FT4 ELISA. Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif direct de la thyroxine libre (ft4) dans le sérum ou plasma humains.

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1 Fiche technique FT4 ELISA Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif direct de la thyroxine libre (ft4) dans le sérum ou plasma humains. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. BUT DU TEST Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif direct de la FT4 (thyroxine libre) dans le sérum ou plasma humains. 2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION L'hormone thyroïdienne, la thyroxine (T4), est produite par la glande thyroïde. L'iode constitue un élément important de cette synthèse. La principale forme de l'hormone thyroïdienne dans le sang est la thyroxine (T4). La thyroxine est convertie en T3 active (trois à quatre fois plus puissante que la T4) dans les cellules par les déiodinases (5'-iodinase). La globuline liant la thyroxine (TGB) est la protéine porteuse principale pour faire circuler l'hormone thyroïdienne. Seule une très petite fraction de l'hormone circulante est libre (non liée) - T %. Lorsque l'hormone de la thyroïde est liée, elle n'est pas active, de sorte que c est la quantité de FT3/FT4 qui est importante. Pour cette raison, la mesure de la thyroxine totale dans le sang peut être trompeuse. La concentration des hormones thyroïdiennes libres dans le sang est régulée par un mécanisme de rétroaction négative impliquant la TSH. La liaison de la T4 par la TBG joue un rôle clé dans ce mécanisme de rétroaction et les changements les plus importants qui se produisent dans la capacité de liaison de T4 résultent d altérations de la TBG. Les modifications des taux circulants de TBG résulteront en une augmentation ou une diminution proportionnelle de la concentration de T4 totale. Cependant, la mesure de FT4 sérique n'est pas affectée par des modifications des taux de liaison de T4 aux protéines et se corrèle donc bien avec l'état thyroïdien fonctionnel chez la plupart des individus. Les facteurs responsables d'écarts entre les taux sériques de T4 totale et les états thyroïdiens réels incluent la concentration de TBG, des hormones oestrogéniques (grossesse, contraceptifs oraux et oestrogènes) et les médicaments qui se lient à la TBG empêchant sa liaison à la FT4. Les thyronines agissent sur le corps pour augmenter le taux métabolique de base, affectent la synthèse des protéines et accroissent la sensibilité de l'organisme aux catécholamines (comme l'adrénaline) par permissivité. Les hormones thyroïdiennes sont essentielles au bon développement et à la différenciation de toutes les cellules du corps humain. Ces hormones régulent aussi le métabolisme des protéines, des lipides et des glucides, affectant la manière dont les cellules humaines utilisent les composés énergétiques. De nombreux stimuli physiologiques et pathologiques influencent la synthèse des hormones thyroïdiennes. La thyrotoxicose ou hyperthyroïdie est le syndrome clinique causé par un excès de thyroxine en libre circulation, de triiodothyronine libre, ou des deux. T3 et T4 sont toutes deux utilisées pour traiter l insuffisance en hormones thyroïdiennes (hypothyroïdie). 3. PRINCIPE DU TEST Les principaux réactifs requis pour un test immuno-enzymatique en phase solide comprennent l anticorps immobilisé, le conjugué antigène-enzyme et l'antigène natif. Lors du mélange d'anticorps immobilisé, du conjugué antigène-enzyme et d un sérum contenant l'antigène natif libre, une réaction de compétition se produit entre l antigène native libre et le conjugué antigène-enzyme pour un nombre limité de sites de liaison non solubilisés. L'interaction est illustrée par l'équation suivante: K a Enz.Ag + Ag + Ab cw AgAb cw + Enz.Ag Ab cw K -a Ab cw : Anticorps monospécifique immobilisé (quantité constante) Ag: Antigène natif (quantité variable) Enz.Ag.: Conjugué enzyme-antigène (quantité constante) Ag Ab cw : Complexe antigène-anticorps Enz Ag Ab cw : Complexe enzyme-antigène conjugué-anticorps K a : Taux constant d'association K -a : Taux constant de dissociation K = k a /k -a : Constante d'équilibre Une fois l'équilibre atteint, la fraction liée à l'anticorps est séparée de l'antigène non lié par décantation ou aspiration. L'activité enzymatique dans la fraction liée à l'anticorps est inversement proportionnelle à la concentration d antigène natif libre. En utilisant plusieurs références sériques différentes de concentration en antigènes connue, une courbe standard peut être générée à partir de laquelle la concentration d antigène d'un échantillon inconnu peut être déterminée. Version 1 02/ / 6

3 4. PRECAUTIONS D EMPLOI 1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l usage professionnel. 2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version valide de la fiche technique incluse dans le kit. S assurer que tout a été bien compris. 3. Dans le cas de dommages importants de l emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N utilisez pas les composants abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte. 4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. 5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. 6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL. 7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque. 8. Eviter tout contact avec la solution d arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées. 9. Éviter d exposer le réactif TMB/H 2 O 2 à la lumière directe du soleil, aux métaux ou aux oxydants. 10. La concentration totale de thyroxine sérique dépend d'une multitude de facteurs: la fonction de la glande thyroïde et sa régulation, la concentration de la globuline liant la thyroxine (TBG) et la liaison de la thyroxine à la TBG (3, 4). Ainsi, la concentration de thyroxine totale seule n'est pas suffisante pour évaluer l'état clinique. Les valeurs sériques de thyroxine totale peuvent être élevées dans des conditions comme la grossesse ou l'administration de contraceptifs oraux. Un test de fixation de T3 peut être effectué pour déterminer la concentration relative de TBG afin de déterminer si la T4 élevée est causée par une variation de TBG. Un tableau des médicaments interférants et des conditions qui affectent les valeurs de thyroxine totale a été compilé par le Journal de l'association américaine des chimistes cliniques. 11. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs à anti-hiv I/II, HbsAg et anti-hcv. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement contaminants et utilisés en tant que tel. 12. Non destiné au dépistage des nouveau-nés. 5. STOCKAGE ET STABILITE Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké à 2-8 C. À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Avant ouverture, les réactifs sont stables jusqu'à la date d'expiration indiquée. Le stockage et la stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres correspondants. Stocker tous les composants du kit à 2-8 C, ne pas utiliser après la date d expiration. Les réactifs sont stables pendant 60 jours à 2-8 C. 6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS Sérum, Plasma (EDTA, Héparine) Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l intégrité chimique d un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu à son analyse. Ne pas utiliser d échantillons fortement hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d apparence turbide doivent être centrifugés avant analyse pour éliminer toutes particules gênantes. Stockage: 2-8 C -20 C (Aliquots) Stabilité: 48 h 1 mois À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés. Version 1 02/ / 6

4 7. MATERIEL FOURNI Quantité Symbole Composant 1 x 12 x 8 MTP 1 x 12 ml ENZCONJ 1 x 6 x 1 ml CAL A-F 1 x 20 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml STOP 8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI Microplaque Prêt(e) à l emploi. Barrettes sécables. Recouvert d anticorps Anti-T4 IgG. Conjugué Enzymatique Prêt(e) à l emploi. Contient: Conjugué T4 HRP. Etalon A-F Prêt(e) à l emploi. Env. 0, 0.3, 0.95, 2.1,3.6, 7.0 ng/dl Contient: Anticorps anti-t4 IgG avec du conservateur. Voir les étiquettes pour des concentrations exactes. Tampon de Lavage, Concentré (50x) Contient: 45 g/l NaCl; 55 g/l Tween-20. Solution Substrat TMB Prêt(e) à l emploi. Contient: 0.26 g/l H 2O 2-TMB. Solution d Arrêt Prêt(e) à l emploi. Contient: 0.15 mol/l acide sulfurique. 1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 50 et 100 µl 2. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs 3. Bouteille pour lavage, système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque 4. Lecteur de microplaque capable de lire l absorbance à 450 nm (longueur d onde de référence nm) 5. Eau bidistillée ou désionisée 6. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre 9. NOTES POUR LA PROCEDURE 1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N utiliser que des pipettes et appareils calibrés. 2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S assurer que les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 C) et mélanger doucement en tournant chaque flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse. 3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs. 4. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d éventuelles erreurs de pipetage. 5. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier la répartition appropriée de la plaque. 6. Le temps d incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et au même intervalle de temps. Il est recommandé d utiliser une micropipette à 8-cannaux pour pipeter une même solution dans tous les puits. 7. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés provoqueront des résultats erronés. Il est recommandé d utiliser une pipette multicanaux ou un système de lavage de microplaque automatique. Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage ou l aspiration. Rincer et ajouter les réactifs avec précaution. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits soient régulièrement remplis avec le tampon de lavage, et qu aucun reste ne soit ensuite visible. 8. L humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n ait atteint la température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet refermé avec le dessiccateur. 9. Chaque test doit inclure une courbe étalon. Version 1 02/ / 6

5 10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Préparation des composants concentrés Diluer / dissoudre Composant avec Diluant Relation Stockage Stabilité 20 ml WASHBUF CONC 980 ml eau bidist. 1: C 1 mois 11. PROCEDURE DU TEST Avant de procéder au test, tous les réactifs, les références et les contrôles sériques doivent être amenés à température ambiante (18-25 C). 1. Pipeter 50 µl de chaque Etalon, Contrôle et échantillon dans les puits respectifs de la Microplaque. 2. Pipeter 100 µl de Conjugué Enzymatique dans chaque puits. 3. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Agiter la plaque avec précaution pendant secondes pour mélanger et couvrir. Incuber 60 min à TA (18-25 C). 4. Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 3 x avec 300 µl de Tampon de Lavage dilué. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. Il est possible d'utiliser un laveur de plaques automatique ou manuel. Suivre les instructions du fabricant pour une utilisation appropriée. 5. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l ajout des Solutions Substrat et d Arrêt. Pipeter ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d air. 6. Pipeter 100 µl de Solution Substrat TMB dans chaque puits. 7. Incuber 15 minutes à TA (18-25 C). 8. Arrêter la réaction substrat en ajoutant 100 µl de Solution d Arrêt TMB dans chaque puits. Mélanger rapidement le contenu en agitant la plaque. La couleur vire du bleu au jaune. 9. Bien mélanger pendant secondes. 10. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm (Longueur d onde de référence: nm) dans les 30 min suivant l ajout de la Solution d Arrêt. 12. CONTROLE QUALITE Chaque laboratoire doit tester les contrôles aux taux dans la plage hypothyroïdie, euthyroïdie et hyperthyroïdie pour surveiller les performances des tests. Ces contrôles doivent être traités comme des échantillons inconnus et leurs valeurs déterminées au cours de chaque procédure de test réalisée. Des diagrammes de contrôle qualité doivent être établis afin de suivre la performance des réactifs fournis. Des méthodes statistiques pertinentes doivent être employées pour vérifier les tendances. Chaque laboratoire doit fixer les limites acceptables des performances des tests. Les autres paramètres qui doivent être surveillés comprennent les points à 80, 50 et 20 % de la courbe d étalonnage pour la reproductibilité de série à série. De plus, l absorbance maximum doit être cohérente avec celles des expériences antérieures. Une déviation significative par rapport à la performance établie peut indiquer une modification passée inaperçue des conditions expérimentales ou une dégradation des réactifs du kit. Des réactifs frais doivent être utilisés pour déterminer la raison de ces variations. Version 1 02/ / 6

6 13. CALCUL DES RESULTATS Interprétation des résultats Si une réduction des données contrôlées par ordinateur est utilisée pour calculer les résultats du test, il est impératif que les valeurs prévues pour les étalons se trouvent dans une plage de 10 % des concentrations attribuées. Remarque Absorbance maximale (Calibrateur A) = D.O. >1.0 Absorbance moyenne Calculer la moyenne de l absorbance pour chaque point de la courbe d étalonnage et pour chaque échantillon. Courbe Etalon Tracer la valeur moyenne de l absorbance des standards par rapport à la concentration. Tracer la courbe de meilleur ajustement en suivant les points tracés. (par ex.: logistique à quatre paramètres). Calcul des Résultats Interpoler les valeurs des échantillons sur la courbe d étalonnage pour obtenir les valeurs correspondantes des concentrations exprimées en ng/ml. 14. VALEURS ATTENDUES Une étude de la population adulte euthyroïdienne a été entreprise pour déterminer les valeurs attendues pour le système de test ELISA FT4. Les valeurs moyennes, les écarts types et les plages attendues sont : Moyenne Gamme SD (ng/dl) (ng/dl) Adulte Grossesse LIMITES DE LA PROCEDURE Les contrôles et les références sériques peuvent présenter un aspect trouble avec le temps. Cela n'affecte pas la précision ou la performance du test. Utiliser jusqu'à épuisement ou jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'étiquette. Il est important que la durée de la réaction dans chaque puits soit maintenue constante pour obtenir des résultats reproductibles. La durée du pipetage des échantillons ne doit pas dépasser dix minutes pour éviter la déviation du test. L addition de la solution substrat lance une réaction cinétique qui est arrêtée par l addition de la solution d arrêt. Par conséquent, l addition de la solution substrat et de la solution d arrêt doivent être réalisées selon la même séquence afin d éliminer toute déviation due au temps pendant la réaction. Les lecteurs de plaques procèdent aux mesures verticalement. Ne pas toucher le fond des puits. Une élimination inadéquate de la solution adhérente au cours de(s) étape(s) d aspiration ou de décantation lors du lavage peut résulter en une mauvaise réplication et des résultats faux. 16. PERFORMANCE Précision Variation Intra-Essai Les variations à l intérieur d une série ont été déterminées par des mesures répliquées (20x) de trois sérums de contrôles différents dans un seul test. La variabilité à l intérieur du test est % Variation Inter-Essai Les variations entre les séries ont été déterminées par des mesures répliquées (10x) de trois sérums de contrôles différents provenant de différents lots du kit. La variabilité entre les tests est %. Sensibilité La plus faible concentration détectable de FT4 qui peut être distinguée de la référence zéro est 0.05 ng/dl à la limite de confiance de 95 %. Version 1 02/ / 6

7 Spécificité La réactivité croisée de l anticorps est indiqué dans le tableau: Substance Réactivité Croisée Concentration l-thyroxine d-thyroxine µg/dl l-triiodo-thyronine µg/dl d-triiodo-thyronine µg/dl Monoiodo-Tyrosine N/D 100 µg/ml Diiodo-Tyrosine N/D 100 µg/ml Acide Triiodotyroacétique N/D 100 µg/ml Acide Tétraiodotyroacétique µg/ml Corrélation avec la méthode de référence RIA La microplaque FT4 a été comparée à une méthode de test radio-immunologique en tube recouvert. Le nombre total de spécimens était de 197. La courbe de régression linéaire a été calculée : (FT4 RIA) = 0.952*(FT4 IBL) r 2 = CAUSES POSSIBLES D ERREUR / SUGGESTIONS Aucune réaction colorimétrique - aucun conjugué pipeté - contamination des conjugués et / ou du substrat - erreurs dans l'exécution de la procédure du test (par ex. pipetage accidentel de réactifs dans un ordre incorrect ou à partir d'un mauvais flacon, etc.) Réaction trop faible (DO trop faibles) - conjugué incorrect (par ex., ne provenant pas du kit d'origine) - durée d'incubation trop courte, température d'incubation trop basse Réaction trop élevée (DO trop élevées) - conjugué incorrect (par ex., ne provenant pas du kit d'origine) - durée d'incubation trop longue, température d'incubation trop élevée - qualité de l'eau du tampon de lavage insuffisante (bas niveau de déminéralisation) - lavage insuffisant (conjugués pas éliminés correctement) Valeurs aberrantes inexplicables - contamination des pipettes, des embouts ou des récipients - lavage insuffisant (conjugués pas éliminés correctement) CV Intra-test trop élevé - réactifs et/ou bandes non préchauffées à température ambiante avant utilisation - le laveur de plaques ne fonctionne pas correctement (suggestion : nettoyer la tête laveuse) CV Intra-test trop élevé - conditions d'incubation non constantes (durée, température) - les contrôles et les échantillons ne sont pas distribués en même temps (avec les mêmes intervalles) (vérifier la séquence de pipetage) variation liée à un facteur humain 18. LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT 1. Barker, S.B, JBC 173, 175, (1948). 2. Chopra, I.J, et al J. Clinical EndocrinoL, 33, 865 (1971) 3. Young, D.S, et al Clinical Chemistry 21, 3660 (1975) 4. Sterling, L, Cleveland CRC Press, P (1975) Version 1 02/ / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /