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1 Le support de la formation est en ligne

2 Recherche de gènes significatifs

3 Sortir une liste de cibles sur 1 manip 1. Ouvrir le fichier de résultats normalisés (avec R) dans Excel 2. Enregistrez le sous un autre nom (au format.xls) 3. Transformez les séparateurs décimaux de point en virgule 4. Supprimez les lignes filtrées (NA), et les spots sans descriptions ou vides (ID vide ou empty) 5. Triez les résultats par valeur de la moyenne des intensités (A), et supprimez les spots trop faibles (A < 8) 6. Triez les résultats par valeurs de ratio (M) 7. Récupérer dans un fichier à part les 30 gènes les plus induits et les 30 gènes les plus réprimés et sauvez cette liste 8. Comparez cette liste avec les résultats attendus

4 Prétraitement des matrices d expression

5 Passage aux séries de données En entrée : 1 fichier de données normalisées par expérience En sortie : 1 fichier regroupant toutes les expériences Gène lame33 lame36 lame34 lame03 lame06 YER184C YOR162C NA YGR225W Reconstruisez la matrice d expression dans Excel à partir des fichiers normalisés par R (dans le répertoire «fichiers_normalises» du disque «formation») 2. ATTENTION, n oubliez pas d inverser les expériences en «dye swap» et donc de choisir le sens de votre référence, exemple : Cy5 = YRR1 Gof / Cy3 = WT, ratio > 0 => gène induit par YRR1

6 Prétraitement de la matrice d expression 1. Préparer la matrice pour son utilisation dans GEPAS (ne garder que la colonne NAME et supprimer ID) 2. Allez sur le site de GEPAS : 3. Sélectionnez «Outils» puis «Preprocessing»

7 Prétraitement de la matrice d expression

8 Gestion des valeurs manquantes et des réplicats 1. Fusionnez les réplicats 2. Éliminez les profils avec trop de valeurs manquantes 3. Relancez une pré-analyse

9 Gestion des valeurs manquantes 1. Extrapolation des valeurs manquantes dans les profils restants 2. Lancez une nouvelle pré-analyse pour vérifier les histogrammes

10 Recherche de gènes significatifs

11 Préparer le fichier pour SAM 1. Récupérer le fichier prétraité par GEPAS 2. Ouvrir le fichier dans Excel et le préparer pour SAM

12 Significance analysis for microarrays (SAM) 1. Méthode : «One Class», Permutations 500

13 Significance analysis for microarrays (SAM)

14 Trouver des gènes significatifs (SAM) 1. Dans la table des valeurs de delta, regarder la valeur de delta pour FDR median = 0,5% 2. Sur le «SAM plot» appliquez le seuil avec le delta choisi 3. Affichez la liste des gènes différentiellement exprimés 4. Comparez les résultats obtenus avec la liste sur une manip 5. Cherchez des corrélations fonctionnelles : SGD, FunSpec, KEGG

15 Clustering

16 Cluster d expériences 1. Ouvrir la matrice d expression avec MeV 2. Lancer un clustering hiérarchique par expériences (HCL ou ST)

17 Comparaison de série de données Les données analysées lors de cette séance de travaux dirigés ont été réalisées dans le but de caractériser la réponse du transcriptome de la levure S. cerevisiae à l activation constitutive du facteur de transcription PDR1. Le fichier de données initial comporte les mesures de log 2 (Ratio) de 6 points de mesure (2 heures, 4 heures, 7 heures, 10 heures, 14 heures, 18 heures) pour plus de 6200 gènes. Gène 2h 4h 7h 10h 14h 18h YER184C YOR162C NA YGR225W Devaux F, Marc P, Bouchoux C, Delaveau T, Hikkel I, Potier MC, Jacq C. An artificial transcription activator mimics the genome-wide properties of the yeast Pdr1 transcription factor. EMBO Rep Jun;2(6):493-8.

18 Les différentes étapes à appliquer 1. Pré-analyse dans GEPAS (pour vérifier la matrice) 2. Application du pré-traitement : Fusion des réplicats Suppression des profils ayant trop de valeurs manquantes (> 30%) Estimation des valeurs manquantes restantes (KNNimpute = 15) 3. Utilisez le module d ACP de J-Express : => Regarder les profils des gènes les plus éloignés du nuage central 4. Utilisez l algorithme des k-means (KMC) dans MeV : => Essayer de trouver un nombre de groupes «optimal» 5. Utilisez GEPAS pour filtrer les profils invariants

19 Gestions des profils invariants 5. La gestion des profils invariants est effectuées dans GEPAS

20 Les différentes étapes à appliquer 6. Utilisez GEPAS pour filtrer les profils invariants : => Appliquer par exemple la méthode RMS (seuil = 1.0) 7. Notez le nombre de gènes restants après filtration (toujours travailler sur des copies de matrice lorsque vous filtrez les profils invariants) 8. Utilisez de nouveau les algorithmes d ACP et de k-means Avec les données filtrées pour comparer les groupes/graphiques obtenus. 9. Avec un petit nombre de gènes (inférieur à 1000) il devient raisonnable d appliquer le clustering hiérarchique sur la matrice. 10. Cherchez des corrélations fonctionnelles : SGD, FunSpec, KEGG => Complétez le réseau obtenu hier avec YRR1

21 Les méthodes de regroupement Il n y a pas de méthode universelle Il n y a pas de paramètres universels (distance, première analyse, ) -> La meilleure solution est d utiliser plus qu une seule méthode Si vous ne devez utiliser qu un seul logiciel de regroupement : - Genesis (http://genome.tugraz.at/) - J-express (http://www.ii.uib.no/~bjarted/jexpress/) - MeV (http://www.tigr.org/software/tm4/mev.html) - Libre pour les académiques (théoriquement) - Implémenté en Java - Références publiées dans Bioinformatics Pour mieux comprendre les méthodes de regroupement : Master Thesis d Alexander Sturn, Janvier 2001, 82 pages

22 L annotation fonctionnelle

23 L annotation fonctionnelle des gènes Gene Ontology : Une ontologie est une spécification de concepts qui inclut les relations entre les concepts et qui : -supprime les ambiguïtés - fournit des contraintes sémantiques - créé une compréhension partagée entre l homme et la machine - permet des comparaisons fiables => Création d un ensemble de termes standards

24 GO : Conception hiérarchique des modèles 1 Utilisation de la Gene Ontology : - Utilisation de termes biologiques pour qualifier les résultats de puces à ADN - Utilisation des résultats de puces à ADN pour étendre les bases de connaissances biologiques 2 3

25 GO : des recherches à l aide de mots clefs

26 GO : des recherches à partir de listes de gènes

27 GO : trouver des catégories sur-représentées

28 GO : trouver des catégories sur-représentées

29 GO : trouver des catégories sur-représentées DAG (Directed Acyclic Graph) : Dhcr7 7-dehydrocholesterol reductase Fdft1 farnesyl diphosphate farnesyl transferase Ldlr low density lipoprotein receptor Mvd mevalonate (diphospho) decarboxylase Idi1 isopentenyl-diphosphate delta isomerase Sc4mol sterol-c4-methyl oxidase-like Dhcr24 24-dehydrocholesterol reductase

30 Recherchez des voies métaboliques

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