Explorations complémentaires en Hématologie Cellulaire

Transcription

1 Explorations complémentaires en Hématologie Cellulaire L3 Médecine 4 Octobre 2012 Dr Marina Lafage-Pochitaloff MCU-PH en Hématologie Laboratoire de Cytogénétique Onco-Hématologique Département de Génétique (Pr Lévy) CHU Timone Enfants Marseille Aix-Marseille Université marina.lafage@ap-hm.fr

2 Suspicion d hémopathie maligne : signes cliniques et biologiques diversement associés Signes d insuffisance médullaire : Anémie Syndrome infectieux Syndrome hémorragique Signes tumoraux : douleurs osseuses splénomégalie adénomégalie hépatomégalie Hémogramme (NFS avec réticulocytes) Anémie arégénérative Neutropénie Thrombopénie Hyperleucocytose ( si blastes circulants ou si myélémie)

3 Suspicion d hémopathie maligne : exploration de la moelle osseuse Myélogramme (frottis) Immunophénotypage (EDTA) Cytogénétique (Héparine) Caryotype, FISH Biologie moléculaire (EDTA) transcrits anormaux, mutations,

4 Explorations complémentaires dans le cadre d une hémopathie maligne Exemple de deux hémopathies malignes : Leucémie myéloide chronique (LMC) Leucémie aigüe lymphoblastique (LAL)

5 Modèle de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) (1) Hémopathie maligne Pathologie de la souche hématopoiétique Syndrome myéloprolifératif chronique (SMP) ou néoplasies myéloprolifératives de l OMS Evolution naturelle en 3 phases : Phase chronique Phase d accélération Phase aiguë : transformation en leucémie aiguë

6 Hématopoièse

7 CMP = CFU-GEMM ; GMP = CFU-GM ; EMP = CFU-EMK

8 Modèle de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) (2) Présence du chromosome Philadelphie (Ph) Présence du transcrit BCR-ABL Traitement ciblé anti-tyrosine kinase (ATK)

9 Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) Epidémiologie : Incidence = 10 nouveaux cas/ an / million d habitants Prévalence : en augmentation car diminution du taux de mortalité (progrès thérapeutiques : traitement ciblé anti-tyrosine kinase) Facteurs risque : benzène, radiations Age moyen au diagnostic : 54 ans Très rare chez l enfant, exceptionnel avant 5 ans Sex ratio : 1,4 homme pour 1 femme

10 Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) : clinique Circonstances de découverte : Asthénie Hémogramme systématique +++ Examen clinique : Le plus souvent : normal Parfois : signes tumoraux : splénomégalie signes liés à l hyperleucocytose : thromboses veineuses ou artérielles

11 Leucémie myéloïde chronique (LMC) au diagnostic : frottis de sang, objectif 20 Majorité de PN et de myélocytes Hyperleucocytose (100G/L) : polynucléose neutrophile et myélémie

12 LMC AU DIAGNOSTIC / : HEMOGRAMME Globules rouges 5,5 T/L Hémoglobine 15,5 g/dl Teneur Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine 30 pg Volume Globulaire Moyen 90 microns cube Globules blancs 64 G/L Polynucléaires neutrophiles 58 % soit 37G/L Polynucléaires éosinophiles 2 % soit 1,3 G/L Polynucléaires basophiles 4 % soit 2,6 G/L Monocytes 2 % soit 1,3 G/L Lymphocytes 6 % soit 3,8 G/L Myéloblastes 1 % soit 0,6 G/L Promyélocytes 3 % soit 1,9 G/L Myélocytes 18 % soit 11,5 G/L Métamyélocytes 6 % soit 3,8 G/L Plaquettes : 510 G/L

13 LMC : pathologie de la cellule souche avec prolifération et différenciation à la phase chronique

14 Suspicion de LMC : exploration de la moelle osseuse et du sang Myélogramme (frottis) Cytogénétique sur moelle (voire sur sang car myélémie) Caryotype (+/- FISH) Biologie moléculaire sur sang RQ-PCR

15 LMC phase chronique : myélogramme obj 20 * * Moelle très riche, polymorphisme (maturation conservée) *petits mgc à noyau non segmenté *

16 Myélogramme: importance du % de myéloblastes Phase chronique : myeloblastes <10% Phase accélérée : 10%<ou = myeloblastes <20% Phase acutisée en LAM : myeloblastes >ou =20% (TA)

17 LMC phase chronique : myélogramme Richesse : très riche, en nappe Mégacaryocytes : nombreux et de petite taille Lignée granuleuse : 88 % Myéloblastes : 2 % Promyélocytes : 3 % Myélocytes neutrophiles : 20 % Myélocytes éosinophiles : 3 % Métamyélocytes neutrophiles : 27 % Métamyélocytes éosinophiles : 3 % Polynucléaires neutrophiles : 26 % Polynucléaires éosinophiles : 4 % Polynucléaires basophiles : 2 % Lignée érythroblastique : 10% Proerythroblastes : 0 % Erythroblastes basophiles : 2 % Erythroblastes polychromatophiles : 4 % Erythroblastes acidophiles : 4 % Monocytes: 1 % Lymphocytes: 1% Hyperplasie medullaire globale à prédominance granuleuse évocatrice d un syndrome myéloprolifératif. Dystrophie mégacaryocytaire typique de LMC Conclusion : LMC en phase chronique

18 Philadelphie, 1960 : caryotype sur sang de LMC 1960 «A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia» Nowell and Hungerford, Science, 1960 Description du chromosome Philadelphie (Ph1 ou Ph) 1 ère anomalie chromosomique acquise caractéristique d une tumeur maligne

19 Caryotype hématologique : technique (1) Prélèvement (stérile) : Moelle osseuse, Sang (si cellules anormales) Sur héparine (sans conservateur toxique) Transport (cellules vivantes) rapide température ambiante Mise en culture Hotte stérile Flacon de culture milieu de culture avec ATB +/- mitogène (facteurs de croissance, ) d après N Nadal, CHU St Etienne

20 Caryotype hématologique : technique (2) culture cellulaire étuve à CO2 à 37 C durée : 1 à 3 jours arrêt de la culture en métaphase : synchronisation des cultures (blocage en phases S puis déblocage) colchicine (poison du fuseau mitotique) d après N Nadal, CHU St Etienne

21 Caryotype hématologique : technique (3) Transvasement des flacons de culture pour : Centrifugations Choc hypotonique Fixations Étalement des préparations chromosomiques Vérification au microscope à contraste de phase : présence de cellules en métaphase (mitoses)

22 Caryotype hématologique : technique (4) bandes G Traitement chimique des lames : dénaturation des protéines chromosomiques Trypsine : bandes G Chaleur+acide : bandes R Coloration Giemsa bandes R Observation des métaphases Saisie des métaphases puis classement des chromosomes (caryotype) d après N Nadal, CHU St Etienne

23 Caryotype humain Bandes G (à gauche) / Bandes R (à droite) ISCN, Cytogenet Cell Genet, 21, 6, 1978

24 1973 : Janet Rowley identifie l anomalie Ph comme une translocation t(9;22)(q34;q11)

25 CARYOTYPE Indication : LMC au diagnostic Caryotype sur : Moelle Conditions de culture : 48h avec synchronisation Marquage chromosomique: RHG Nombre de mitoses photographiées et analysées : 20 Résultats : Toutes les mitoses sont Philadelphie (Ph) positives sous forme de la translocation classique, t(9;22)(q34;q11). Il n a pas été décelé d anomalie clonale surajoutée. Formule chromosomique : 46, XY, t(9;22)(q34;q11) [20] Conclusion : LMC Ph positive

26 Philadelphia chromosome (Ph) : translocation de abl sur le 22 (Bartram C et al., Nature,1983) fusion de abl avec bcr (Shtivelman E et al, Nature,1985) : gène et transcrit chimérique BCR-ABL BCR BCR-ABL ABL

27 Transcrits chimériques BCR-ABL dans la LMC : MBCR majoritaire NB : Nomenclature bcr b2=e13 ; b3=e14

28 PCR en Hématologie : généralités (1) PCR ( polymerase chain reaction) : réaction de polymérase en chaine Utilisée depuis 1990 Très sensible : détecte 1 cellule sur 1 million Risque d échec si ARN dégradé PCR BCR-ABL sur la lignée de LMC K562

29 Prélèvements pour PCR Sang le plus souvent ( 1 à 2 tubes EDTA) Moelle osseuse Ganglion (lymphome) Extraction de l ADN et/ou de l ARN à partir des cellules nucléées 1 ml de sang normal contient : 10 millions de cellules nucléées ( NFS : nbre de GB = 10G/L) soit: 30 à 50 µg d ADN : PCR génomique et 1 à 10 µg ARN : RT-PCR (analyse des transcrits)

30 Transcription de l ADN vs Reverse transcription (RT) de l ARNm

31 PCR ( Polymerase Chain Reaction) : Réaction de polymérase en chaine 30 à 50 cycles : 2 30 copies soit 10 9 copies A chaque cycle, 3 phases: Dénaturation : 95 C Hybridation : 50 à 60 C Amorces (primers) : oligonucléotides 5 et 3 specifiques de la séquence à amplifier Elongation : 72 C Taq polymérase : enzyme de la bactérie Thermophilus aquaticus, ADN polymerase resistante à haute température (95 C)

32 PCR sur gel Puits 1: marqueur de PM Puits 2 : contrôle négatif (eau) Puits 3 : produit d amplification

33 RQ-PCR en Hématologie : RQ-PCR (real-time quantitative PCR): Utilisée depuis 2000 en Hématologie Très sensible : détecte 1 cellule sur 1million Permet de quantifier et donc d apprécier le taux de maladie résiduelle après traitement (MRD) Risque d échec si ARN dégradé

34 Real-time quantitative PCR (RQ-PCR) Deux technologies similaires : Taqman Light cycler Sonde oligonucléotidique interne fluorescente Détection de l émission de fluorescence en temps réel (PCR en temps réel) Mesure du Ct (cycle threshold), nombre de cycles nécessaires pour atteindre un seuil de fluorescence. Ct proportionnel à la quantité de «cible» présente dans l échantillon

35 RQ-PCR /LMC : amorces (F et R) et sonde (P) EAC (Europe against cancer program, Gabert et al.,leukemia, 17, 2003)

36 RQ-PCR : Technologie Taqman

37 RQ-PCR Taqman : plaque 96 puits Plaque 96 puits pour Taqman A B C D E F G H Transcrit recherché Transcrit controle

38 Amplification MBCR-ABL Patient Plasmide 10 5 Plasmide 10 4

39 Amplification transcrit contrôle (GUS ou ABL ) Patient Plasmide 10 5 Plasmide 10 4

40 RQ-PCR et LMC Calibrateur : plasmide avec un insert Mbcr Expression des résultats : Rapport nombre de copies BCR-ABL / nombre de copies du gène de contrôle : nombre de copies normalisé (NCN) Suivi : NCN suivi/ NCN diagnostic cinétique au cours de l évolution ++

41 RQ-PCR Indication : LMC au diagnostic Prélèvement : Sang Résultats : Recherche du transcrit MBCR-ABL positive. Qualité de l ARN : très bonne (Ct ABL: 24) Nombre de copies du transcrit MBCR-ABL pour 10 4 copies du transcrit contrôle (ABL) : 7564 Valeur de référence (médiane) au diagnostic des LMC en phase chronique : 8709 (100% qui servira de reference pour le suivi de la maladie residuelle )

42 Chromosome Philadelphie (Ph) et LMC au diagnostic (2) Ph absent dans 10% des cas de LMC au diagnostic : 5% des cas : BCR-ABL positif en PCR 5% des cas : BCR-ABL négatif en PCR Compléter le caryotype et la PCR par FISH BCR-ABL (sur le prelevement du caryotype)

43 Caryotype = Cytogénétique conventionnelle Caryotype : analyse globale du génome 1 caryotype hématologique : 500 bandes 1 bande = 5 à pb = 5 à kb Rappel : 1 gène : 100 à 1000 kb génome : pb = kb

44 Philadelphia chromosome (Ph) : translocation de abl sur le 22 (Bartram C et al., Nature,1983) fusion de abl avec bcr (Shtivelman E et al, Nature,1985) BCR BCR-ABL ABL

45 5 BCR- 3 ABL FISH probe

46 Sonde spécifique fluorescente BCR-ABL technique FISH ADN cible Traitement des lames Co dénaturation Hybridation Rinçages posthybridation Contrecoloration Analyse au microscope et analyseur d images d après N Nadal, CHU St Etienne

47 sonde FISH 5 BCR- 3 ABL LMC: t(9;22)

48 FISH sur chromosomes (FISH métaphasique) LMC Ph +, Sonde 5 BCR- 3 ABL

49 Sonde 5 BCR- 3 ABL FISH sur noyaux (FISH interphasique) Donneur sain Patient LMC 2R2V 1R1V1F Cytospins de cellules de moelle triées CD34+

50 LMC Ph negative, BCR-ABL positive Sonde 5 BCR - 3 ABL : insertion (22;9) 22 9 der(22) der(9)

51 5 BCR- 3 ABL FISH probe : insertion de séquences ABL dans BCR chr 9 chr 22

52 LMC au diagnostic : si absence de Ph au caryotype (10% des cas) Le plus souvent : BCR-ABL positif (en PCR et en FISH) Ph masqué ou cryptique dû à une insertion submicroscopique ( visible uniquement en FISH ) : insertion de 9 dans le 22 ou insertion de 22 dans le 9 pour créer un gène chimérique BCR-ABL répond au traitement ciblé par Imatinib Plus rarement : BCR-ABL négatif (en PCR et en FISH) LMC atypique, forme frontière SMP/SMD ne répond pas au traitement ciblé par Imatinib

53 Syndromes myéloprolifératifs chroniques (SMP) ou Néoplasies myéloprolifératives Pathologies de la cellule souche hématopoiétique Prolifération et différenciation de la lignée myéloide Plusieurs entités (OMS) : SMP de type LMC (Ph et/ou BCR-ABL positive) SMP non LMC (Ph et BCR-ABL négatifs) TE MFP PV SMP /SMD (Ph et BCR-ABL négatifs) LMMC LMC atypiques

54 Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms : The 2008 World Health Organization criteria and point care diagnostic algorythms. Tefferi A and Vardiman JW, Leukemia 2008;22:14-22

55 Role oncogénique de BCR-ABL Daley GQ et al, Science,1990

56 Protéines Tyrosine Kinases

57 Protéines ABL et P210 BCR-ABL (Goldman and Melo, NEJM, 2003)

58 (Goldman J and Melo JV, NEJM, 2003)

59 Traitement de la LMC en phase chronique : Traitement Tolérance Efficacité Hydréa (hydroxyurée) +++ +/- Allogreffe +/- - (GVH) ++++ (guérison) Interféron +/- ++ ATK Imatinib (Glivec) ATK 2 ème génération

60 (Gleevec, Glivec, Novartis) STI- 571 Inactive Active BCR-ABL Inactive Activée par l ATP Inactive inhibée par IM

61 Suivi des LMC par cytogénétique : critères d évaluation Kantarjian et al., NEJM, 1997 modifié en février 2002 Réponse cytogénétique majeure : Réponse cytogénétique complète : 0% Ph Réponse cytogénétique partielle : 1-35% Ph Réponse cytogénétique mineure : 36-65% Ph Réponse cytogénétique minime : 66-95% Ph Absence de réponse cytogénétique : % Ph NB : Caryotype médullaire avec analyse d au moins 20 métaphases

62 Patient MBCR : suivi Patient Plasmide 10 2 Plasmide 10 1

63 RQ-PCR MBCR-ABL Indication : LMC Mbcr positive traitée par Glivec depuis 1 an Prélèvement : Sang Résultats : Qualité de l ARN : bonne (transcrit contrôle :ABL) Recherche du transcrit MBCR-ABL positive. Nombre de copies du transcrit MBCR-ABL pour 10 4 copies du transcrit contrôle : 4 Valeur de référence au diagnostic : 8709 Taux de maladie résiduelle (local) = 4/8709= =0.05%= 0.5x10-3 Facteur de conversion du laboratoire pour standardisation internationale = 0.8 Taux de maladie résiduelle (international ): TMR = 0.05% x 0.8 = 0.04%=0.4x10-3 Conclusion : Réponse moléculaire majeure (RMM car TMR <10-3 soit 0.1%)

64 LMC : Niveaux de maladie résiduelle (European Leukemia Net, Baccarani et al, Blood, 2006)

65 Evaluation des LMC au diagnostic Recommandations de l ELN : Baccarani et al, JCO, dec 2009 clinique et NFS : Age Taille de la rate Taux de plaquettes Taux de blastes Basophiles Eosinophiles Myelogramme : % de myeloblastes caryotype sur moelle : Anomalies clonales surajoutées au Ph (CCA/Ph+) FISH BCR-ABL : Si Ph masqué (pour compléter le caryotype) Si echec de caryotype RQ-PCR sur sang

66 Evaluation des LMC au suivi Recommandations de l ELN : Baccarani et al, JCO, dec 2009 NFS : tous les 15j jusqu à RHC : réponse hématologique complète (rate non palpable, GB<10G/L, plaq<450,pas de myelemie, basophiles < 5%) RQ-PCR sur sang tous les 3 mois si traitement par Glivec jusqu à RMM (réponse moléculaire majeure) Tous les mois dans le suivi précoce des allogreffes (6 premiers mois), puis plus espacé (tous les ans après 2 ans post-allo) Caryotype moelle: 1ère année à 3 mois (ELN 2010),6 mois, puis tous les 6 mois jusqu à RCC (réponse cytogénétique complète) confirmée par un caryotype 6 mois après, puis tous les ans si pas de RQ- PCR possible Toujours si échec de traitement (resistance 1aire ou 2aire) ou cytopénie inexpliquée FISH BCR-ABL : Si Ph masqué (pour compléter le caryotype) Si echec de caryotype

67 Évaluation de la réponse à l Imatinib : ELN 2009 ( Baccarani et al, JCO,2009) Réponse Optimale Suboptimale Echec Vigilance diagnostic NA NA NA Risque élevé; ACA dans Ph+ à 3 mois RHC et au moins RCg mineure (Ph 65%) Pas de RCg (Ph > 95%) pas de RHC NA à 6 mois RCgP (Ph 35%) < RCgP (Ph > 35%) Pas de RCg (Ph > 95%) NA à 12 mois RCgC < RCgC < RCgP (Ph > 35%) < RMM à 18 mois RMM < RMM < RCgC NA À tt moment RMM stable ou en amélioration perte de RMM Mutations S à Imatinib ACA dans Ph+ perte RHC ou perte RCgC Mutations R à Imatinib Augmentation du transcrit ACC dans Ph- Dr N Nadal, CHU St Etienne

68 Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) Evolution naturelle en 3 phases : Phase chronique Phase d accélération Phase aiguë (crise blastique ou phase blastique) : leucémie aigue myéloïde (2/3 cas) leucémie aigue lymphoïde (1/3 cas) : type B

69 LMC en phase chronique : prolifération et différenciation moins de 10% de myeloblastes dans la moelle osseuse LMC en transformation aigue : blocage de la différenciation Moelle osseuse (myelogramme) : plus de 20% de myeloblastes / blastes dans la moelle osseuse clichés Drs S. Laibe et D. Sainty, IPC Marseille

70 TA de LMC en LAL ou LAM : blocage de la différenciation

71 Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) et caryotype Phase chronique : Ph isolé Phase d accélération et phase d acutisation (LA): Ph et anomalies chromosomiques clonales additionnelles (ACA)

72 47,XY,t(3;18)(q11;p11),+8,t(9;22)(q34;q11)

73 ACA /Ph: iso 17q : perte du 17p donc deletion du gène p53 46,XY,t(9;22)(q34;q11),i(17)(q10)

74 ACA /Ph: translocation (3;21) créant un géne chimérique AML1-EVI1 46,XY,t(3;21)(q26;q22),t(9;22)(q34;q11)

75 Anomalies chromosomiques clonales surajoutées au Ph Anomalies de nombre : trisomie 8 trisomie19 Anomalies de structure : Isochromosome 17q : i(17)(q10) ou idic(17)(p11) isoph : ider(22)t(9;22)(q34;q11) t(3;21)(q26;q22) : evi1-aml1 Anomalie de nombre et de structure : duplication du Ph : +der(22)t(9;22)

76 Genes associated with CML progression Radich J P et al. PNAS 2006;103: by National Academy of Sciences

77 Gènes impliqués dans la transformation des LMC Junia V. Melo & David J. Barnes Nature Reviews Cancer, 2007

78 Cooperativity hypothesis in acute myeloid leukemias (AML) Gilliland, D; Gary PhD, MD Current Opinion in Hematology. 8(4): , July

79 Chronic myeloid leukaemia as a model of disease evolution in human cancer Junia V. Melo & David J. Barnes Nature Reviews Cancer 7, (June 2007)

80 Caractéristiques de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) Hémopathie maligne Pathologie de la souche hématopoiétique Syndrome myéloprolifératif chronique (SMP) ou néoplasies myéloprolifératives de l OMS Présence du chromosome Philadelphie (Ph) Présence du transcrit BCR-ABL Traitement ciblé anti-tyrosine kinase (ATK)

81 Conclusion : Historique de LMC : avancées tous les 10 ans 1960 : Nowell et Hungerford, chercheurs à Philadelphie mettent en évidence la même anomalie chromosomique dans toutes les cellules de plusieurs cas de leucémie myéloïde chronique (LMC) : le chromosome Philadelphie (Ph) 1973 : Janet Rowley identifie l anomalie Ph comme une t(9;22)(q34;q11) 1985 : Traitement de la LMC par alpha-interféron : surveillance cytogénétique 1990 : Clonage de la t(9;22) : fusion des gènes BCR et ABL : diagnostic moléculaire et mise en évidence de l activité oncogénique de BCR-ABL 2000 : Traitement par Imatinib (Glivec), inhibiteur de l activité tyrosine-kinase de BCR-ABL :surveillance cytogénétique et moléculaire (PCR quantitative) 2005 : ATK de 2 ème génération (Dasatinib et Nilotinib) chez les patients resistants au Glivec très actifs (sauf si mutation T315 : allogreffe proposée ).

82

83 Explorations complémentaires dans le cadre d une hémopathie maligne 2 ème exemple d hémopathie maligne : Leucémie aigüe lymphoblastique (LAL)

84 Leucémie aigue lymphoblastique (LAL) (1) Hémopathie maligne aigue (prolifération mais pas de différenciation) Pathologie des progéniteurs lymphoides B ou T (lymphoblastes): LAL B : 75% des cas ; LAL T : 25 % des cas

85 Leucémie aigue lymphoblastique (LAL) (2) Rare mais la plus fréquente des néoplasies malignes de l enfant Urgence diagnostique et thérapeutique Thérapeutique adaptée dépend des explorations complémentaire

86 Suspicion d hémopathie maligne aigue : signes cliniques et biologiques Signes d insuffisance médullaire : Anémie Syndrome infectieux Syndrome hémorragique Signes tumoraux : douleurs osseuses splénomégalie adénomégalie hépatomégalie Hémogramme urgent Anémie (arégénérative) Neutropénie Thrombopénie Hyperleucocytose ( si blastes circulants )

87 Suspicion d hémopathie maligne aigue : hospitalisation en urgence pour exploration de la moelle osseuse Myélogramme (frottis) Résultat à J0 Immunophénotypage (CMF) Résultat à J0-J1 Cytogénétique : Caryotype, FISH Résultats à J2-J5 Biologie moléculaire : transcrits, IG-TCR Résultat à J5-J30

88 w

89 LAL : Children Répartition enfant /adulte Entités cytogénétiques spécifiques de lignée B ou T (sauf rares exceptions) Anomalies cytogénétiques Adults de nombre ou de structure (Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004)

90 Valeur pronostique de la cytogénétique dans les LAL de l enfant Survie sans événement (EFS) des LAL de l enfant du St Jude s Children Hospital de 1991 à 1999 : 3 protocoles successifs, 467 enfants Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004

91 LAL Children Répartition enfant /adulte des entités cytogénétiques Survie à 5 ans sans événement (EFS) Adults Enfants : 80% Adultes : 40% (Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004)

92 Typage des blastes : prélèvement pour CMF Acheminement rapide : 2-3h Température ambiante Sang, moelle osseuse, liquides biologiques Anticoagulant : EDTA, Héparine Tissu solide : ganglion milieu humidifié Sous la direction des anatomo pathologistes C. Fossat, CHU Marseille

93 MARQUAGE CELLULAIRE pour CMF : membranaire, cytoplasmique, nucléaire Ac mono ou polyclonaux : 350 CD (cluster de différenciation) Plusieurs clones/ CD Un épitope antigènique/clone Ig G1, Ig G2, Ig M : Origine murine Lyophilisés, liquides, purs ou marqués D après C. Fossat, CHU Marseille

94 Principaux marqueurs de lignée lymphoide Lignée B CD10 CD79a CD19 CD20 CD22 CD24 CD138 Lignée T CD3 CD5 CD2 CD4 CD8 CD1A CD2 CD7 D après C. Fossat, CHU Marseille

95 Les fluorochromes utilisés en CMF FITC Vert à 525 nm. PE Orange : 590 nm ECD Rouge à 620 nm. PC5 Rouge profond: 667 nm C. Fossat, CHU Marseille

96 Cytomètre en flux C. Fossat, CHU Marseille

97 Cytométrie en flux Laser Miroirs dichroïques FSC PMT SSC PMT Filtres FL3 FL4 FL5 FL6 FL2 FL1 PMT C. Fossat, CHU Marseille

98 Différenciation hématopoïèse Granulocytes Monocytes Lymphocytes C. Fossat, CHU Marseille GTLLF, 2006

99 Moelle «normale» Expression CD45, CD11b, CD14, CD16, C. Fossat, CHU Marseille

100 Acquisition en CMF : évènements Absence de bruit de fond en FITC, PE, CD 45+ CD 19+ C. Fossat, CHU Marseille

101 Nature de la prolifération pathologique d après le profil en CMF Immaturité Lymphoïde B Lymphoïde T Myélo-Mono Plaquettaire Erythroïde HLA Dr, CD34, TdT, CD10 cytcd79a, cytcd22, CD19 cytcd3 MPO, cytcd13, CD13, CD33, CD117, CD14, CD4 CD41, CD42, CD61 Glycophorine A, CD36, CD71 C. Fossat, CHU Marseille

102 LAL B : profil antigénique associé à la leucémie «LAP» (leukemia associated profile) Intensité d expression : 100% CD45, CD10, CD 38, CD19 Asynchronisme de maturation : 50% CD10/CD22, CD34/CD22, Infidélité de lignée : 20% CD13, CD33, CD7, CD2,... Evolution du clone : 20% Plusieurs combinaisons C. Fossat, CHU Marseille

103 «LAP» : LAL B Lymphocytes Hématogones Blastes C. Fossat, CHU Marseille

104 «LAP» des LAL T Intensité d expression : 100% ccd3, CD99 Asynchronisme de maturation : 50% TdT/cCD3, CD1a/TcR, Infidélité de lignée : 20% CD13, CD33, CD15, Evolution du clone : 10% Plusieurs combinaisons C. Fossat, CHU Marseille

105 Classification EGIL LAL B : ccd79a, ccd22 BI ProB Tdt+, CD10- BII B Commune Tdt+, CD10+ BIII Pre B Tdt+/-, CD10+, mc+ BIV B Mature Tdt-, CD10+/-, mc+,igs+ C. Fossat, CHU Marseille

106 Classification immunologique LAL T : ccd3 TI ProT CD7+, CD2+ TII PreT CD5+/-, CD8+/- TIII Cortical CD4+ ou CD8+,CD1a+ TIV Mature CD1a-, TcRa/b ou g/d C. Fossat, CHU Marseille

107 Leucémie aigüe lymphoblastique (LAL) : Entités les plus fréquentes LAL B: Adulte : LAL Ph Enfant : Hyperdiploidie et t(12;21)

108 LAL-B : anomalies de structure Children LAL Ph / t(9;22) / BCR-ABL Enfant : 3 % des LAL Adults Adulte : 25% des LAL

109 LAL-B : t(9;22)(q34;q11) / Ph / BCR- ABL LAL-BII (CD10 +) avec souvent marqueurs myéloïdes Caryotype : t(9;22)(q34;q11) FISH : sonde BCR-ABL 9 22 RT-PCR : 2/3 mbcr, 1/3 MBCR suivi moléculaire ++++ m M 5 - Sonde BCR-ABL extra-signal : Aspect de type M-BCR : 1F, 1V, 2R Si m-bcr : 2F,1R,1V

110 LAL Ph : Pronostic défavorable ( indication classique d allogreffe) en nette amélioration depuis l adjonction des ITK (Imatinib, Dasatinib) LAL Ph : apport de l Imatinib : protocole pédiatrique POG AALL0031 (Schultz K R et al. JCO 2009)

111 LAL-B : t(9;22)(q34;q11) / Ph / BCR-ABL Caryotype : Anomalies clonales additionelles (ACA) : 60% des cas ACA de type déséquilibrées : Gains Pertes : hyperdiploidie >50 (trisomie2) duplication du Ph trisomie 8 monosomie 7, deletion 7p : pronostic plus défavorable Deletion Ikaros /IKZF1 en 7p12 58,XY,+X,+2,+3,+5,+6,+8,t(9;22)(q34;q11), +13,+14,+15,+17,+21,+der(22)t(9;22)

112 E Delabesse, CHU Toulouse

113 E Delabesse, CHU Toulouse

114 E Delabesse, CHU Toulouse

115 E Delabesse, CHU Toulouse

116 E Delabesse, CHU Toulouse

117 E Delabesse, CHU Toulouse

118 E Delabesse, CHU Toulouse

119 E Delabesse, CHU Toulouse

120 LAL-B Children Hyperdiploidie >50 ( chr ) Enfant : 25% des LAL Adults Adulte : 7% des LAL

121 LAL-B : Hyperdiploidie chromosomes LAL-B II (CD10+) Profil chromosomique non aléatoire: +X, +4, +6, +10, +14, +17, +18, +21,+21 Index d ADN > ou = 1.16 (soit nombre modal >ou = 53) (Raimondi S, Blood, 1993) Très bon pronostic (sauf si Ph associé) : EFS à 5 ans : Enfant : 85% (Pui CH, NEJM, 2004) Adulte : 50 % (Moorman AV, Blood, 2007) 56,XX,+X,+4,+6,+9,+10,+14,+17,+18,+21,+21

122 LAL-B : Children t(12;21)(p13;q22)/tel-aml1 (ETV6-RUNX1) enfant : 22 à 27 % des LAL-B Adults adulte : 3 à 5 % des LAL-B très rare après 25 ans

123 LAL-B : t(12;21)(p13;q22)/tel-aml1 (ETV6-RUNX1) Phénotype : LAL-BII, souvent CD13+ 12p13 21q22 Caryotype : le plus souvent anormal mais la t(12;21)(p13;q22) est invisible au caryotype (anomalie cryptique) FISH : sonde TEL / AML1 ES (extrasignal AML1) RT-PCR : transcrit TEL-AML1 Pronostic très favorable : EFS à 5 ans : 86%

124 LAL-B : anomalies de structure Children LAL 11q23/MLL Myeloid Lymphoid Leukemia Enfant : 8 % des LAL-B 80 % des LAL du nourrisson <1 an «infant leukemia» Adults Adulte : 10% des LAL-B

125 Valeur pronostique de la cytogénétique dans les LAL de l enfant Survie sans événement (EFS) des LAL de l enfant du St Jude s Children Hospital de 1991 à 1999 : 3 protocoles successifs, 467 enfants Pui CH et al., NEJM, 350;15, 2004

126 LAL-B : t(4;11)(q21;q23)/ MLL-AF4 Phénotype : B-I, prob (CD10 neg ) avec souvent marqueurs myéloïdes FISH : sonde MLL 4 11 RT-PCR : transcrit chimérique MLL- AF4 der11 Pronostic défavorable avec variation selon l âge: très défavorable (indication d allogreffe) si : nourrisson < 6mois adulte der4 MLL 5 V/3 R

127 Sondes bicolores : -Signal de fusion Sondes FISH pour déceler les anomalies de structure : -Signal de séparation (break-apart) From Van den Burg, Leukemia, 2004

128 LAL-B : t(4;11)(q21;q23)/ MLL-AF der11 der4 MLL 5 V/3 R

129 Leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) : Valeur pronostique de la maladie résiduelle Maladie residuelle minime (MRD pour minimal residual disease) : maladie détectable en dessous du seuil de la cytologie (5% de blastes residuels ) Recherchée après chaque phase de chimiothérapie induction soit J30 post diagnostic 1 ère consolidation soit J60 2 ème consolidation soit J90 MRD moléculaire : valeur pronostique défavorable si Présence du transcrit bcr-abl dans les LAL Ph Niveau Ig-TCR >ou = 10-2 après induction dans les LAL de l enfant MRD par CMF : validée aux USA, en cours d évaluation en Europe

130 Niveau de sensibilité des techniques de suivi de la maladie résiduelle dans les LA D après E. Delabesse et al;, Transfusion clin et bio,10,2003

131 Apport de la CMF dans le suivi de la maladie : Etude de la maladie résiduelle Profil phénotypique associé à la leucémie : «LAP» Infidélité de lignée Asynchronisme de maturation Intensité d expression C. Fossat, CHU Marseille

132 MRD par CMF : exemple d une LAL de l enfant LAL B II (Mars 2002) Georgie Mai 2004 : pris en charge au CHU Timone, pour greffe allogénique intrafamiliale C. Fossat, CHU Marseille

133 MRD-CMF à l entrée - Moelle MRD-CMF =30% C. Fossat, CHU Marseille

134 MRD-CMF Pré Greffe - Moelle 25/08/05 MRD-CMF =0.35% C. Fossat, CHU Marseille

135 MRD-CMF M6 Post greffe - Moelle MRD-CMF <0.01% C. Fossat, CHU Marseille

136 MRD-CMF M10 Post greffe - Moelle MRD-CMF =0.7% C. Fossat, CHU Marseille

137 MRD-CMF M12 Post greffe - Moelle MRD-CMF = 5.2% C. Fossat, CHU Marseille

138 MRD-CMF M14 Post greffe - Moelle MRD-CMF = 16% Rechute C. Fossat, CHU Marseille

139 Survie sans rechute LAL : MRD/CMF moelle J21 1,0 <10-3, < <10-2,6,4 > 10-1,2 0, Temps (mois) p = 0.03 C. Fossat, CHU Marseille

140 LAL : suivi des patients par IG-TCR Rearrangement Ig-TCR : existence d un rearrangement monoclonal spécifique dans plus de 95 % des LAL Identification par séquençage au diagnostic puis PCR spécifique pour le suivi de la maldie résiduelle D après E. Delabesse et al;, Transfusion clin et bio,10,2003

141 E Delabesse, CHU Toulouse

142 E Delabesse, CHU Toulouse

143 E Delabesse, CHU Toulouse

144 E Delabesse, CHU Toulouse

145 E Delabesse, CHU Toulouse

146 E Delabesse, CHU Toulouse

147 Bilan cytogénétique, immunophénotypique et moléculaire au diagnostic (1) Anomalies cytogénétiques et/ou moléculaires acquises présentes dans toutes les hémopathies malignes Valeur diagnostique des anomalies de type primaire (exemple du Ph) La majorité de ces anomalies a une valeur pronostique indépendante : anomalies de type primaire : TEL-AML1 versus BCR-ABL dans LAL anomalies de type secondaire : ACA dans LMC et LAL Ph, deletion Ikaros dans les LAL Prise en compte dans les protocoles thérapeutiques ( décision d intensification, allogreffe dans les LAL, )

148 Bilan cytogénétique, immunophénotypique et moléculaire au diagnostic (2) Marqueurs de clonalité à établir au diagnostic pour le suivi des patients (maladie résiduelle ou MRD) Suivi cytogénétique : LMC Suivi moléculaire : LMC et LA (leucémies aigues) Suivi par CMF : LA Complémentarité des techniques : Analyse globale du génome : caryotype (résolution kb) Analyses ciblées : FISH (resolution : 50 à 100kb), PCR (transcrits chimériques), séquençage des gènes d Ig et TCR dans LAL

149 Suspicion d hémopathie maligne : signes cliniques et biologiques diversement associés Signes d insuffisance médullaire : Anémie Syndrome infectieux Syndrome hémorragique Signes tumoraux : douleurs osseuses splénomégalie adénomégalie hépatomégalie Hémogramme (NFS avec réticulocytes) Anémie arégénérative Neutropénie Thrombopénie Hyperleucocytose ( si blastes circulants ou si myélémie)

150 Suspicion d hémopathie maligne : exploration de la moelle osseuse Myélogramme (frottis) Immunophénotypage (EDTA) Cytogénétique (Héparine) Caryotype, FISH Biologie moléculaire (EDTA) transcrits anormaux, mutations,