Bactériologie de la tuberculose

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1 Bactériologie de la tuberculose Christine Bernard Centre National de Référence des Mycobactéries, Pitié-Salpêtrière Paris, France

2 Comment faire le diagnostic d une maladie peu fréquente? Incidence / 10 5 Cancer bronchique = 50 Tuberculose = 8 Lupus = 4 InVS, 2011

3 Impact du retard thérapeutique sur la mortalité Greenaway, AJRCCM 2002

4 Impact de l expertise hospitalière sur les performances diagnostiques de la tuberculose TB pour admissions P 0,2-3,3 3,4-9,9 >10 N hôpitaux N patients Dg initial erroné 56% 58% 16% < Délai traitement > 7 jours 43% 35% 12% < Décès 23% 12% 6% < Greenaway, AJRCCM 2002

5 Explorations bactériologiques et traitements chez des migrants avec une radiographie thoracique évocatrice de tuberculose Radiographie anormale + symptômes BAAR? (Schoch AJRCCM, 2006) Traitement? OUI 9 OUI 21 NON 19 Culture?

6 Radio anormale, pas de symptomes BAAR? Traitement? OUI 4 OUI 18 NON 30 Culture? Le diagnostic radio-clinique n est pas suffisant

7 La majorité des laboratoires font très peu de diagnostics de tuberculose Et l expertise biologique? <5500 cas de tuberculose prouvés bactériologiquement par an en France 11 laboratoires : > 100 cas/an 15 laboratoires : 50 à 100 cas/an 315 laboratoires du réseau CNR, médiane = 7 cas/an, c est à dire < 1cas/mois (données 2004)

8 Et l expertise biologique? A la Pitié-Salpêtrière : 100 cas tuberculose et 10 cas de mycobactériose prélèvements 400 cultures positives à M. tuberculosis complex (4 % ) (6 % si respiratoires, 0,2 % si liquides de séreuses) 200 cultures positives à mycobactéries atypiques (2 %) 300 cultures souillées (3 %) Même dans un laboratoire à forte activité, la quasi-totalité des prélèvements sont négatifs

9 Nécessité du diagnostic Seul diagnostic de certitude permet quantification test de sensibilité Typage bactériologique CULTURE Importance de l identification des patients bacillifères qui sont : les plus graves les plus contagieux (85% de la contagion) EXAMEN MICROSCOPIQUE

10 Rappel : les mycobactéries Classe : SCHIZOMYCETES Ordre : ACTINOMYCETALES Famille : MYCOBACTERIACEAE Genre : MYCOBACTERIUM (1 seul) Espèces : Pathogènes stricts Pathogènes opportunistes Réservoir Homme ou animal malade Environnement Pouvoir pathogène STRICT OPPORTUNISTE Transmission Espèces Interhumaine CONTAGIOSITE -complexe "tuberculosis" (M.tuberculosis, M. bovis, M.africanum) tuberculose -M. leprae lèpre Pas de transmission interhumaine -100 espèces dont 20 responsables d'infections (M. avium ) ="atypiques" mycobactérioses

11 Définition de la tuberculose Infection par une mycobactérie du "complexe tuberculosis"

12 Taxonomie Genre Mycobacterium Espèces : complexe tuberculosis Mycobacterium tuberculosis africanum bovis microtti canetti caprae pinnipedii

13 Caractéristiques générales des mycobactéries Taille : 0,5 x 1-10 Exigences nutritionnelles Croissance lente (tps division = 20h) Diagnostic bactériologique difficile Paroi épaisse très riche en lipides et en acides mycoliques (90C) ACIDO ALCOOLO RESISTANCE (BAAR) Résistance naturelle à de nombreux antibiotiques et antiseptiques Difficulté thérapeutique (traitement difficile et prolongé) % GC élevé (65% sauf M. leprae 57,8%) Aérobie stricte (microaérophile)/sensible aux UV Habitat naturel = Humain Pas de multiplication dans l'environnement

14 Paroi des mycobactéries

15 HISTOIRE NATURELLE

16 bacilles/ml Pénétration du bacille tuberculeux dans l'organisme humain Le malade porteur de lésions tuberculeuses ouvertes émet (parole, toux, éternuement) des microgouttelettes de mucus : gouttelettes de Flugge qui contiennent des bacilles tuberculeux (1 à 5 maximum/gouttelette, toux : 3500 gouttelettes, éternuement : 1 million gouttelettes) Les micro-gouttelettes se dessèchent >> noyaux des gouttelettes (droplet-nuclei de Wells) = bacilles tuberculeux Droplet-nuclei restent en suspension dans l'air et sont inhalés par les sujets en contact avec la source d'infection Si l'ascenseur muco-ciliaire de l'arbre respiratoire ne les arrête pas, les bacilles atteignent l'alvéole pulmonaire

17 Comportement du bacille tuberculeux après pénétration dans l'alvéole pulmonaire Multiplication à l'intérieur des macrophages > destruction des macrophages > pneumonie alvéolaire = foyer initial Dissémination par voie lymphatique (bacilles et antigènes drainés vers ganglions satellites par macrophage) > grande circulation (localisations extra-respiratoires) Réponse immune (macrophages, lymphocytes CD4, interleukines, lymphokines...) : en 3 à 6 semaines une réaction d hypersensibilité retardée apparaît, dans le même temps l immunité cellulaire est en place - «primo-infection» - virage tests cutanés à la tuberculine

18 Schéma simplifié de la transmission de la tuberculose : contagiosité +++ chaque année 30% infectés 90% formes latentes 5% réactivation 5% malade Traitement? 70% non infectés 90% infection silencieuse Non 50% mortalité 25% TB chroniques 25% guérison Oui 100% guéris

19 HISTOIRE NATURELLE BAAR+ Tuberculose maladie Infection tuberculeuse récente Tuberculose infection

20 Après la primo-infection tuberculeuse Dans 90 % des cas la primo-infection guérit MAIS des bacilles quiescents ("dormants") peuvent persister plusieurs années, où??? - dans le foyer initial? - dans les foyers secondaires formés avant la mise en place de l immunité? Moyen de diagnostiquer? (IDR)

21 Phénomène de Koch (inoculation de M. tuberculosis au cobaye) 1ére inoculation Nodule en 2 à 3 semaines Ulcération > pus blanc (caseum) Essaimage lymphatique Mort 2ème inoculation(avant mort animal) Ulcération en 2 à 3 jours >> HYPERSENSIBILITE > IDR tuberculine (extrait BK) Guérison spontanée >> VACCINATION BCG à la place 1ére inoculation

22 IDR = intradermoréaction IDR : injection sous-cutanée de 0,1 ml de tuberculine 10UI après désinfection par une solution non alcoolique, lecture à 72h En l absence de vaccination par le BCG, une IDR positive indique que le sujet a été infecté par Mycobacterium tuberculosis et confère un risque de tuberculose maladie de 5 à 10% tout au long de la vie

23 Trace immunitaire de l infection tuberculeuse (IDR = intradermoréaction)

24 IDR = intradermoréaction Enfant : IDR > 15 mm ou 10 à 15 mm si fort risque de contamination Si non vacciné IDR 10 mm ou 5 mm si fort risque de contamination

25 Limite de l IDR Le diagnostic de l infection tuberculeuse repose sur l intra-dermo réaction à la tuberculine (IDR) L IDR mesure une hypersensibilité retardée à la tuberculine Mélange d antigènes de M. tuberculosis, bovis et de mycobactéries atypiques En théorie l IDR est moins spécifique dans les populations vaccinées par le BCG

26 Principe des tests interféron Des sujets sensibilisés par des antigènes tuberculeux vont produire de l interféron gamma en présence de ces mêmes antigènes Un haut niveau de production d interféron gamma serait suggestif d infection tuberculeuse Existence de tests «maison» mais aussi de tests commercialisés : QuantiFERON-TB (cellestis limited, carnegie, victoria, australie) et T SPOT-TB (oxford immunotech, oxford, Grande-Bretagne)

27 Des antigènes spécifiques Deux antigènes codés par des gènes se trouvant dans la région RD1 (région de différenciation 1) ESAT6 (early secretory antigenic target 6) CFP10 (culture filtrate protein 10) Ces antigènes sont «spécifiques» de M. tuberculosis, ils ne se trouvent pas chez bovis BCG ni chez la plupart des mycobactéries atypiques sauf kansasii, marinum, szulgaï

28 Pratique des tests Sang total ou CMNS Ag M Tuberculosis ESAT 6, CFP10 Incubation O/N ou 48h Sécretion IFNg T mémoires mesure IFNg ELISA ELISpot IFNg pg/ml SFC/10 6

29 Quelles indications potentielles pour ces nouveaux tests? Diagnostic de la maladie Remplacement de l IDR pour le diagnostic de l infection tuberculeuse

30 Sensibilité des tests interféron pour le diagnostic de la tuberculose maladie Méta-analyse, Pai 2008 IDR 10mm : 72% (50-95) Quantiferon : 70-78% T-SPOT TB: 90% Sensibilité meilleure que l IDR mais < 100%

31 Spécificité des tests interféron chez les sujets sains Chez sujets à faible risque de tuberculose Spécificité BCG- BCG+ IDR 98% 56% Quantiferon 96% 100% Elispot 92% Méta-analyse Menzies 2007 Spécificité non influencé par BCG

32 Population suspecte d infection tuberculeuse latente Problème : pas de Gold Standard Comparaison avec l IDR et corrélation des résultats avec degré d exposition, vaccination BCG etc. Mesure du risque de développer une tuberculose maladie en fonction du résultat du test et comparativement à l IDR

33 Corrélation avec exposition tuberculeuse Ewer 2003 : 533 écoliers exposés Elispot RD1 vs IDR est plus corrélé à l exposition et non influencé par le BCG Brock 2004 : 125 contacts dont 40 vaccinés le quantiferon gold aussi discriminant sur degré d exposition que quantiferon-tb chez les non vaccinés Chez les vaccinés le seul quantiferon gold est très corrélé à l exposition Harada personnels de santé d un hôpital de Tokyo invités à participer, 332 participants (95% vaccinés BCG) 33 quantiferon gold positifs 304 IDR, mm QFT-G positif significativement associé à travail dans service tuberculeux mais pas l IDR QTF-G mieux correllé qu IDR à exposition TB chez les vaccinés BCG

34 L IDR manque-t-elle de spécificité chez les sujets vaccinés? Farhat, IJTLD vaccinés avant âge de 1 an 9% IDR>10 mm mais seulement 1% si IDR faite >10 ans après BCG vaccinés après âge de 1 an 42% IDR >10mm et 21% si IDR faite >10 ans après BCG (non amélioré avec seuil à 15mm) IDR faussement positive si vaccin fait après âge de 1 an

35 Ces tests interféron sont-ils prédictifs de développement d une maladie? Diel, 2010, Méta-analyse VPP progression vers la maladie en cas de test positif = 8 à 15% VPN non progression vers la maladie = 98 à 99% dans pays à faible incidence

36 Conclusion tests interféron Apparaissent plus spécifiques que l IDR dans un contexte vaccinal Ces tests comme l IDR ne distinguent pas infection et maladie, un examen clinique et une RX sont toujours nécessaires Valeur prédictive de développement de maladie ultérieure meilleure qu IDR mais reste faible

37 Recommandations HAS 2006 A utiliser en remplacement de l IDR Enquête autour d un cas, adulte >15 ans Embauche personnel de santé, services à risque Aide au diagnostic des formes extrapulmonaires de tuberculose maladie Avant le début d un traitement par anti-tnfα

38 TUBERCULOSE MALADIE

39 Formes cliniques de la tuberculose "maladie" Poumon = 37 C / bien oxygéné / obscurité = milieu de culture idéal 80% TB pulmonaires (1/2 contagieux = M+!) 20% TB extrapulmonaires : ganglionnaire osseuse uro-génitale péricardique méningée Miliaire tuberculeuse : dissémination hématogène atteinte multiviscérale (méningite +++)

40 TUBERCULOSE PULMONAIRE Clinique : AEG, perte de poids, fièvre, sueurs nocturnes, toux, expectoration, hémoptysie Biologie : syndrome inflammatoire Radiographie thoracique : anomalies (nodules, infiltrats, excavations) prédominant dans les parties les mieux oxygénées du poumon = lobes supérieurs, apex des lobes inférieurs

41 DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE

42 Diagnostic Bactériologique Microscopie seuil de détection = à 10 4 bacilles/ml Culture Indispensable pour sensibilité (10 à 100/ml) identification mesure de la sensibilité typage

43 Prélèvements pour Examen Microscopique Multiplication des prélèvements 30/40% M+ 65/75% M+ Expectoration Tubages Aspiration bronchique Expectorations post-fibroscopie

44 Expectoration : comment prélever? Nécessité de multiplier les prélèvements pour augmenter la sensibilité de l examen microscopique et de la culture car risque de contamination des cultures pour éviter «faux diagnostics» Warren 2000 : importance du volume de l expectoration Positivité de l examen microscopique parmi cas à culture positive selon volume du prélèvement volume non contrôlé 24 mois (n = 3,486) volume 5.0 ml 39 mois (n = 1,849) 73% p < %

45 Prélèvements : quantité Deux expectorations suffisent pour le diagnostic de tuberculose (niveau 2) Susan M. Nelson, Marcia A. Deike and Charles P. Cartwright J. Clin. Microbiol. 1998, 36(2):467. David W. Craft, Melissa C. Jones, Cherie N. Blanchet and Roy L. Hopfer J. Clin. Microbiol. 2000, 38(11):4285 Eng and Melvin P. Weinstein Philip Mathew, Yen-Hong Kuo, Bindu Vazirani, Robert H. K. J. Clin. Microbiol. 2002, 40(9):3482.

46 Que faire si pas d expectoration? Zar 2005 : expectorations induites (EI) ou tubages gastriques (TD) 3 EI et 3 TD chez 250 enfants, âge médian 13 mois 62 (25%) culture + EI+ : 87% TD+ 65% (p=0,02) bonne tolérance des EI Brown 2007 : comparaison 3 TD et 3 EI 107 adultes : 43% culture + EI+ : 39%+ TD+ : 30% (p=0.03) Les 3 EI peuvent être faits le même jour avec la même rentabilité diagnostique Expectoration induite plus rentable que les tubages

47 Que faire si pas d expectoration? Conde 2000 : comparaison expectoration induite (EI) et LBA VIH- (n=207) dont 118 tuberculeux sensibilité microscopie : 34% EI / 38% LBA sensibilité culture : 67% EI / 75% LBA VIH+ (n=44) dont 25 tuberculeux sensibilité microscopie : 36% EI / 40% LBA sensibilité culture : 60% EI / 60% LBA Expectoration induite aussi rentable qu endoscopie

48 Récapitulatif prélèvements Expectorations = 2 Si pas d expectoration ou BAAR- Expectoration induite = LBA > Tubages (niveau 3) Probable intérêt des expectorations post-fibroscopie (niveau 2)

49 Laboratoire L3

50 Recherche de BK dans les crachats par examen microscopique Etape clé +++ Permet de dépister les formes les plus contagieuses (1/2 cas!) Objectif de l OMS = diagnostiquer 70% des tuberculoses M+ Mycobacterium tuberculosis (BK): 1. n est pas présent dans la flore rhinopharyngée 2. peut être coloré spécifiquement (structure originale de sa paroi) : coloration de Ziehl-Neelsen avec la fuchsine phéniquée (colorant fort rose) qui n est pas éliminée par la double action de l acide et de l alcool (comme c est le cas avec toutes les autres bactéries) BK = bacilles colorés en rose autres bactéries = colorées en bleu

51 Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch)

52 Contagiosité selon richesse bactériologique Cas de tuberculose Index de Rôle estimé dans Type proportion contagion la transmission M+ C+ 33 % % Mo C+ 33 % 2 9 % Mo Co 33 % 1 4 %

53 Diagnostic de la tuberculose Examen microscopique = étape clé car elle permet de dépister les formes les plus contagieuses (OMS) Ziehl Neelsen (15 min) Auramine (3 min) Seuil = 5x bacilles/ml Mise en culture : INDISPENSABLE car plus sensible (10 à 100 BAAR/ml), permet seule l'identification, la mesure de la sensibilité et le typage tubes fermés (pour éviter la dessiccation, contamination) exigences nutritionnelles +++ (milieux à l œuf : Löwenstein-Jensen) à 37 C plusieurs semaines

54 Diagnostic de la tuberculose Identification "classique" : LONG (au moins 3 semaines) FASTIDIEUX A FAIRE dans un L3 Diagnostic en 3 à 4 semaines si M- et 2 à 3 semaines si M+

55 Diagnostic de la tuberculose Gain de temps avec milieux liquides = 1 semaine Malgré gain de temps les délais restent long, intérêt des tests moléculaires

56 Diagnostic de la tuberculose Rapidité de la primo-culture Milieux Microscope + Microscope - Solides jours jours Liquides* 5-10 jours jours * : détection précoce de la positivité plutôt que culture rapide * : il faut souvent 1-2 jours de plus pour pouvoir faire les tests

57 Diagnostic de la tuberculose : identification moléculaire Identification moléculaire SANS amplification (sondes) AVEC amplification Cibles : ARN16S (sondes, nombre de copies ARN 1000X> nombre de copies ADN) ADN (16S, région intergénique 16S-23S, 23S, reca, gyrb, hsp65, rpoβ ) Etapes communes aux deux approches : Inactivation de la souche Extraction des acides nucléiques Autres méthodes diagnostiques Biochimiques Antigéniques : MPT64

58 La PCR Réaction de polymérisation en chaine PCR mise au point en 1983 par Mullis L amplification génique a pour but d augmenter le nombre de copies d un segment cible d acide nucléique de manière à permettre sa détection Permet en théorie de détecter une molécule d ADN. Grand espoir pour le diagnostic de la tuberculose à partir des expectorations

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60 Performances de l amplification génique dans le diagnostic bactériologique de la tuberculose à examen microscopique positif Tuberculose Sensibilité Spécificité Prévalence VPP VPN M+ 98% 98% 85% 98% 90% Bonnes performances en cas d examen microscopique des expectorations positif Qu en est-il si l examen microscopique est négatif?

61 Performances de l amplification génique dans le diagnostic bactériologique de la tuberculose Tuberculose Sensibilité Spécificité Prévalence VPP VPN M+ 98% 98% 85% 98% 90% M- 72% 96% 5% a?? 2% b?? Extrarespiratoire (M-) 30% 98% 0,5%?? a : pneumologie, b : autres services

62 Des performances intrinsèques d un test à la réalité : prélèvement respiratoire à examen microscopique négatif Se = 72% Sp = 96% Malade Pas malade Prévalence = 5% 5 95 PCR + 3,6 (5x0.72) PCR - 1,4 (5x0.28) 3,8 (95x0.04) 91,2 (95x0.96) VPP = 3,6/(3,6+3,8) = 49% VPN = 91,2/(91,2+1,4) = 98%

63 Rappel sur la résistance acquise de M.tuberculosis aux antibiotiques de nature exclusivement chromosomique par mutation sélection apparaît facilement car: taux de mutation élevé (1 pour 10 5 à 1 pour 10 8 ) cavernes très riches en bacilles (jusqu à 10 8 ) antibiotiques fortement bactéricides (isoniazide, rifampicine,..)

64 Les différents tests utilisés pour mesurer la sensibilité aux antibiotiques de M. tuberculosis la méthode des proportions l antibiogramme en milieu liquide la détection moléculaire de la résistance

65 Méthode des proportions Canetti, Rist, Grosset, Rev Tub Pneumo, 1963,27: Mise au point à la fin des années 1950 pour isoniazide, streptomycine, kanamycine, éthionamide, PAS Basée sur la confrontation bactériologique-cliniquethérapeutique de plusieurs centaines de cas d échecs et de nouveaux cas - Proportion de bacilles résistants dans la population bactérienne du patient, c.a.d. rapport de l abondance des culture sur des milieux : - sans antibiotique nombre total de bacilles viables - avec antibiotique nombre de bacilles résistants

66 La méthode des proportions: principe mesure de la proportion de mutants résistants, sur milieu solide de L.Jensen souche résistante = souche dont la proportion de mutants est beaucoup plus élevée que celle des souches normales critères de résistance ( concentration critique et proportion critique) adoptés après étude de nombreuses souches sauvages et résistantes isolées chez des malades en cours de traitement

67 Proportions naturelles de mutants résistants au sein d une population «sensible» de M.tuberculosis Proportion de mutants 10 -x Nombre de bacilles résistants* Rifampicine Isoniazide Streptomycine Ethionamide *dans une caverne de 10 8 bacilles

68 La méthode des proportions : proportion critique choisie très supérieure à la teneur moyenne des souches sauvages en mutants résistants 1% ou 10% selon les antibiotiques, fonction de la teneur en mutants résistants des souches sauvages 1% pour INH, RMP, SM, EMB et PAS

69 Exemple résultat antibiogramme (méthode des proportions) témoin témoin INH0.2 SM4 RMP40 EMB conclusion 0.01% S 100% R <0.001% S <0.001% S

70 Exemple d antibiogramme sensible

71 Exemple d antibiogramme résistant

72 La méthode des proportions : performances résultats définitifs après 28 jours d incubation (voire 42) possibilité d antibiogramme direct utilisable pour les antibiotiques de réserve précision et reproductibilité dans la mesure de la proportion de mutants très bons résultats avec INH et RMP (SM et EMB) difficultés avec PZA et certains antibiotiques de réserve (cyclosérine, éthionamide)

73 Le cas du pyrazinamide pyrazinamide actif à ph acide seulement tests sur milieu à ph 5.5 avec beaucoup de difficultés ( croissance, maîtrise du ph) nombreux échecs pour absence de (ou trop forte!) croissance sur les témoins important: souches mono-résistantes au PZA extrêmement rares

74 L antibiogramme direct effectué directement à partir du prélèvement (et non à partir de la culture = antibiogramme indirect) possible seulement si le prélèvement est riche en bacilles (> 4 à 5 bacilles par champ, objectif X 25) et en quantité suffisante (pour ensemencer tous les tubes) interprétation: id antibiogramme indirect résultats en même temps que la culture positive

75 L antibiogramme en milieu liquide: principe étude indirecte de la proportion de mutants résistants dans les systèmes Bactec 960, Bact/Alert et les tubes MGIT souche résistante = souche qui se développe aussi rapidement dans le tube avec antibiotique que dans le tube sans antibiotique (inoculum du tube avec antibiotique =100 fois inoculum du tube témoin : > ou = 1% de mutants résistants)

76 L antibiogramme en milieu liquide : résultats en 5 à10 jours performances pas de détermination précise du % de mutants résistants mais réponse seulement en termes de <1% ou >1% pas bon pour antibiogramme direct (cocktail antibiotiques obligatoire pour la culture)

77 L antibiogramme en milieu liquide: performances (2) > 90% de concordance avec la méthode de référence pour INH et RMP mais 80 à 90% seulement pour SM et EMB > rester vigilant, en particulier en cas de rechutes pas de standardisation des concentrations critiques pour les antibiotiques de réserve

78 1.Diagnostic bactériologique de la résistance : 1.2 Techniques moléculaires

79 Tests de biologie moléculaire: généralités = mise en évidence de mutations sur les gènes qui codent pour la cible de l antibiotique amplification du gène et étude des mutations sur les amplifiats (Line probe assay ou séquençage) dépendant de la connaissance des gènes de résistance

80 Les tests moléculaires actuels Utilisés couramment ( dans le contexte d une possible résistance) rifampicine (RMP) et isoniazide (INH): bandelette Génotype MTBDRplus, Xpert MTB/RIF Réservés à des labos spécialisés, en cas de résistance à RMP ou INH pyrazinamide et fluoroquinolones : séquençage

81 Mode d action : Rifampicine : mode d action Se fixe à la sous-unité beta de l ARN polymérase : a 2 b b' s rifampicine Empêche l'initiation de la transcription : perturbe la synthèse des ARN messagers (Severinov et coll., J Biol Chem, 1993)

82 Rifampicine : mécanisme de résistance 95% des souches résistantes portent des mutations ponctuelles dans la région rpob codant pour la sous-unité beta de l ARN polymérase, comprise entre les codons 507 et 533 Diminution de l'affinité de l'arn polymérase pour la rifampicine Gly Gln Asp His Ser Leu Asp Leu Lys Pro Tyr Gly Val Glu Tyr Asp Leu Asn Arg Leu Trp Gln Cys Pro Gln Val Cys

83 Isoniazide : mécanisme d action et de résistance Deux modes de résistance à l'isoniazide : Mutations KatG Inh inactif Isonicotinic- Cible = InhA acyl-nadh Mutations : - augmentent le niveau d'expression - diminuent l'affinité pour inh-nadh

84 La bandelette Genotype MTBDRplus: principe, performances détection de la résistance à RMP: gène rpob (positions 511 à 533) détection de la résistance à INH position 315 du gène katg (résistance haut niveau) positions - 15 et -8 du promoteur du gène inha (résistance bas niveau) détection de # 100 % des résistances à RMP 85 % des résistances à INH : 90% des hauts niveaux et 60% bas niveaux (Brossier JCM 2007)

85 bandelette genotype MTBDR Sondes d oligonucléotides complémentaires aux séquences d ADN katg Région 315 (S315T) rpob D après D. Hilleman et coll., J Clin Microbiol, 2005.

86 Exemples de bandelettes

87 Performances des tests de biologie moléculaire pour détection de la résistance rifampicine: excellentes (sp,se,vpp et vpn*: >97%) isoniazide : bonne (se 85%) fluoroquinolones : séduisantes mais encore à l étude (sp?) pyrazinamide : vpn très bonne, vpp? *se= sensibilité, sp= spécificité, vpp = valeur prédictive d un résultat positif, vpn =valeur prédictive d un résultat négatif

88 Problèmes des souches mutées non résistantes Quid des bas niveaux de résistance? Van Deun, JCM 2009 : 12 souches considérées résistantes sur évolution clinique péjorative Mutations : Leu511Pro, Asp516Tyr, Leu533Pro, His526Leu, His526Ser Classées sensibles en MGIT960, BACTEC /12 classées résistantes en proportion LJ 10/12 classées résistantes en proportion 7H10 CMI non mesurées mais connues de «bas niveau» Comment classer ces souches?

89 Expectoration : qu en faire? Examen microscopique + -? culture Antibiogramme direct Amplification génique identification résistance antituberculeux rpob katg inha pnca gyra, gyrb culture Typage moléculaire

90 Marqueurs moléculaires

91 Marqueurs moléculaires (empreintes digitales génomiques) = Génotypage : bases de l interprétation des résultats Empreintes différentes = «souches différentes» : exclut un lien épidémiologique entre les cas. Empreintes identiques = «souches non différentes» (et non pas souches identiques) : n exclut pas, mais ne prouve pas, un lien épidémiologique entre les cas.

92 Marqueurs moléculaires «empreinte digitale génomique» Utilisations Au laboratoire Le malade Malades «proches» Malades «non proches» mais avec des caractéristiques communes faisant suspecter des liens Population entiére

93 Marqueurs moléculaires : techniques pouvoir discriminant = aptitude à obtenir des empreintes digitales génomiques différentes pour des souches bactériennes de cas manifestement indépendants RFLP : référence à ce jour Spoligotyping : bcp + commode, bcp - discriminant MIRU-VNRT : un peu moins discriminant que RFLP

94 Empreinte digitale génomique (génotypage) Méthode R F L P (Restriction Fragment Length Polymophism) Chromosome Fragments d ADN Coupure par enzyme de restriction à des sites spécifiques Electrophorèse Séparation des fragments selon leur taille Hybridation avec sonde marquée* IS 6110 «Profil RFLP» = nombre (1 à 20) et taille des fragments portant une copie de la séquence IS6110

95 Exemple de profils RFLP de souches de M. tuberculosis Souche de référence Sonde

96 Méthode MIRU-VNTR Minisatellites : régions (loci) contenant un nombre variable de séquences bp répétées en tandem (VNTRs) Supply et al. (2000) ont identifié 41 loci-vntr dans le génome de M. tuberculosis Ces loci ont été appelés Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRUs) 12 MIRUs présentent des variations dans le nombre de VNTR qu ils contiennent Le nombre de VNTRs de chaque locus MIRU peut être déterminé en mesurant la taille du fragment amplifié par PCR

97 Conclusion La culture reste le gold standard du diagnostic de la tuberculose La positivité de l examen microscopique permet d accélérer le diagnostic Il faut réunir les conditions pour qu il soit positif L intérêt des autres tests est très dépendant de la probabilité de tuberculose à priori

98 Juste prescription biologique pour le diagnostic bactériologique de la tuberculose: Analyses pertinentes et étapes techniques J0-J1 J10-J30 Microscopie : M+,M0 en cas de prélèvement M+ Amplification génique (PCR) + Détection de la résistance à la rifampicine si facteurs de risque Mise en culture Lecture des cultures identification rapide des cultures positives (mycobactéries du complexe tuberculosis) tests de sensibilité ATB 1ere ligne (au minimum isoniazide et rifampicine) > J30 tests de sensibilité ATB 2eme ligne Génotypage Diagnostic de l infection tuberculeuse / entourage-contacts