 2 [100]. Ces résultats sont à confronter avec le moment de production des mycotoxines. En effet, ces 3 types de mycotoxines sont produits essentiellement par des champignons du genre Fursarium, une moisissure qui se développe au champ. 26

27 Certains auteurs visent à donner une signification évolutive aux mycotoxines en disant : «pour tout organisme, la production d une molécule (ici, les toxines) a un coût métabolique qui doit être compensé par un avantage lié à la sécrétion de ces toxines». L avantage apporté par les mycotoxines serait d ordre compétitif. En effet, en situation de stress la compétition entre les différents organismes est exacerbée et la production de toxines par les moisissures permettrait de préempter le grain qu il envahit en le rendant toxique pour les autres organismes compétiteurs du milieu [33, 101]. b. L exemple de la fusariose et de la production de désoxynivalénol (DON) La corrélation entre les moisissures et la production de mycotoxines n est pas évidente. C est ce qu illustre les études menées par l HGCA (Home Grown Cereal Authority) qui n a montré aucune corrélation entre l existence de grains fusariés et la présence de la mycotoxine DON puisque sur 65 échantillons de lots de grains fusariés aucun lot n a montré cette corrélation sauf un [159]. D autres études ont visé à trouver les causes de contaminations par les mycotoxines. Parmi les principales causes avancées, en ce qui concerne la contamination par la toxine fongique DON, on trouve : i. Le précédent céréales : Le précédent céréales (dernier type de céréale produit dans le même champ) semble avoir un impact majeur dans la contamination des cultures par les toxines fongiques et notamment la DON. Par exemple quels que soient le climat ou les techniques de semis mises en œuvre, les grains de maïs sont plus fortement contaminés par la DON lorsque les cultures précédentes étaient du maïs grain ou ensilage [60](figure 4). C est pour cette raison que les taux de contamination par les toxines DON sont plus importants lors de monocultures maïs. Ce phénomène résulte de la résistance des moisissures du genre Fusarium et notamment de Fusarium graminearum qui peuvent survivre dans les chaumes laissés sur le sol après récolte, lesquelles se décomposent très lentement par rapport à d autres céréales. Ce 27

28 transfert de contamination est d autant plus importante qu il s agit de maïs grains par rapport à l ensilage qui laisse des quantités de résidus moindres [34, 147]. Figure 4 : Impact du précédent sur la contamination des cultures par le DON [159] ii. Rôle de la variété et de l espèce : Le choix variétal a une importance non négligeable. En fait, il est question non pas de variétés susceptibles ou non aux fusarioses (même si ce caractère n est pas à négliger) mais à l aptitude de ces plantes à favoriser la production de mycotoxines par les moisissures Fusarium. En mettant en situation de contamination artificielle différentes variétés de blé, celles-ci ne produisent pas le même taux de DON. En effet, la variété Apache, dans les mêmes conditions, produit deux fois moins de DON que la variété Trémie [159]. Les raisons de ces différences semblent être diverses et pas encore établies. La hauteur des pailles qui éloigne les épis des foyers infectieux (triticale, seigle) ou encore, dans le cas de l orge, une floraison décalée par rapport à la période à risque sont des raisons mécaniques et temporelles qui 28

29 limitent la contamination. Par ailleurs, l INRA grâce à des travaux sur le blé dur, moins sujet aux contaminations par les toxines fongiques que d autres espèces de céréales, avance une hypothèse génétique à l origine de cette résistance. En effet, il semblerait que ce végétal produise naturellement des inhibiteurs de la synthèse de DON qui serait des composés phénoliques, des peptides et des ions métalliques. iii. Les résidus végétaux : Les résidus végétaux, en tant que support de l inoculum, joueraient un rôle dans le transfert de contamination notamment entre le maïs et les autres céréales qui suivent [93]. Il convient de noter l importance de la technique de traitement des résidus maïs puisque l on note un taux de contamination moindre des cultures si le champ a été préalablement labouré (figure 5). Au contraire, lorsque seulement un travail superficiel est effectué après la récolte, les cultures suivantes sont plus susceptibles de produire des mycotoxines [159]. Figure 5 : Impact de la gestion des résidus du maïs sur les fusarioses du blé [159] 29

30 Cependant, l enfouissement des résidus ne semble pas suffire à l assainissement des parcelles puisque dans le cas d une succession maïs/blé/orge, c est l orge qui est contaminée par la remontée des cannes de maïs après labour (figure 6) [159]. Ceci tend à montrer que la vitesse de décomposition des résidus est aussi un facteur important de transfert de contamination et de ce fait que le labour, en ralentissant la décomposition des végétaux et notamment des nœuds dans lesquels les spores se concentrent, ne serait pas forcément le moyen idéal de lutte contre la production de mycotoxines. Figure 6 : Le labour un moyen de traitement des résidus peut-être pas efficace à 100% 30

31 iv. La qualité du sol : La qualité du sol est au même titre que les conditions climatiques un facteur de stress pour les moisissures et donc un agent favorisant la mise en place du métabolisme secondaire responsable de la production de toxines fongiques. Des plantes sur sols riches seraient donc plus résistantes et de ce fait seraient moins sujettes à la production de mycotoxines. Certains agronomes mettent en avant le rapport N/K où le manque de potassium comme l excès d azote rendent les végétaux plus sujets aux maladies et donc susceptibles de produire des mycotoxines. De ce fait, les sols préservés comme dans l agriculture de conservation en apportant un substrat riche et équilibré aux plantes favorise la croissance de cultures saines, non stressées. De plus, ces sols organiquement très riches permettent aussi une dégradation des résidus plus rapide évitant de ce fait la recontamination des cultures à venir. Ces sols contiennent aussi des bactéries (exemple Pseudomonas) connues depuis longtemps pour leur protection contre les ravageurs et leur activité neutralisante vis-à-vis de la fusariose. Cette activité anti-fusariose est due à l efficacité de leur métabolisme à mobiliser le fer qui est un élément indispensable au développement de la moisissure Fusarium [159]. Cet exemple sur la fusariose et la mycotoxine DON illustre bien la complexité des phénomènes qui régissent la contamination par les toxines fongiques des productions agricoles et a fortiori les aliments destinés aux animaux de rente. Il convient à présent, de présenter les principales mycotoxines qui sont mises en cause dans les problèmes de santé animale et humaine. 4. Les différentes mycotoxines produites : Les mycotoxines ont trois origines biosynthétiques principales : la voie des polyacétates, celle des terpènes et celle des acides aminés (figure 7). Chaque espèce de moisissures produisent différentes sortes de toxines et dans différentes conditions environnementales (tableau 6 et 7). 31

32 Figure 7: Les voies de biosynthèse des mycotoxines (tiré de [157]) Il convient de faire une dichotomie entre les mycotoxines qui ont une importance internationale et qui font l objet de plan de vigilance sur le marché des denrées alimentaires (principalement les céréales dans cette étude) animales ou humaines [105], et les mycotoxines d importance régionale qui sont principalement retrouvées dans les fourrages conservés, produits sans grande valeur marchande, produits et consommés in situ. De ce fait, et à l inverse des céréales, la contamination des foins et des ensilages par les moisissures et a fortiori par les mycotoxines a été peu étudiée et peu publiée malgré le fait qu elles ont des effets néfastes sur la santé des bovins [21]. C est pour cette raison que ces mycotoxines ne seront pas traitées dans toutes les parties de la thèse notamment en ce qui concerne la réglementation ou les bioconversions dans les organes des bovins. a. Les mycotoxines d importance internationale i. Aflatoxines Les aflatoxines sont des mycotoxines produites par Aspergillus flavus, A. parasiticus et A. nomius. Les champignons Aspergillus flavus produisent les aflatoxines B1 et B2, alors que A. parasiticus produisent les aflatoxines B1, B2, G1 et G2 [40]. Ce sont des composés 32

33 extrêmement toxiques, mutagènes et cancérogènes. Les conditions les plus favorables à leur élaboration sont une activité en eau faible (0,84-0,86) et des températures élevées comprises entre 25 et 30 C [120]. A l échelle mondiale la contamination du maïs, des arachides, des noix, des graines de coton et autres cultures constitue un problème constant notamment dans le domaine commercial. En effet, même si elles sont principalement retrouvées dans les produits des pays chauds et humides, on les retrouve dans les denrées importées. Ce sont des mycotoxines produites après la récolte puisque issues de moisissures qui se développent lors du stockage ou du transport [179]. De part, sa toxicité importante et les innombrables productions qu elles affectent les aflatoxines font l objet d une vigilance particulière durant les échanges internationaux. Des concentrations maximales autorisées au dessus desquelles l aliment est impropre à la consommation par les animaux ont été établies que ce soit aux Etats-Unis (tableau 2) ou en Europe (tableau 3). C est la seule mycotoxine qui a fait l objet d une directive Européenne portant sur les aliments pour animaux. Certaines autres mycotoxines ont seulement fait l objet de recommandations Européennes depuis 2006 (tableau 4). Denrées alimentaires humaines et animales Concentration (ppb) Tous les produits de consommation humaine excepté le lait 20 Maïs pour les jeunes animaux et les vaches laitières 20 Maïs et arachides pour nourrir les bœufs de boucherie, les porcs et les volailles 100 Maïs et arachides pour la fin engraissement des porcs (>100lb) 200 Maïs et arachides pour la fin engraissement des bœufs de boucherie 300 Tourteau de graines de coton (comme ingrédient) 300 Toutes les autres denrées alimentaires 20 Lait (aflatoxin M1) 0,5 Tableau 2 : Les concentrations maximales autorisées par la FDA (U.S. Food and drug Administration) pour les aflatoxines totales dans les denrées alimentaires humaines et animales [178] 33

34 Produits Aliments pour animaux Matière première pour aliments des animaux, à l'exception de : arachide, coprah, palmiste, graines de coton, babassu, maïs et dérivés de leur transformation Teneur maximale ppm d'aliment pour animaux d'une teneur en humidité de 12% 0,05 0,02 Aflatoxines B1 Aliments complets pour bovins, ovins et caprins, à l'exception de : 0,05 bétail laitier 0,005 veaux, agneaux, chevreaux 0,01 Aliments complets pour porcs et volailles (à l'exception des jeunes animaux) 0,02 Autres aliments complets 0,01 Aliments complementaires pourbovins, ovins et caprns (à l'exception des aliments complémentaires pour bétail laitier, 0,05 veaux, agneaux et chevreaux) Aliments complémentaires pour porcs et volailles (à l'exception des jeunes animaux) 0,03 Autres aliments complementaires 0,005 Tableau 3 : Les concentrations maximales autorisées par la Directive /CE du 07 Mai 02 34

35 Tableau 4 : Les concentrations maximales recommandées par la Recommandations 2006/576/CE du 17 Aôut 2006 Les aflatoxines ne sont cependant pas uniquement produites lors du stockage. En effet, le maïs est un cas particulier. Avant les années 1970, on pensait que les aflatoxines étaient élaborées dans les maïs après la récolte au moment de l entreposage comme pour toutes les autres productions. Cependant, après avoir isolé des aflatoxines dans le maïs avant récolte, il est apparu que le problème des aflatoxines prenait son origine avant la récolte. En effet, il a été montré que ce sont les soies du maïs qui le rendent vulnérable à l infection par A. flavus. A la faveur de conditions de stress (sécheresse par exemple) au moment de la pollinisation, le maïs peut être contaminé par Aspergillus [104]. En fait, durant la période de pollinisation du maïs les champignons A. flavus produisent de grande quantité de spores qui servent d inoculum. Les aflatoxines qui sont normalement retrouvées dans les productions provenant de zones chaudes et humides peuvent très bien apparaître dans des zones plus tempérées à la faveur d une sécheresse. Par exemple, aux Etats-Unis dans le Midwest durant l année 1988 où la toxine fongique a été retrouvée dans 5% des échantillons de maïs-grain après une année marquée par la sécheresse [138]. Le rôle des insectes ne semble pas devoir être négligé. En effet, ces derniers favorisant aussi l inoculation par les spores en causant des dommages aux végétaux. 35

36 ii. Trichothécènes : Les trichothécènes sont des mycotoxines produites par plusieurs espèces de Fusarium et de genres apparentés. Les trichothécènes forment une famille comprenant 200 à 300 composés exerçant leur effet toxique par inhibition de la synthèse des protéines au niveau des ribosomes. Au sein de cette famille de mycotoxine, les plus couramment détectés dans les produits agricoles sont le déoxynivalénol (DON encore appelé vomitoxine), la toxine T-2, le nivalénol (NIV) et le diacétoxyscirpénol (DAS). Ces mycotoxines sont divisées en quatres groupes A, B, C et D dépendamment de leur structure chimique. Les groupes A et B sont les groupes les plus importants puisque le groupe A regroupe le DAS et la toxine T-2 qui n ont pas de fonction cétone en C8 et le groupe B regroupe le nivalénol (NIV) et le DON qui eux ont une fonction cétone en C8. La contamination par ces mycotoxines survient avant la récolte, puisque les moisissures du genre Fusarium parasitent les plantes aux champs et sont très répandue dans les régions tempérées et humides [69, 140, 157]. Déoxynivalénol ou Vomitoxine : Cette mycotoxine est l une des plus communément détectée dans les aliments [69]. Elle est aussi appelée vomitoxine car au départ, elle était associée à des vomissements chez le porc. De part sa fréquence de détections dans les différents aliments et partout à la surface du globe, le DON est utilisé comme marqueur pour établir si les récoltes ont été exposées ou non à des situations favorisant l élaboration de mycotoxines par des moisissures du genre Fusarium : F. graminerarum, F.cerealis, F. culmorum [24, 157, 175]. La FDA (Food and Drug Administration) propose des directives relatives au DON (tableau 5). 36

37 Produits Tous les produits finis à base de blé destinés à la consommation humaine (farine, son, germes ) Grains de blé ou produits à base de grains de blé destinés aux bœufs de boucherie, aux vaches et aux bovins allottés de plus de 4 mois et aux poulets (cet aliment ne devant pas excéder plus de 50% du régime alimentaire) Grains de blé ou produits à base de grains de blé destinés aux porcs (cet aliment ne devant pas excéder plus de 20% du régime alimentaire) Grains de blé ou produits à base de grains de blé pour les autres animaux (cet aliment ne devant pas excéder plus de 40% du régime alimentaire) Concentration maximale autorisée par la FDA (ppm) Tableau 5 : Les concentrations maximales autorisées par la FDA (U.S. Food and Drug Administration) pour le DON dans le blé et ses produits dérivés [163] Nivalénol (NIV) : Malgré une structure chimique proche de la DON, elle n est généralement pas produite par Fusarium graminearum mais pas F. nivale. Elle est moins courante que la DON mais montre une activité toxique plus importante qui peut-être à l origine de pathologies animales ou humaines [170, 11]. Cette toxine fongique qui est très représentée en Asie et notamment en Corée et au Japon, l est beaucoup moins dans le reste du monde et notamment en Europe [11, 42]. Toxine T2 (T-2) : Même si elle est produite par un certain nombre de moisissures c est principalement par Fusarium sporotrichioides et F. poae qu elle est élaborée. Cette toxine fongique très puissante n est retrouvée que dans un nombre restreint de prélèvements (<10% aux Etats-Unis principalement 37

38 dans l orge, le blé, le millet, les graines de carthame et les rations mélangées [69]). Cependant après la sécheresse de 1988 dans le Midwest les champs endommagés présentaient une contamination de 13% des grains de maïs par la toxine T2 [138]. Diacétoxyscirpénol (DAS) : Egalement connu sous le nom d anguidine, il est produit principalement par Fusarium graminearum et F. roseum [78]. Cette toxine fongique est moins recherchée que la toxine T-2, autre trichothécène du groupe B mais elle est retrouvée partout dans le monde avec des niveaux de contaminations extrêmement variables [11]. iii. Zeralenone (ZEA) : C est une mycotoxine produite par des moisissures du genre Fusarium dont la structure chimique présente des analogies avec celle de l œstrogène [69]. D un point de vue chimique, la ZEA est une lactone de l acide résorcyclique sans toxicité intrinsèque [175] mais de part sa similitude avec l œstrogène, la ZEA est responsable de troubles de la reproduction et notamment du syndrome oestrogénique chez le porc. La principale moisissure responsable de la production de cette mycotoxine est Fusarium graminearum même si d autres champignons sont capables de la produire. Sa répartition est mondiale, elle est présente dans l ensilage, le foin, le maïs ou d autres céréales. La production de ZEA dans le maïs semble exacerbée par certaines conditions qui maintiennent un taux d humidité oscillant entre 22 et 25% et des températures comprises entre 1O à et 15 C [1, 157, 175]. iv. Fumonisines (FB) : La fumonisine B1 a été isolée pour la première fois en 1988, et il est montré qu elle est une cause de la leucoencéphalomalacie équine, de l œdème pulmonaire du porc et d hépatotoxicité chez le rat. C est une toxine fongique élaborée par des espèces de Fusarium 38

39 qui sont principalement F. verticilloides (anciennement F. moniliforme) et F. proliferatum. Ces moisissures extrêmement répandues dans le maïs produisent de grandes quantités de diverses fumonisines B1, B2 et B3. Les fumonisines ont une structure semblable à celle de la sphingosine, un des composants des sphingolipides qui eux même sont des éléments structuraux de la myéline et de certains tissus nerveux. La toxicité des fumonisines résulte du blocage de la biosynthèse des sphingolipides [47]. Les épis de maïs peuvent contenir de fortes teneurs en fumonisines sans aucune altération. On les retrouve dans de nombreux pays et même si par comparaison le maïs produit en Europe présente des niveaux de contamination plus faible que dans d autres pays, on en trouve dans des proportions inquiétantes notamment en Italie dans les produits de panification [38, 6]. v. Ochratoxine A (OTA) : Cette mycotoxine est produite par différentes espèces de Penicillium (P. verrucosum, P. viridicatum ) et d Aspergillus (A. ochraceus ). Elle fait partie de la famille des ochratoxines qui compte une dizaine de molécules connues. Les champignons A. ochraceus produit l OTA à une température optimale de 28 C alors que P. viridicatum par exemple, produit la mycotoxine entre 4 et 30 C. De ce fait, l OTA est une toxine fongique que l on retrouve dans les céréales des régions chaudes ou tempérées [124, 166]. vi. La patuline : La patuline est élaborée par des moisissures du genre Pénicillium, Aspergillus et Byssochlamys [118]. Encore connue sous le nom de clavacine, claviformine, expansine, mycoïne, cette substance, douée de propriétés antibactériennes, fut, dès sa découverte en 1942, l objet de recherches intensives en vue de son utilisation à des fins thérapeutiques. Cependant, en raison de sa toxicité élevée, son emploi en tant qu antibiotique dut être rapidement abandonné [30]. Elle peut contaminer les ensilages destinés à l alimentation bovine. Elle a été incriminée comme toxine possible en Europe et en Nouvelle-Zélande [89] et représente surtout un danger pour l homme puisqu on la retrouve notamment dans les pommes (photo 2) ou jus de pommes. Les conditions optimales de production de la patuline par P. expansum sont un ph de 6 et une température de 17 C dans les poires mais cette mycotoxine peut néanmoins se former à des températures comprises entre 0 et 25 C [118]. 39

40 Photo 2 : Pomme atteinte de Penicillium expansum [137] vi. Les alcaloïdes de l ergot (ou ergolines) L ergot contamine différentes herbes et céréales comme le blé, le triticale, l orge, le riz, l avoine, le seigle et autres graminées herbacées (photos 3 et 4) [27, 180, 97, 73, 142, 139, 114]. Il existe différentes espèces de Claviceps (ou ergot) mais la plus fréquente et la plus nocive est Claviceps purpuera [83]. Cette moisissure contient différents alcaloïdes dérivés de l acide lysergique [27, 114, 177]. Ces alcaloïdes (ou ergolines) induisent une contraction des fibres musculaires lisses notamment au niveau des petits vaisseaux sanguins. Cette propriété leur confère un pouvoir vasoconstricteur pouvant être utilisé en médecine humaine (ou vétérinaire (Serotonine ) à des fins thérapeutiques ou pouvant engendrer des intoxications chez diverses espèces animales ou chez l homme à la suite de l ingestion de denrées contaminées : l ergostisme [160, 114, 177]. Il existe une multitude d alcaloïdes de l ergot dont la plus étudiée est l ergotamine. Cependant, des données pharmacologiques et toxicologiques concernant les ergolines font défauts. En effet, les voies de métabolisation ou d élimination de ces toxines chez les bovins sont mal connues [76]. 40

41 Photo 3 et 4 : Différence entre des grains de triticale sains et des grains contaminés par Claviceps purpurea [23] Les mycotoxines de Claviceps (alcaloïdes de l ergot dit de seigle) sont réglementées indirectement par des limites sur la proportion pondérale d ergot dans un aliment. La directive 2002/32 et l arrêté du 12 janvier 2001 limitent cette présence à 1 g d ergot par kg d aliment pour animaux contenant des «céréales non moulues». Il est possible que dans l avenir, tous les textes relatifs à l ergot évoluent pour se baser non plus sur le poids d ergots contenu dans un kilogramme d un lot de céréales, mais sur la teneur en certains alcaloïdes de ce lot. 41

42 Tableau 6 : Principaux champignons et mycotoxines d importance internationale associées (les formules chimiques correspondent aux molécules en caractère gras) [76, 179]. 42

43 Groupe de mycotoxines Mycotoxines Conditions d apparition Aflatoxines Aflatoxines B1, B2, G1 et G2 Climats tropicaux et subtropicaux Ochratoxines Ochratoxines A, B, C et D Climats frais et tempérés En cours de stockage Zéaralénone Zéaralénone Moisissures ubiquistes Trichothécènes Vomitoxine, Nivalenol, Fusarenone X (Trichothécènes B) T2 toxine, HT2 toxine, Diacetoxyscirpenol (Tricho. A) Moisissures ubiquistes Fumonisines Fumonisines Climats tempérés et climats chauds Tableau 7 : Principales mycotoxines d importance internationale et conditions d apparition [2, 24] b. Mycotoxines d importance régionale i. Les mycotoxines élaborées par Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus est une des espèces majeures retrouvées dans les foins conservés. Cette moisissure, souvent associée à l échauffement des balles rondes de foin, est la principale responsable de cas d aspergillose pulmonaire, d avortements et de mammites. Elle est moins connue pour sa capacité à élaborer des toxines. Pourtant, en culture pure, l Aspergillus fumigatus peut produire plusieurs mycotoxines : gliotoxine, des toxines trémorgènes (fumitrmorgène A, B et C, veruculogène et la TR-2) et alcaloïdiques (fumiglavine A et B) [21, 22, 20]. 43

44 ii. Les mycotoxines élaborées par Stachybotrys atra Stachybotrys atra est un champignon cellulolytique se développant sur de la paille voire des foins réhumidifiés au cours du stockage [94, 26]. Cette moisissure peut produire différentes mycotoxines qui sont des trichothécènes macrocycliques (di- ou triesters des autres trichothécènes) : la satratoxine, la verrucarine et la roridine [152]. Ces mycotoxines dont le pouvoir toxique est plus important que la toxine T-2 sont à l origine de la stachybotryotoxicose affectant principalement les chevaux [118]. Cette moisissure est particulièrement résistante aux conditions de confinement, c est pourquoi on peut la retrouver dans la partie centrale des balles de paille [94]. iii. Les mycotoxines élaborées par Penicillium roqueforti Pénicillium roqueforti est une moisissure bleue présentant une tolérance au milieu acide et à l anaérobiose. Ces caractéristiques font que l on retrouve cette espèce dans les ensilages dont elle est une des principales colonisatrices. En condition de laboratoire, ce champignon produit plusieurs mycotoxines : la PR toxine, la roquefortine A, B et C et l acide mycophénolique. A l état naturel, l acide mycophénolique a été trouvé dans 32% des ensilages examinés à des doses comprises entre 20 et µg/kg [141] et la roquefortine a été trouvée dans des ensilages de maïs et d herbe à des taux moyens de 6 et 17 µg/kg [143]. Une autre étude menée aux Pays-Bas montrent que l acide mycophénolique et la roquefortine C sont retrouvées dans 50% des échantillons d ensilages de maïs analysés et principalement dans les prélèvements en surface du silo [51]. 44