Ecole Supérieure de la Santé Techniciens en Analyses Biomédicales ES

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1 Ecole Supérieure de la Santé Techniciens en Analyses Biomédicales ES Séverine Gillioz 47 ème volée Stage d hématologie Laboratoire ICHV, Martigny Responsable : Philippe Godon

2 Sommaire Ce mémoire traite de la transmission à l hématologue des lymphocytoses en valeur absolue découvertes au laboratoire. Une statistique a été effectuée afin de connaître le pourcentage de pathologies lymphocytaires malignes de type non-hodgkinien découvertes au laboratoire ICHV de Martigny par rapport aux affections non-tumorales. Nous avons également tenté d établir des critères utilisables au laboratoire, qui permettent aux techniciens en analyses biomédicales ES (TAB ES) de discriminer les lymphocytoses tumorales et réactionnelles. Mots-clés : lymphocytose absolue, lymphome, lymphocytose de stress, lymphocytose réactionnelle, lymphocyte, morphologie lymphocytaire Keywords : absolute lymphocytosis, lymphoma, transient stress lymphocytosis, infectious lymphocytosis, morphology

3 Table des matières INTRODUCTION BUT GENERALITES LES LYMPHOCYTES Lymphocyte Lymphopoïèse Fonctions des lymphocytes a. Immunité humorale b. Immunité cellulaire Lymphocytoses a. Valeurs de référence en fonction de l âge b. Lymphocytose relative et absolue c. Etiologies Lymphocytoses réactionnelles ou secondaires a. Etiologies b. Aspects morphologiques au microscope c. Aspect du scattergramme de l automate Lymphocytoses tumorales ou primaires a. Classification b. Fréquence des différents lymphomes MATERIEL ET METHODES Automate HmX a. Principe de fonctionnement b. Principes de mesure c. Modes opératoires d. Numération et répartition leucocytaires e. Interprétation des résultats Matériel biologique Etude statistique

4 RESULTATS Statistique Critères décisionnels DISCUSSION CONCLUSIONS REMERCIEMENTS BIBLIOGRAPHIE Références bibliographiques Liste bibliographique LEXIQUE ANNEXES Tableau Récolte de cas de lymphocytoses absolues H. Diem T. Nebe B.Bain

5 Introduction L Institut Central des Hôpitaux Valaisans est une fondation faisant partie du Réseau Santé Valais, et qui regroupe les laboratoires de l hôpital de Sion ainsi que des hôpitaux régionaux de Brigue, Viège, Sierre, Martigny, Monthey et Aigle. Chaque laboratoire exécute principalement des analyses de chimie clinique et d hématologie ; ces dernières sont supervisées, pour les sites de Martigny et Monthey, par le même hématologue responsable. Dans un réseau tel que l ICHV, l un des objectifs primordiaux est l unification des procédures de travail pour tous les sites. Cela est normal, dans la mesure où l on considère tous les laboratoires précités comme une seule et même entité, l ICHV. Des différences importantes dans la prise en charge des analyses et des résultats doivent, lorsqu elles sont découvertes, être corrigées! Néanmoins, il apparaît certaines différences entres les laboratoires. La découverte d une lymphocytose absolue n implique pas les mêmes conséquences d un laboratoire à l autre. Ce travail de diplôme a donc été mis sur pied dans l objectif de normaliser cette situation

6 But Actuellement, le laboratoire ICHV de Martigny est dans l obligation de téléphoner à l hématologue lors de chaque découverte d une lymphocytose absolue. Cette procédure a été mise en place dans le but de détecter efficacement des pathologies malignes lymphocytaires telles que les lymphomes non-hodgkiniens. Cette exigence n est pas appliquée à tous les laboratoires ICHV supervisés par l hématologue responsable. Dans un souci d unification et de gain de temps, le site de Martigny souhaite trouver une solution alternative à celle appliquée actuellement, et qui puisse être la même pour tous les laboratoires ICHV supervisés par l hématologue responsable. L objectif de ce travail est, dans un premier temps, de réaliser une étude statistique afin de quantifier le nombre de pathologies lymphocytaires malignes découvertes au laboratoire de Martigny. Dans un second temps, nous chercherons à déterminer de nouveaux critères décisionnels, qui permettraient, directement au laboratoire, de limiter les suspicions de lymphomes. Nous avons choisi une approche se basant en grande partie sur la récolte d informations sur les lymphocytes et leurs pathologies. Nous chercherons à savoir comment les auteurs préconisent de traiter les lymphocytoses absolues découvertes au laboratoire, puis nous tenterons d en déduire des critères utilisables au laboratoire ICHV de Martigny

7 Généralités Les lymphocytes 1. Lymphocyte Les lymphocytes sont des leucocytes qui tiennent un rôle majeur dans le système immunitaire. Selon leur structure et leur fonction, on distingue le type B (Ly-B), le type T (Ly-T) et le type NK (Ly-NK). Au microscope, le lymphocyte apparaît comme une petite cellule ovoïde, à noyau rond entouré d une fine bordure de cytoplasme sans granulations, d un diamètre d environ 8 à 10 µm. Son rapport nucléo-cytoplasmique est élevé. La chromatine est condensée, souvent d aspect motté. Cette morphologie décrit des lymphocytes «en repos», appelés également lymphocytes de standard puisqu ils servent d étalon à l évaluation de la taille érythrocytaire. On ne peut pas différencier les lymphocytes -B et -T sur un frottis sanguin. Figure 1 : Lymphocyte normal dans le sang périphérique. (Pochet, 2007) Les lymphocytes sont présents dans le sang, la lymphe, les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse et thymus) et secondaires (ganglions, rate, îlots lymphoïdes périphériques tels que les amygdales, les plaques de Peyer). Ils ont la capacité de circuler du sang vers la lymphe, puis de la lymphe vers le sang, en passant par le canal thoracique et la veine sousclavière gauche. Cette propriété augmente leurs «chances» de rencontrer un antigène sur leur passage pour pouvoir amorcer la réponse immunitaire. (Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998) - 7 -

8 2. Lymphopoïèse Les cellules souches lymphoïdes sont issues de la moelle osseuse. Il semblerait que les deux types lymphocytaires -B et -T soient issus d une seule et même cellule souche totipotente, mais qu au cours de la différenciation, ils évoluent vers l un ou l autre type fonctionnel selon le milieu où ils sont formés et les influences auxquelles ils sont soumis. Au cours de la différenciation, la cellule souche lymphoïde va donner naissance à trois cellules : Un progéniteur lymphoïde B, qui restera dans la moelle osseuse. Sous l influence notamment de l interleukine 7 (IL-7), il va proliférer et se différencier. On définit 4 stades de différenciation : o Pro-B : les gènes codant pour les chaînes lourdes µ, puis pour les chaînes légères κ et λ sont réarrangés. o Pré-B : présence de chaînes µ intra-cytoplasmiques, sans chaînes légères. o B immature : expression d immunoglobulines de type M (IgM) de surface o B mature : expression d IgM et d immunoglobulines de type D (IgD) de surface. Cette maturation se poursuit tout au long de la vie, sous le contrôle des cellules du micro-environnement médullaire (cellules épithéliales, endothéliales) et des cytokines (IL-7). Lors de la différenciation médullaire, les Ly-B présentant un réarrangement génétique non fonctionnel ou qui sont auto-réactifs (défaut de la reconnaissance du soi), sont éliminés par apoptose

9 Les Ly-B matures vont quitter la moelle osseuse pour la circulation sanguine. Ils coloniseront les zones B des organes lymphoïdes secondaires et formeront des follicules, où ils achèveront leur maturation par l acquisition de marqueurs membranaires spécifiques, de récepteurs au fragment Fc des immunoglobulines et d immunoglobulines de surface. C est notamment au sein des organes lymphoïdes secondaires que le contact entre les lymphocytes B et les antigènes s établit. Un progéniteur lymphoïde T, qui va migrer de la moelle osseuse vers le thymus, où auront lieu une forte prolifération et la maturation. On décrit trois étapes de maturation : o Thymocytes corticaux : comme leur nom l indique, on les trouve dans la zone corticale du thymus. Ils sont en division active, et se différencient en deux stades appelés thymocytes précoces, plus immatures, et thymocytes communs. Les thymocytes corticaux sont soumis à une sélection par les molécules du complexe majeur d histocompatibilité (CMH), qui conduit à l élimination d environ 95% des lymphocytes formés dans le thymus. La sélection est à la fois positive et négative : les thymocytes immunocompétents, capables de reconnaître les antigènes présentés par les molécules CMH-I et CMH-II, franchissent l étape de la sélection positive, alors que les Ly-T non fonctionnels (auto-réactifs notamment) sont éliminés par la sélection négative. L objectif de cette sélection est donc de ne conserver que la minorité de cellules qui pourra reconnaître le propre système HLA de l hôte sans réagir avec ses propres antigènes tissulaires. o Thymocytes médullaires : ils se trouvent dans la medulla corticale. Ce sont des thymocytes matures et fonctionnels, qui expriment à leur surface soit le CD4, soit le CD8, qui vont quitter le thymus pour passer dans la circulation sanguine

10 o Lymphocytes matures : ils expriment soit le CD4, soit le CD8 et sont répartis entre les zones T des organes lymphoïdes secondaires et la circulation. Les lymphocytes circulants se déplacent de façon continue entre le sang et la lymphe. Lymphocytes NK (natural killer) : ces cellules portent le CD8, mais pas le récepteur TCR, spécifique de la lignée T. Jusqu à aujourd hui, les livres d hématologie décrivaient les Ly-NK comme dérivant d un précurseur commun aux cellules T. Certains ouvrages, notamment Hoffbrand, Pettit, Moss & Hoelzer, semblent penser qu un précurseur commun existe bien, mais qu il est moins différencié, et à l origine des cellules -B, -T et -NK. Les Ly-NK entrent dans la classe morphologique des grands lymphocytes granuleux, ou LGL. Ce sont des cellules mononuclées, qui ne possèdent pas tous les marqueurs spécifiques de la lignée -B ou -T (notamment le TCR). Les granulations correspondent à des organelles ressemblant à des lysosomes. Les Ly-NK portent les marqueurs CD16, CD57 ainsi que le récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines. Elles sécrètent des cytokines telles que IL-1, IL-2 et δ-if. Elles agissent principalement au niveau de la surveillance immunitaire anti-tumorale et antivirale. Ces cellules cytotoxiques sont capables d induire, sans immunisation préalable, la lyse des cellules cibles selon deux voies : o La cytotoxicité dépendante des anticorps (ADCC), déclenchée par le CD16, efficace pour lyser des cellules cibles recouvertes d anticorps. o La cytotoxicité naturelle, efficace pour lyser les cellules cibles n exprimant pas le CMH-I. (Zandecki, 2007 ; Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998 ; Fuchs, 2004)

11 Au sein des organes lymphoïdes secondaires, tels que les ganglions lymphatiques, les Ly-B et T présentent une organisation spatiale très particulière : La zone corticale, la plus externe, est composée en majorité de Ly-B. En son sein, ils sont organisés en follicules ; les follicules primaires sont nonstimulés et contiennent de petits lymphocytes mûrs, alors que les follicules secondaires sont stimulés, et composés d un centre germinatif (site de prolifération des Ly-B et de production d anticorps) et d une zone dite «du manteau». La zone para-corticale, plus interne, est composée de Ly-T. Ils ne se disposent pas en follicules. La zone médullaire, qui est la plus profonde, contient des Ly-B ainsi que des plasmocytes. Cette organisation spatiale est importante à relever pour bien comprendre la classification des lymphomes. En effet, les lymphomes qui se développent à partir de cellules matures montrent des caractéristiques similaires à une souspopulation lymphoïde présente dans les tissus lymphoïdes secondaires. Ainsi, le lymphome du manteau trouve son origine dans ces cellules de la zone entourant le follicule, qu on appelle «zone du manteau» ; ou on peut encore citer le lymphome folliculaire, composé de lymphocytes se trouvant dans les follicules. (Vuillemin, 2003)

12 3. Fonctions des lymphocytes Les lymphocytes sont les principaux agents de l immunité spécifique. Une étroite collaboration existe entre les Ly-B et -T, ainsi qu avec les cellules phagocytaires, afin de permettre la destruction des divers agents pathogènes. Lorsque toutes les barrières non spécifiques de l organisme ont été franchies par un quelconque pathogène, l immunité spécifique prend le relais, à travers les lymphocytes. L immunité spécifique se divise en deux grands groupes : l immunité humorale et l immunité cellulaire. (Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998) a. Immunité humorale Ce sont les Ly-B qui sont responsables de l immunité humorale. Ils sont capables de synthétiser des immunoglobulines spécifiques d antigènes solubles ou particulaires. Les antigènes sont phagocytés par les macrophages de la rate ou des ganglions, puis sont exposés à la surface membranaire de ces cellules : les cellules capables d exposer ainsi les antigènes s appellent des «cellules présentatrices d antigène» (CPA). Le déterminant antigénique est ensuite présenté à un Ly-T, qui va sécréter de l interleukine 1 (IL-1) ; cette dernière va activer les Ly-T CD4 (helper), qui vont à leur tour sécréter un facteur de croissance et de différenciation pour les Ly-B. Ces derniers se transforment en immunoblastes B, puis en plasmocytes. Chaque plasmocyte du même clone produit un seul type d anticorps, spécifique de l antigène ou d un déterminant antigénique particulier. Ce sont tout d abord des IgM qui sont produits, puis les IgG

13 Afin de pouvoir produire une population d immunoglobulines aux spécificités aussi diverses que les antigènes potentiels, les gènes codants pour les chaînes lourdes et légères sont réarrangés par rapport à leur configuration germinale au cours des premières phases de la maturation des Ly-B. Les exons des régions variable, hypervariable, de jonction et constante subissent une série complexe d épissages, de délétions et de juxtaposition d ADN ; l aboutissement de ces remaniements est une gamme d immunoglobulines extrêmement variée. Les anticorps produits sont amenés vers l endroit de la stimulation antigénique par les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Ils se lient à l antigène, et le complexe antigène-anticorps formé est détruit, soit par phagocytose, soit par opsonisation, soit par activation du complément. Un certain nombre de plasmocytes redeviennent des Ly-B à l état de repos, et conservent en mémoire le contact antigénique. Lors d un contact ultérieur avec le même antigène, ils seront capables de produire des anticorps de type IgG plus rapidement et en plus grande quantité. On appelle ce phénomène la réponse anamnestique. (Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998) b. Immunité cellulaire Les Ly-T sont chargés de la réponse immune cellulaire. D une façon générale, les différents sous-groupes de Ly-T sont dirigés contre le non-soi : virus, allogreffes, cellules tumorales. Après le contact avec l élément pathogène, les Ly-T sensibilisés migrent vers le ganglion le plus proche et se transforment en immunoblastes-t, qui vont à leur tour se diviser pour produire plusieurs types de Ly-T :

14 T helper : ils portent le marqueur CD4, et sont nécessaires à la reconnaissance de l antigène présenté par les macrophages. Activés, ils sécrètent des lymphokines, qui permettent le déclenchement de la réponse immune. Ces molécules interviennent dans plusieurs processus : o Transformation et prolifération des Ly-B o Augmentation de la synthèse d immunoglobulines par les plasmocytes o Activation des Ly-T cytotoxiques o Recrutement et activation des cellules phagocytaires T suppresseurs : ils portent le marqueur CD8 ; ce sont des régulateurs des réponses humorale et cellulaire. Lorsqu ils sont présents, la production d immunoglobulines diminue, jusqu à s arrêter. T cytotoxiques : ce type de Ly-T, qui exprime également le CD8, est capable de réagir directement avec l antigène, et de détruire la cellule indésirable par cytolyse. L action lytique est liée à la reconnaissance des antigènes du CMH, classes I et II. Il ne faut pas les confondre avec les cellules NK et K, qui entrent dans le groupe des LGL. T mémoire : une petite partie des Ly-T impliqués dans la réponse à médiation cellulaire conserve la mémoire de l antigène qui les a stimulés. Ils deviennent des Ly-T au repos, circulants, qui pourront reconnaître un antigène rencontré ultérieurement. (Sebahoun, 2005 ; L Italien, 1998)

15 En résumé : Lymphocytes-B : o Présentation et reconnaissance de l antigène o Production d immunoglobulines o Fonction de mémoire. Lymphocytes-T : o Reconnaissance de l antigène o Régulation de la réponse immunitaire o Fonctions effectrices o Fonction de mémoire. Lymphocytes-NK : o Cytotoxicité o Production de cytokines

16 4. Lymphocytoses La lymphocytose se définit par une élévation au-delà des valeurs de référence, du nombre de lymphocytes par litre de sang. a. Valeurs de référence en fonction de l âge Dans tout lymphocytose absolue découverte au laboratoire, il est extrêmement important de tenir compte de l âge du patient. En effet, les valeurs de référence de tous les paramètres sanguins varient fortement en fonction de l âge. Les leucocytes et les lymphocytes présentent eux aussi des taux variables, comme le montre le tableau ci-dessous : Age Leucocytes G/L Lymphocytes % Lymphocytes G/L (calcul) Nouveau-né mois ans ans ans ans Adulte Tableau I : Intervalles de référence en fonction de l age. (Roh, 2000) b. Lymphocytose relative et absolue Il est important de distinguer une lymphocytose relative d une lymphocytose absolue : Lymphocytose relative : Pour les Drs. Zenhäusern, Lovey et Stalder (2006), «la lymphocytose relative est définie par un pourcentage de lymphocytes supérieur à 50% des leucocytes.» Cette lymphocytose peut néanmoins être seulement apparente : le pourcentage de lymphocytes par rapport aux leucocytes totaux est augmenté, sans qu il y ait augmentation du nombre absolu de lymphocytes par litre. Dans les lymphocytoses relatives, le nombre de leucocytes est souvent compris dans les valeurs de référence ou diminué, et la lymphocytose apparente est le résultat de la diminution d un autre type cellulaire (neutrophiles par exemple)

17 Lymphocytose absolue : augmentation du nombre absolu de lymphocytes par litre au-delà de 4 G/L, accompagnée ou non d une modification du pourcentage de lymphocytes. (L Italien, 1998) Le tableau ci-dessous donne un exemple de lymphocytose relative et absolue, en tenant compte des valeurs de référence pour l adulte : Lymphocytose absolue WBC : 12 G/L Lymphocytose relative WBC : 4 G/L Ly % : 40 % Ly % : 60% Ly # : 12 G/L x 40% = 4.8 G/L, soit supérieur à l intervalle de référence adulte. Ly # : 4 G/L x 60% = 2.4 G/L, soit compris dans l intervalle de référence adulte. Tableau II : Lymphocytose absolue et relative. (L Italien, 1998) c. Etiologies Deux grands cadres étiologiques peuvent être mis en évidence lors d une lymphocytose : Lymphocytoses réactionnelles (ou secondaires), associées à un contexte infectieux ou viral Lymphocytoses tumorales (ou primaires), liées à une maladie lymphoproliférative. (Zenhäusern, Lovey & Stalder, 2006 ; Van den Neste, Scheiff & Michaux, 2002) L un des objets de ce travail de diplôme est de définir des critères qui pourront être utilisés au laboratoire afin de différencier les deux étiologies

18 5. Lymphocytoses réactionnelles ou secondaires Chez l enfant, comme nous l avons démontré précédemment, une lymphocytose supérieure à 4 G/L est la plupart du temps physiologique, et parfois réactionnelle. Il devient crucial de savoir distinguer une lymphocytose réactionnelle d une lymphocytose tumorale chez l adulte. a. Etiologies La lymphocytose réactionnelle traduit une réaction immunitaire spécifique à un antigène, qui est le plus souvent déclenchée par un agent infectieux viral, mais parfois également par une infection bactérienne ou une autre cause non -tumorale. Selon Van der Neste, Scheiff & Michaux (2002), diverses étiologies sont possibles : Syndromes mononucléosiques : EBV, CMV, toxoplasmose, HIV, Herpes simplex / zoster, hépatites virales, rubéole, adénovirus, allergies médicamenteuses. Infections sans syndrome mononucléosique : coxsackie, rougeole, oreillons, coqueluche, brucellose, tuberculose. Lymphocytose persistante (chronique) : maladies auto-immunes, lymphocytose polyclonale du fumeur, inflammation chronique, hyposplénisme, splénectomie, sarcoïdose, thymome, granulomatose de Wenger, maladies endocriniennes. Lymphocytose de stress. Dans ce cadre réactionnel, les lymphocytoses de stress doivent être citées. En effet, une étude publiée en 2002 a évalué 52 cas consécutifs de lymphocytose absolue découverte au laboratoire. Chaque cas était associé à des conditions médicales hautement stressantes pour le patient. Les auteurs ont constaté que la numération des lymphocytes s élevait dans un intervalle de 4 à 10.4 G/L ; parallèlement, les leucocytes, les neutrophiles ainsi que les thrombocytes augmentaient. Pour les cas étudiés, les lymphocytoses retournaient dans des valeurs normales dans les 7 à 569 H suivant le diagnostic, avec une moyenne à 32 H

19 L étude immunophénotypique a révélé une augmentation absolue des Ly-B, -T et -NK similaire à celle qui se produit lorsque de l épinéphrine est administrée. Les lymphocytes présentaient une morphologie distincte de celle observée dans les syndromes viraux classiques ; bien que caractéristique, elle n était néanmoins pas pathognomonique. Il n a malheureusement pas été possible de trouver des données précises sur la morphologie de ces lymphocytoses de stress ; de plus, de nombreux auteurs (dont Mme Barbara J. Bain, auteur de «Blood Cells», 2006) citent cette étiologie dans leurs ouvrages. Nous avons contacté Mme Bain par , mais il ne lui a pas été possible de nous donner une explication précise et documentée sur le sujet (annexe 4). b. Aspects morphologiques au microscope i. Morphologie Certaines formes morphologiques sont caractéristiques d une lymphocytose réactionnelle. Ainsi, cette étiologie doit être évoquée devant des lymphocytes présentant les particularités suivantes : Cytoplasme hyperbasophile, pouvant présenter quelques granulations azurophiles regroupées Grande taille, 2 à 3 fois plus grand que le petit lymphocyte Rapport nucléo-cytoplasmique faible Noyau rond, parfois incurvé Chromatine dense Figure 2 : Lymphocyte activé, coloration Un ou plusieurs nucléoles Archoplasme proche du noyau. MGG. (Pochet, 2007) Les lymphocytes présentant ces caractéristiques se nomment également lymphocytes activés ou stimulés. (Schillinger, 2006)

20 ii. Polymorphisme Selon Schillinger (2006) : «La coexistence de ces cellules [hyperbasophiles] avec d autres, moins basophiles et moins caractéristiques, présentant tous les intermédiaires entre le petit lymphocyte et le plasmocyte, définit le caractère hétérogène et polymorphe de ces lymphocytoses réactionnelles, auquel on oppose souvent le caractère plutôt homogène d une population monoclonale». Une lymphocytose réactionnelle se traduit donc par une image lymphocytaire polymorphe, comprenant des lymphocytes classiques ainsi que des lymphocytes activés. Figure 3 : Lymphocytes polymorphes au MGG : lymphocyte normal en haut à gauche, lymphocytes atypiques sur les autres images. Homme de 21 ans atteint de mononucléose infectieuse. (Zandecki, 2006)

21 iii. Large Granular Lymphocytes (LGL) Ces cellules, caractérisées par leur grande taille et la présence de grains azurophiles nets dans un cytoplasme abondant et pâle, peuvent se trouver à l état physiologique en faible quantité (10 à 15%). Figure 4 : Un LGL au MGG, avec son noyau mature et de nombreuses granules azurophiles dans le cytoplasme. (Maslak, 2004) Selon Schillinger (2006), «ils peuvent excéder 15% [des lymphocytes totaux] dans les infections virales et bactériennes, dans les suites de greffes de moelle, et en réaction à un syndrome lymphoprolifératif. Dans tous les cas, l augmentation du nombre de LGL est temporaire et polyclonale.». Au cours de l étude statistique, nous avons remarqué une erreur récurrente : lors de la répartition manuelle, les LGL étaient souvent comptés comme des lymphocytes stimulés. Les TAB ES doivent être particulièrement rigoureux avec les critères cités plus haut pour bien différencier les deux types de cellules!

22 c. Aspect du scattergramme de l automate Dans les cas de lymphocytoses réactionnelles, le scattergramme montre une population lymphocytaire augmentée, d aspect hétérogène. La grappe des lymphocytes est plus grande, et plus étalée que dans une situation normale. Figure 5 : Cas de mononucléose infectieuse. Figure 6 : Cas d infection par un virus. (Figures 5 & 6 : CD-Rom Beckman-Coulter VCS-Workshop, 2006) Figure 7 : Scattergramme DF1, mononucléose infectieuse. Les grands lymphocytes basophiles ont été comptés dans la zone monocytaire, ce qui explique la traînée qui s étire vers le haut. (Beckman Coulter, 2000)

23 6. Lymphocytoses tumorales ou primaires Ce type de lymphocytose est caractérisé par une prolifération lymphoïde tumorale, à partir du tissu lymphoïde ; on l appelle aussi lymphome. Les cellules lymphoïdes tumorales peuvent se disséminent dans le sang, et ainsi être vues sur le frottis. a. Classification Il existe plusieurs dizaines de types de lymphomes, très hétérogènes, qui sont répertoriés dans la classification actuelle de l OMS. Cette classification prend en compte plusieurs critères : morphologie, clinique, immunologie et génétique moléculaire. Les lymphomes trouvent leur origine dans le tissu lymphoïde normal ; on assiste à un développement monoclonal de cellules lymphoïdes bloquées à un stade de maturation donné. Les cellules clonales se trouvent surtout dans les tissus et organes lymphoïdes. (Sébahoun, 2005 ; L Italien, 1998) Tous les lymphomes ne présentent pas de phase dite leucémique, qui correspond au passage des cellules tumorales dans le sang. Certains lymphomes sont mêmes totalement aleucémiques, comme la maladie de Hodgkin, le plasmocytome ou la plupart des lymphomes à cellules précurseurs. (Theml, Diem & Haferlach, 2002) Trois grandes catégories peuvent être mises en avant : les lymphomes T (15% de tous les lymphomes), les lymphomes B (75%) et la maladie de Hodgkin. (Zenhäusern, Lovey & Stalder, 2006 ; Lovey, Anchisi, Stalder & Zenhäusern, 2006)

24 La classification officielle de l OMS sépare les lymphomes de la manière suivante : Lymphomes B Lymphomes à précurseurs B Leucémie aiguë/ lymphome lymphoblastique B Lymphomes à cellules B matures Leucémie lymphoïde chronique B/ lymphome à petits lymphocytes Lymphome prolymphocytaire B Lymphome lymphoplasmocytique Lymphome splénique des zones marginales Leucémie à tricholeucocytes Myélome plasmocytaire Plasmocytome Lymphome extraganglionnaire des zones marginales des tissus lymphoïdes annexés aux muqueuses Lymphome B ganglionnaire des zones marginales (± B monocytoïde) Lymphome folliculaire Lymphome à cellules du manteau Lymphome diffus à grandes cellules B Sous types : médiastinal, primitif des séreuses, intravasculaire Lymphome de Burkitt Lymphomes T Lymphomes à précurseurs -T Leucémie aiguë/ lymphome lymphoblastique T

25 Lymphomes à cellules -T ou NK matures Leucémie lymphoïde chronique T Leucémie prolymphocytaire T Leucémie à LGL Syndrome de Sézary Leucémie à cellules NK Lymphome T/NK extraganglionnaire nasal et type nasal (lymphome angiocenrique) Mycosis fongoïde Lymphome cutané primitif à grandes cellules anaplasiques Lymphome T sous-cutané de type panniculite Lymphome T intestinal type entéropathique Lymphome T hépatosplénique Lymphome T angio-immunoblastique Lymphome T périphérique non-spécifié Lymphome T anaplasique à grandes cellules Lymphomes de Hodgkin Maladie de Hodgkin à prédominance lymphocytaire nodulaire Maladie de Hodgkin classique Lymphome de Hodgkin sclérosant nodulaire Lymphome de Hodgkin classique riche en lymphocytes Lymphome de Hodgkin à cellularité mixte Lymphome de Hodgkin en déplétion lymphocytaire Tableau III : Classification OMS des lymphomes. (Jaffe, Harris, Stein & Vardiman, 2001) Dans le cadre de ce travail, les différents sous-types de lymphome de Hodgkin seront volontairement écartés. Les auteurs consultés soulignent que l on ne trouve généralement pas de lymphocytose sanguine dans les lymphomes de Hodgkin. Les signes évoqués sont la neutrophilie, l éosinophilie ainsi que la lymphopénie ; cela signifie qu un lymphome de type Hodgkin ne sera pas détecté sur un frottis sanguin, le diagnostic est posé uniquement sur une biopsie ganglionnaire. Il n y a donc pas d intérêt à traiter de cette pathologie dans le cadre de ce travail de diplôme. Nous nous limiterons donc aux lymphomes non-hodgkiniens (LNH). (L Italien, 1998 ; Sebahoun, 2005 ; Bain, 2006 ; Hoffbrand, 2003)

26 Il faut encore relever que tous les LNH ne se comportent pas de la même façon. On distingue les entités suivantes : Lymphomes indolents ou de bas grade de malignité : o 30-40% des lymphomes o Evolution lente, survie de plusieurs années même sans traitement o Pas de traitement curatif o LLC, lymphome folliculaire, lymphome à tricholeucocytes, Lymphomes agressifs ou de haut grade de malignité o 50% des lymphomes o Evolution rapide, survie courte qui se compte en mois ou en semaines sans traitement o Traitement potentiellement curatif. o Lymphome à cellules du manteau, plasmocytome, myélome plasmocytaire, lymphome diffus à grandes cellules B, lymphome B médiastinal, lymphome de Burkitt (

27 b. Fréquence des différents lymphomes Figure 8 : Incidence des différents lymphomes. (Jaffe, Harris, Stein & Vardiman, 2001) Le nombre de LNH différents répertoriés rend impossible la description détaillée de la morphologie sanguine et des critères cliniques de chacun. Néanmoins, la formule sanguine et le frottis d un patient atteint de LNH feront suspecter une pathologie ; la présence de cellules très jeunes ou encore l aspect très monotone du frottis sanguin doit éveiller la vigilance du TAB ES

28 Matériel et Méthodes 1. Automate HmX a. Principe de fonctionnement Figure 9: Analyseur HmX, Beckman Coulter (Beckman Coulter, 2007) L analyseur d hématologie HmX, de la maison Beckman Coulter, est utilisé au laboratoire ICHV de Martigny pour toute la routine hématologique. Il permet d effectuer les FSS, les FSC et le comptage des réticulocytes en des temps courts, de manière totalement automatique. Les paramètres suivants sont analysés : Formule simple : WBC RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW PLT, MPV Graphiques RBC et PLT. Formule complète : WBC et répartition leucocytaire en 5 populations (neutrophiles, lymphocytes, monocytes, éosinophiles, basophiles) RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW PLT, MPV Graphiques RBC et PLT Scattergrammes WBC DF1, DF2, DF3. (Beckman Coulter, 2001)

29 b. Principes de mesure i. Volumétrie Le passage de cellules en suspension dans un liquide conducteur à travers un orifice calibré modifie la résistance électrique entre deux électrodes. On appelle cette méthode le «principe Coulter», du nom de son inventeur, Wallace Coulter, ou encore «mesure par variation d impédance». Electrode interne Vide régulé Electrode externe Liquide conducteur Orifice Flux de diluant Figure 10 : Principe Coulter. (Vieillefont, s.d.) A chaque passage d une cellule à travers l orifice, la modification de la résistance électrique entre les électrodes est enregistrée sous forme d impulsion. La hauteur du pic de l impulsion est proportionnelle au volume de la cellule détectée, et le nombre de pics correspond au nombre de particules ayant traversé l orifice. U Temps Figure 11 : Enregistrement des impulsions : passage de deux cellules de tailles différentes. (Vieillefont, s.d.)

30 Le nombre d impulsions enregistrées pour chaque volume défini (Figure 12, à gauche) correspond au nombre de cellules qui sont passées à travers l orifice durant un intervalle de temps défini (4 secondes). Les cellules sont ensuite classées en fonction de leur volume dans différents canaux (Figure 12, à droite), ce qui permet de construire des histogrammes érythrocytaires et plaquettaires. Figure 12 : construction des histogrammes, répartition des impulsions dans les canaux (Vieillefont, s.d.) Une résolution élevée correspond à un nombre de canaux élevé, qui traduit avec précision la réalité. Si la résolution est trop faible, la répartition volumétrique vraie des cellules est faussée. L automate HmX possède 256 canaux pour chacune des trois dimensions, soit un total de = 16'777'216 canaux. Une distribution mathématiquement exploitable est ainsi obtenue. Ce sont ces histogrammes, extrapolés, que l on retrouve sur la feuille de résultat que nous rend l automate. Si deux cellules traversent en même temps l orifice, elles ne génèrent qu une seule impulsion de grande amplitude : c est le passage en coïncidence. La fréquence de la coïncidence étant statistiquement prévisible en fonction du nombre de cellules, l analyseur effectue automatiquement la correction nécessaire

31 Les impulsions sont triées, de façon à ne garder que celles qui correspondent à un trajet standard à travers l orifice. Figure 13 : enregistrement de l impulsion en fonction du passage de la cellule à travers l orifice. (Vieillefont, s.d.) Afin d empêcher les cellules de retourner dans la zone de détection après leur passage à travers l orifice, un système de flux de balayage existe ; le diluant passe à la sortie de l orifice. Ce dispositif est particulièrement utile pour le comptage plaquettaire, qui peut être perturbé par des micro-impulsions. (Beckman Coulter, 2001) Zone de détection Sans flux de balayage Flux de balayage en vert Figure 14 : Action du flux de balayage sur le trajet des cellules. (Vieillefont, s.d.)

32 ii. Cytométrie multidimensionnelle La cytométrie mutidimensionnelle est une méthode qui permet de caractériser les cellules. L échantillon est mélangé à un agent lysant, qui détruit les érythrocytes ; puis un agent stabilisant est ajouté, ce qui stoppe la lyse et permet de conserver les leucocytes dans une condition proche de l état in vivo. Le mélange est ensuite envoyé dans la cellule de mesure. Un gainage fluidique oblige les cellules à se présenter les unes après les autres : c est la focalisation hydrodynamique. Cellule de mesure Flux de gainage Flux échantillon Flux de gainage Figure 15 : Architecture de la cellule de mesure. (Vieillefont, s.d.) Au niveau de la cellule de mesure se trouve un point unique de mesure : des électrodes enregistrent les variations d amplitude et de fréquence d ondes électromagnétiques, et un banc optique, dont la source lumineuse est un canon laser hélium néon à 633 nm, émet un rayon qui est focalisé, verticalement et horizontalement, pour produire un faisceau elliptique qui assure l illumination constante des cellules

33 Les leucocytes, lorsqu ils traversent la cellule de mesure les uns après les autres, sont soumis à trois mesures physiques simultanées : Mesure du volume : comme précédemment, la variation d impédance est mesurée (principe Coulter). Figure 16 : mesure du volume par le principe Coulter. Mesure de la diffraction laser : le faisceau laser hélium néon est diffracté de façon caractéristique en fonction de la structure interne, de la nature des granulations et de la surface membranaire du leucocyte ; plus le leucocyte est granuleux, plus il diffracte la lumière. Cette diffraction varie entre des angles allant de 10 à 70 degrés. Figure 17 : mesure de la diffraction laser. Mesure de la conductivité : un courant haute fréquence traverse le leucocyte ; ce dernier va modifier le courant en fonction de la structure de son noyau (forme, densité chromatinienne, nucléoles) et de la composition chimique de son cytoplasme ; plus le noyau est lobé et le cytoplasme riche, plus le passage du courant est freiné. Cette mesure permet de différencier des leucocytes de même volume mais de contenus différents par leur rapport nucléo-cytoplasmique. Figure 18 : mesure de la conductivité. Les trois mesures sont effectuées simultanément sur chaque cellule, et leur combinaison permet l identification de chacune. On nomme ces mesures «technologie VCS», pour Volume/Conductivité/Scatter light. (Document de qualité MAX M, ) Figure 19 : mesures simultanées. (Figures 11,12,13 & 14 : Beckman Coulter, 2007)

34 c. Modes opératoires iii. Prise en charge des échantillons Lorsque le sang est aspiré dans l automate, il est segmenté en 3 aliquotes : Un échantillon pour la mesure par volumétrie : numération et distribution érythrocytaires et plaquettaires. Un échantillon pour la mesure par volumétrie et photométrie : numération leucocytaire et dosage de l hémoglobine. Un échantillon pour l analyse cytométrique multidimensionnelle : formule leucocytaire et réticulocytes. (Beckman Coulter, 2001) d. Numération et répartition leucocytaires Les numérations et distributions éythrocytaires et plaquettaires ne seront pas expliquées dans ce travail, pour permettre de se concentrer sur les paramètres leucocytaires. Le nombre de leucocytes est obtenu par analyse de l échantillon selon le principe Coulter, à partir d une suspension où les érythrocytes ont été lysés. La dilution est au 1/250 ème. Les mesures sont enregistrées à partir d un volume de 20 fl, mais la population leucocytaire est comptée seulement à partir de 35 fl. Une vérification d éventuelles interférences est effectuée entre 30 et 35 fl. (Document de qualité MAX M, ) La répartition leucocytaire est effectuée par cytométrie multidimensionnelle, selon le principe expliqué plus haut. L automate effectue sa répartition sur plus de 8'000 cellules. Le HmX distingue 5 populations leucocytaires : Les neutrophiles Les lymphocytes Les monocytes Les éosinophiles Les basophiles

35 Chaque type cellulaire est exprimé en pourcentage ainsi qu en valeur absolue ; ce résultat est obtenu à partir de l analyse multidimensionnelle. Les résultats sont également rendus sous forme graphique en trois dimensions : le scattergramme. Chaque cellule analysée est placée dans un cube, en fonction du résultat de chacun des paramètres mesurés par la cytométrie : volume, conductivité et diffraction laser. Chaque type cellulaire présentant des caractéristiques VCS propres, des grappes de cellules se forment sur le scattergramme. Ces populations cellulaires peuvent être identifiées par leur position sur le graphique. BA LY M NE EO Sur les scattergrammes présentés : Les lymphocytes sont codés en bleu Les monocytes sont codés en vert Les neutrophiles sont codés en violet Les éosinophiles sont codés en orange Les basophiles sont codés en gris clair. Figure 20 : Vision schématique en 3 dimensions du scattergramme DF1 normal (Berard, 2004) V o l u m e Conductivité noyau Diffraction : Surface,granulations Figure 21 : Vue en 3D du scattergramme normal, avec légende des axes. (Vieillefont, s.d.)

36 Il n est bien sûr pas possible, sur les feuilles de résultat que nous rend l appareil, de représenter des graphiques en trois dimensions. Ils sont donc représentés en deux dimensions, et on peut obtenir plusieurs graphiques différents selon quelle face du cube on observe. Ces différents graphes se nomment DF1 (ordonnée : volume ; abscisse : diffraction), DF2 et DF3. (Hoogendijk, 2004) Figure 22 : Vue DF1, DF2 et DF3 d un scattergramme normal. (Coulter, 1997) e. Interprétation des résultats Pour interpréter les résultats des formules rendues par le HmX, les TAB ES doivent prendre en compte plusieurs éléments : Les scattergrammes, qui doivent montrer des populations cellulaires bien différenciées. Lorsque ce n est pas le cas, le TAB ES doit tirer un frottis et l examiner au microscope, quelles que soient les valeurs de la répartition données par l automate. Les messages affichés par le HmX peuvent être de trois types différents : o Les messages globaux, qui qualifient le bilan des différentes lignées cellulaires (normales ou anormales). o Les messages quantitatifs, qui indiquent que les résultats obtenus se situent hors des intervalles de référence établis par l utilisateur. o Les messages de suspicion, qui signalent des anomalies morphologiques. Il n y a pas de limite établie par le laboratoire pour ces messages, c est le système lui-même qui les génère

37 Les alarmes sont données par l automate sous forme de codes, lorsqu une anomalie survient lors du comptage des échantillons. Les résultats précédents doivent être pris en compte pour les patients connus du laboratoire. Il est important, lors de la validation, de tenir compte des résultats des dernières analyses si ces dernières ne dépassent pas 72h (critère propre à l ICHV!). Si la différence entre les résultats est trop importante, il faut faire une répartition manuelle. (Documentation Beckman Coulter, Messages et alarmes HMX, s.d. ; Documentation Beckman Coulter, 1999) 2. Matériel biologique Les échantillons utilisés pour la statistique ont été recueillis aux laboratoires ICHV de Martigny et Monthey entre début septembre 2007 et fin janvier Il s agissait d échantillons de sang complet prélevé sur EDTA. L EDTA-K 2, ou acide éthylène-diamine-tétraacétique dipotassique, est l anticoagulant de choix selon les recommandations de l International Council for Standardization in Haematology (ICSH). C est l anticoagulant utilisé pour toute la routine hématologique des laboratoires ICHV. L EDTA empêche la coagulation, en chélatant le calcium et en l empêchant ainsi de s ioniser et de provoquer la formation d un caillot. L EDTA permet de conserver intacts les érythrocytes et les leucocytes. Il faut néanmoins respecter un délai de 20 à 30 minutes avant de passer le tube sur l automate lorsqu une FSC est demandée ; en effet, un excédent de potassium est apporté par l anticoagulant dans le tube de sang. Pour tenter de rétablir la pression osmotique, les leucocytes rejettent leur eau et absorbent du potassium, ce qui se traduit par une diminution du volume cellulaire. L équilibre entre les cellules et le plasma est retrouvé en minutes, et à ce moment les leucocytes ont à nouveau un volume proche de l état in vivo. (L Italien, 1998 ; Beckman Coulter, 2006)

38 3. Etude statistique Afin de récolter un nombre suffisant de cas, les TAB ES ont reçu les directives suivantes pour résultat de lymphocytose absolue : La routine hématologique est passée sur l automate HmX, en mode primaire L automate rend un résultat de lymphocytes supérieur à 4 G/L Tirer un frottis sanguin supplémentaire Identifier le frottis par son NLab Colorer le frottis, puis le ranger dans la boite de collection prévue à cet effet Téléphoner au service duquel vient le patient pour obtenir des renseignements cliniques Téléphoner à l hématologue responsable pour savoir si le frottis doit être envoyé à Sion pour des examens complémentaires et noter sa réponse sur la feuille de résultats de l automate Photocopier la feuille de résultats de l automate, avec les renseignements récoltés. Nous avons ainsi pu récolter 74 cas de routine documentés entre septembre 2007 et janvier 2008, sur un total de 4306 FSC demandées. Nous avons répertorié les cas dans un fichier Excel (annexe 1). Dans un second temps et grâce à l aide du Docteur Lovey, nous avons pu obtenir des diagnostics précis pour chacun des cas. Nous avons ensuite établi une statistique avec les données obtenues. Il faut relever que cette statistique n est pas le reflet exact de la réalité ; les raisons en sont expliquées dans la conclusion de ce travail. De plus, nous avons été confrontés à l obligation d écarter un cas de la statistique ; en effet, la répartition leucocytaire de l automate ne correspondait absolument pas à la répartition manuelle. Il est possible qu il y ait eu une erreur lorsque le frottis a été confectionné, et que la lame soit celle d un autre patient

39 Etant donné la complexité de la classification des lymphomes et la volonté de définir des critères utilisables au laboratoire, nous avons choisi de classer les cas récoltés en deux catégories seulement : Cas présentant une pathologie lymphocytaire de type non-hodgkinien Cas présentant une autre étiologie. Sous cette dénomination sont donc regroupées les lymphocytoses réactionnelles, quelle qu en soit l origine précise, ainsi que les cas qui n ont pas suscité d inquiétude à l hématologue responsable lorsque le cas lui a été exposé par téléphone, et pour lesquels nous considérons qu un LNH est exclu

40 Résultats L objectif de ce travail est double : dans un premier temps, réaliser une étude statistique qui permette de quantifier le nombre de pathologies lymphocytaires malignes découvertes au laboratoire ICHV de Martigny. Dans un second temps, des critères décisionnels seront proposés, qui devraient permettre d exclure des suspicions de LNH dès le laboratoire, sans devoir passer par un hématologue. 1. Statistique Le résultat de l étude statistique est résumé dans le tableau ci-dessous : Total des cas Nombre de LNH LNH en pourcent Nombre d autres étiologies Autres étiologies en % % % Tableau IV : Résultats de l étude statistique. Sur les 73 cas récoltés, 20 proviennent du laboratoire de Monthey, et 53 du laboratoire de Martigny ; sur les 6 cas de LNH, 3 patients étaient déjà connus pour leur pathologie, et 3 ont été des découvertes au moment de la récolte de cas. Nous avons ensuite cherché à comparer les données des cas analysés : LNH Autre étiologie non-lnh WBC G/L Lymphocytes % Lymphocytes G/L (calcul sur la base du comptage manuel) Date de naissance Tableau V : Comparaison des données. Sur les 6 LNH compris dans les cas récoltés, trois, soit 50%, sont des cas de LLC

41 B. Les autres patients présentaient respectivement une leucémie à prolymphocytes T, un lymphome de la zone marginale ayant évolué en maladie de Hodgkin ainsi qu un lymphome lymphoplasmocytaire (maladie de Waldenström). 2. Critères décisionnels La découverte d une lymphocytose absolue au laboratoire impose de discriminer les deux étiologies principales : réactionnel vs tumoral. Selon Van den Neste, Scheiff & Michaux (2002), «le plus important est d exclure une monoclonalité qui signe généralement un processus lymphoprolifératif tumoral» (p.67). Lors de la prise en charge du patient dans sa globalité, de nombreux éléments entrent en ligne de compte. Le contexte et l examen clinique, l anamnèse, d autres anomalies biologiques associées, le frottis sanguin, l immunophénotypisation ainsi que la cytogénétique font partie de la démarche diagnostique totale. Une partie de ces éléments est disponible pour le laboratoire, mais certains critères ne sont pas accessibles aux TAB ES. Lorsque le laboratoire téléphone à l hématologue responsable du laboratoire ICHV de Martigny, pour lui signaler une lymphocytose absolue, il utilise les critères suivants pour différencier une lymphocytose tumorale d une lymphocytose réactionnelle : Age : au-delà de 40 ans, les risques de LNH augmentent. Contexte clinique : o Symptômes d infection virale o Stress (allergie, infarctus du myocarde) o Manifestations associées suggestives d un LNH, telles que adénopathies, état fébrile, perte pondérale, sudations inexpliquées, splénomégalie. Autre formule sanguine récente, afin de déterminer si la lymphocytose est persistante. Importance de la lymphocytose

42 Cytopénie associée : o Dérèglement auto-immun associé au lymphome o Infiltration médullaire lymphomateuse o Splénomégalie. Morphologie : o Lymphocytes monomorphes o Lymphocytes polymorphes. Scattergramme Autres examens réalisés : o Immunophénotypisation o Ponction biopsie de moelle. Selon ces critères, l hématologue responsable décide s il est nécessaire d exécuter d autres examens afin d éclaircir la situation. Certains des critères énoncés plus haut sont accessibles au laboratoire : La morphologie : lorsque l automate rend une lymphocytose, les TAB ES sont particulièrement attentifs à la morphologie des lymphocytes sur le frottis. L âge du patient : les étiquettes collées sur chaque tube ou feuille de résultat mentionnent la date de naissance complète. Résultats précédents : grâce au système informatique, les TAB ES peuvent avoir accès à des résultats antérieurs, s il y en a. Importance de la lymphocytose en valeur absolue : l automate rend une valeur numérique précise. Cytopénie associée : d autres cytopénies sont immédiatement visibles sur la feuille de résultat. Scattergramme : chaque résultat de FSC est accompagné du scattergramme des leucocytes. La morphologie est, d après certains auteurs, un critère de choix pour discriminer une lymphocytose tumorale ou réactionnelle. Ainsi, selon Van den Neste, Scheiff & Michaux (2002) :

43 L utilisation du modèle morphologique est vraisemblablement l attitude la plus utile en face d une hyperlymphocytose. Grâce au frottis sanguin, la gravité du problème est immédiatement définie. Ce n est que plus rarement qu il faut recourir à des techniques sophistiquées (immunomarquage, analyse génétique). Ces techniques sont néanmoins indispensables dans les maladies malignes du sang car elles confortent et précisent le diagnostic, orientent le type de thérapeutique, et fournissent des renseignements pronostiques. (p.71) De même, selon Zenhäusern, Lovey & Stalder (2006), «la laborantine ou l hématologue expérimenté reconnaissent les caractéristiques morphologiques suggestives d un état réactionnel (lymphocytes stimulés), de lymphoblastes ou d un syndrome lymphoprolifératif, et peuvent préciser les examens complémentaires à réaliser en cas de suspicion d hémopathie maligne.». Les auteurs cités placent donc la morphologie au premier plan. Puisque c est l un des critères dont dispose le laboratoire, il devient envisageable de l utiliser pour éliminer directement une suspicion de LNH