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Émilie Drapeau
il y a 8 ans
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1 Importance de l Orbitrap pour l analyse protéomique Laurent Geiser 14 ème journées scientifiques du cccta Les Diab lerets, 16 septembre 2010 MS n et masse exacte: l outil incontournable du XXI ème siècle? Structure de la présentation 1. Protéomique par shotgun Buts de l analyse protéomique Intérêts et principes de la protéomiqu e par shotgun 2. Masse exacte et résolution en protéomique Spectres MS issus d e l analyse d un sérum Interprétation des données 3. L Orbitrap comme analyseur MS Intérêts et principes de l Orbitrap Orbitrap: le meilleur an alyseur MS actuellement? 1

2 Structure de la présentation 1. Protéomique par shotgun Buts de l analyse protéomique Intérêts et principes de la protéomiqu e par shotgun 2. Masse exacte et résolution en protéomique Spectres MS issus d e l analyse d un sérum Interprétation des données 3. L Orbitrap comme analyseur MS Intérêts et principes de l Orbitrap Orbitrap: le meilleur an alyseur MS actuellement? Découverte de biomarqueurs potentiels Population référence Population soumise à un toxique Comparaison d es populations Effets du toxique au niveau protéomique Apparition ou disparition de protéines Phosphorylations Apparition ou disparition de modifications post-traductionnelles (PTM) sur les protéin es Augmentation ou diminution de protéin es Alkylations Glycations Autres... Oxydations Acetylations 2

L Orbitrap comme analyseur MS Intérêts et principes de l Orbitrap Orbitrap: le meilleur an alyseur MS actuellement?

3 Analyse protéomique par shotgun (bottom up) MS & MS/MS expérimentaux Dénaturation & digestion des protéines (trypsine) en peptides Séparation LC & détection MS Spectres MS & MS/MS des peptides MS & MS/MS théorique (in silico) Identification automatique des peptides & protéines Protéines dans la base de donnée appropriée (humain, rongeur, ) Digestion théorique en peptides (trypsine) Spectres MS & MS/MS in silico des peptides Principaux intérêts & défis du shotgun Intérêts: vitesse & universalité 1 an alyse => identification d e centaines de protéines Les p eptides sont plus adaptés que les protéines pour la LC-ESI-MS/MS (ionisation par ESI & fragmentation après la MS 1 ) Défis: complexité des matrices réelles Quantité de protéines, et donc de spectres MS/MS expérimentaux & in silico Domaine d e concentrations d es protéines (~ ) 3

& MS/MS in silico des peptides Principaux intérêts & défis du shotgun Intérêts: vitesse & universalité 1 an alyse => identification d e centaines de protéines Les p eptides sont plus adaptés que les

4 Structure de la présentation 1. Protéomique par shotgun Buts de l analyse protéomique Intérêts et principes de la protéomiqu e par shotgun 2. Masse exacte et résolution en protéomique Spectres MS issus d e l analyse d un sérum Interprétation des données 3. L Orbitrap comme analyseur MS Intérêts et principes de l Orbitrap Orbitrap: le meilleur an alyseur MS actuellement? Cas modèle: sérum Sérum: liquide sanguin déb arrassé de ses cellu les et protéin es d e coagulation; surn ageant obtenu après coagulation et centrifugation du sang dan s un tube. Composition du sérum: 90% d eau, protéin es, g lucose, ion s min éraux, Protéines dan s le sérum: ~ g/l de protéines totales, dont ~ 60% d albumine Echantillon pour la protéomique: dilution à ~ 1 g/l de protéines totales, utilisation de 10 µl, soit ~ 10 µg. Digestion sur ~ 10 µg; injection en LC-ESI-MS/MS: ~ µg 4

5 1. LC-ESI-MS: Total Ion Current RT: MS 1 : TIC NL:.26E9 TIC F: FT MS + p NSI Full ms [ ] MS 2010 _04_21 _LAG_ 16 _PTM_LY0_J02_No_ OGE_ Relative Ab undance Time (min) 2. Apport de l exactitude: sélectivité R T: NL: 1. 7E7 m/ z= F: FTM S + p NSI Ful l ms [ ] M S 2010_04 _21_LAG _16_PT M_ LY0_J02_N o_og E_01 R T: NL: 1. 7E7 m/ z= F: FTM S + p NSI Ful l ms [ ] M S 2010_04 _21_LAG _16_PT M_ LY0_J02_N o_og E_ R e l a ti v e A b u n d a n c e Range: Th Exactitude: 9 ppm R e l a ti v e A b u n d a n c e (0.01 Th/ Th) 4 0 (0.1 Th/ Th) Range: Th Exactitude: 90 ppm Tim e (m in) Tim e (m in)

72 6 6.80 2 27.38 61.61 20 1 10 26.01 2. 4 61.97 62.19 71.28 67.3 6 76.0 2.2 0 78.0 2 0.1 6.13 8.26 17.20 22.0 3 80.91 0 0 10 1 20 2 30 3 4 0 4 0 60 6 70 7 80 8 Time (min) 2.

6 3. Apport de la résolution 2010_04 _21_LAG_16_ PTM_ LY0_J02 _No _OGE_01 # RT: AV: 2 NL: 3.9 E8 F: FTMS + p NSI Full m s [ ] R=14 31 z= R=7326 Rela tive Abund ance R=63 4 z= R=923 6 z= R=4 84 z= R= 0877 z= R= 4603 z= R=44936 z= R= m/z z=2 3. Apport de la résolution 2010_04 _21_LAG_16_ PTM_ LY0_J02 _No _OGE_01 # RT: AV: 2 NL: 3.20 E8 F: FTMS + p NSI Full m s [ ] R= 7326 z= R= R=806 1 Rela tive Abund ance R= R= R= R=3 808 Résolution pour une ch arge + Détermination univoque du pic monoisotopique: Th Erreur de 0.2 Th: ~ 400 ppm m/z 6

47 64 R= 4603 z=2 879.74 81 R=44936 z=3 1319.1 184 R=36662 0 0 600 700 8 00 900 1000 1100 12 00 1300 1400 m/z z=2 3.

7 4. Apport de l exactitude et de la résolution MM peptide = Charge * ( Pic monoistopique - Masse proton ) Masse proton: Charge Pic monoisotopique Masse moléculaire du p eptide Th Da Th Da Th Da Th Da Exactitude sur la masse moléculaire d e : < 1 ppm (0.002 Th/ Th) Identification automatique des protéines MS & MS/MS expérimentaux Spectres MS & MS/MS des peptides Identification automatique par EasyProt MS & MS/MS théorique Spectres MS & MS/MS in silico des peptides 7

617 Th 263.220 Da Exactitude sur la masse moléculaire d e 263.221: < 1 ppm (0.

8 Identification de PTMs avec la masse exacte? Identification à partir de 20 acid es amin és d e masses connues EasyProt (Phen yx) Mascot Identification: ~ 20 30% des sp ectres expérimentau x PTMs: modifications de certains acid es aminés décalage en masses Phosphorylations Alkylations Oxydations Glycations Autres... Acetylations Masses exactes + outils bio informatiques adaptés Identification des PTMs? Structure de la présentation 1. Protéomique par shotgun Buts de l analyse protéomique Intérêts et principes de la protéomiqu e par shotgun 2. Masse exacte et résolution en protéomique Spectres MS issus d e l analyse d un sérum Interprétation des données 3. L Orbitrap comme analyseur MS Intérêts et principes de l Orbitrap Orbitrap: le meilleur an alyseur MS actuellement? 8

décalage en masses Phosphorylations Alkylations Oxydations Glycations Autres... Acetylations Masses exactes + outils bio informatiques adaptés Identification des PTMs?

9 LTQ-Orbitrap de Thermo Fisher Scientific Utilisation classique: MS 1 dans l Orbitrap: excellentes exactitude (< ppm) et résolution (~ 0 000) sur la masse des ions parents (= sur le peptide). Fragmentation pour la MS 2 par «data dependent acquisition» des ions parents intéressants: charge, intensité, liste d exclusion dynamique (peptides fragme ntés préalablement), MS 2 dans le LTQ (acquisiti on rapide) ou dans l Orbitrap (exactitude). LTQ-Orbitrap, TOF ou FT-ICR? Orbitrap: exactitude sur > 10 FT-ICR: exactitude sur ~ 10 TOF: exactitude sur ~ 10 2 Thermo Fisher Scientific LTQ-Orbitrap: exactitude sur les masses dan s un domain e de linéarité inégalé par d autres an alyseurs (sauf FT-ICR). LTQ-Orbitrap: instrumentation et mainten ance similaires à des QqQ, TOF ou Ion Trap; san s comp araison avec les contraintes pour un FT-ICR. 9

(acquisiti on rapide) ou dans l Orbitrap (exactitude). LTQ-Orbitrap, TOF ou FT-ICR?

10 LTQ-Orbitrap pour toutes les analyses MS/MS? LTQ-Orbitrap Echantillon s complexes avec un e gamme d yn amique étendue Exactitude & résolution sur les masses Acquisition non continue: in adapté aux analyses ultra-rapides Temps de v ol (TOF) Flexibilité & acquisition en continu Peu ad apté à de larges gammes d ynamiques Triple quadrupole (QqQ) Valid ation quantitative: exactitude & précision en SRM Sensibilité, informations sur les masses en scan Remerciements Fabienne Jeanneret Paola Antinori Denis Hochstrasser Marc Fathi Florent Gluck 10

continue: in adapté aux analyses ultra-rapides Temps de v ol (TOF) Flexibilité & acquisition en continu Peu ad apté à de larges gammes

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