Concept Paper: Quantification de Protéines Spécifiques par SRM/MRM Perspectives d Application et Limitations Actuelles

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1 Direction de l Evaluation des Médicaments Et des produits Biologiques Département de toxicologie Chef de département : D. Masset Secrétaire scientifique : A. Sanh Concept Paper: Quantification de Protéines Spécifiques par SRM/MRM Perspectives d Application et Limitations Actuelles Concept Paper, Version 1, 09 janvier 2012 Document préparé par le Groupe de Travail «Innovation non Clinique» Coordinateur de la Rédaction o P. LESCUYER Président o J.-R. CLAUDE Membres o L. DOMENJOUD o E. FATTAL o J. GUILLEMAIN o A. GUILLOUZO o S. LE CROM o A. LE PAPE o S. LERONDEL o P. LESCUYER o B. MAILLERE o F. MOREL o M. PALLARDY o C. PINEAU o T. RABILLOUD o R. RAHMANI Expert Invité o D. MARZIN Représentants de l Afssaps invités o D. ABDON o D. SAUVAIRE 1

2 Quantification de protéines spécifiques par SRM/MRM : perspectives d applications et limitations actuelles Version 1 1. Objet : La spectrométrie de masse est une technique essentielle pour l étude des protéines. De nombreuses méthodes de spectrométrie de masse ont été ainsi développées pour l identification et la quantification des protéines dans les milieux biologiques, pour la détermination de leur structure, pour la caractérisation des modifications post-traductionnelles, pour l étude des interactions entre protéines ou avec d autres types de molécules. Ces méthodes sont basées sur l utilisation d une grande variété de spectromètres de masse et de protocoles analytiques dont la description dépasse le champ de ce document [1, 2]. Dans ce domaine de l analyse protéomique, d importants progrès ont été réalisés au cours des dernières années : accès de nombreux laboratoires à une gamme de plus en plus large de spectromètres de masse très performants ; mise au point de méthodes d analyses sensibles et fiables pour l identification et la quantification des protéines ; et développement d outils bioinformatiques pour l analyse de données dont la taille est sans cesse croissante. Grâce à ces progrès, l analyse protéomique offre des perspectives nouvelles pour le décryptage de systèmes biologiques complexes, la compréhension de processus physiopathologiques et l identification et la validation de nouveaux biomarqueurs de pathologies [3-5]. Un signe de la maturité croissante des méthodes d analyse protéomique est le besoin d établir des recommandations et des guides de bonne pratique [6-8] (http://www.hupo.org/research/psi/). Dans ce contexte, le développement de méthodes de spectrométrie de masse de type «selected reaction monitoring» permettant de quantifier des protéines cibles de manière sensible et spécifique offre la perspective d utiliser l approche protéomique non plus pour les applications habituelles d analyse à large échelle mais pour la mesure de biomarqueurs spécifiques dans le cadre de procédures diagnostiques, pronostiques ou de suivi thérapeutique. De telles applications concernent la médecine de laboratoire mais aussi l industrie pharmaceutique pour le développement et l évaluation de nouveaux médicaments. L objet de ce document est de présenter ces méthodes de quantification de protéines cibles basées sur la 2

3 spectrométrie de masse, de discuter de leurs limites actuelles et donc de définir leur champ d application potentiel, en particulier comme alternative aux tests d immunoanalyse quantitatifs. Les méthodes de quantification de protéines par spectrométrie de masse offrent en effet l avantage de ne pas dépendre du développement d anticorps de haute affinité. Lorsque de tels anticorps sont indisponibles pour un biomarqueur donné, la mise au point d une méthode de quantification par spectrométrie de masse est généralement plus facile, plus rapide et d un coût moindre que pour un immunodosage de type ELISA. De plus, un spectromètre de masse constitue une plateforme analytique de grande polyvalence et qui permet en conséquence de réaliser très facilement des tests multiplex. Enfin, comparées aux tests d immunoanalyse, les méthodes SRM offrent aussi la possibilité de caractériser plus aisément de petites variations de structure des protéines telles que des mutations ponctuelles ou des modifications post-traductionnelles. 2. Quantification de protéines spécifiques par spectrométrie de masse : La méthode de «selected reaction monitoring» (SRM) ou «multiple reaction monitoring» (MRM) est une technique de spectrométrie de masse permettant de quantifier une ou plusieurs molécules cibles dans un échantillon biologique complexe. Les méthodes SRM sont depuis de nombreuses années des méthodes de référence pour l analyse quantitative des petites molécules, en particulier les médicaments et leurs métabolites. Avec le développement récent de spectromètres de masse capables de détecter de plus grandes molécules, cette technique devient applicable aux peptides et donc aux protéines après digestion enzymatique (typiquement par la trypsine) ou chimique. Ce type d analyse est classiquement effectué avec un spectromètre de masse de type «triple quadrupole» ou «Quadrupole-Trap» couplé à un système de chromatographie liquide haute performance (HPLC). Un spectromètre de masse mesure le rapport masse/charge (m/z) de molécules ionisées. Dans le cas des méthodes SRM, l analyse inclut deux étapes de sélection d ions de m/z prédéfinis. Lors de la première étape, un ion précurseur de m/z prédéfini est sélectionné dans le premier quadrupole de l instrument Cet ion est ensuite fragmenté dans le second quadrupole par collision avec un gaz. Enfin, un fragment spécifique de l ion précurseur, de m/z prédéfini, est sélectionné dans le troisième quadrupole (Figure 1). C est l intensité du signal généré par ce fragment qui est utilisée pour la quantification de la molécule analysée. 3

4 Figure 1 : principe de l analyse SRM La spécificité analytique de la méthode SRM est conférée par la combinaison de la valeur de m/z de la molécule à doser (précurseur) et de la valeur de m/z du fragment. L ensemble de ces deux paramètres, censés être spécifiques de la molécule à doser, est appelé une transition. Ces valeurs doivent être définies avant l analyse et sont utilisées pour paramétrer le spectromètre de masse. Le choix des transitions pour une protéine cible peut être effectué à l aide de logiciels dédiés [9, 10] ou en utilisant des bases de données mises à disposition de la communauté scientifique (http://www.srmatlas.org/). Pour l analyse des protéines, l analyse de plusieurs transitions, correspondants à différents peptides de la même protéine, permet d augmenter la spécificité analytique. De plus, l utilisation d une étape de séparation chromatographique en amont de l analyseur permet d améliorer la sensibilité analytique de la méthode en décompléxifiant le mélange peptidique mais également d augmenter la spécificité pour un peptide donné en ajoutant le temps de rétention chromatographique comme paramètre de sélection. La concentration absolue d une protéine peut être mesurée en utilisant un standard interne marqué avec un isotope lourd [11]. Au rebours des méthodes classiques de protéomique, où le spectromètre de masse est programmé pour analyser le plus grand nombre possible de peptides, les méthodes SRM utilisent donc le spectromètre de masse comme un filtre, avec des valeurs préprogrammées qui, combinées à d autres valeurs connues comme le temps de rétention chromatographique, permettent d identifier et de quantifier de 4

5 façon univoque un peptide donné (et donc par inférence une protéine donnée) dans un mélange complexe. 3. Perspectives d applications : L intérêt des méthodes SRM pour l analyse quantitative de biomarqueurs protéiques est qu elles représentent une alternative potentielle aux méthodes d'immunoanalyse classiques, en combinant spécificité analytique et fiabilité de la mesure de la concentration [12]. De plus, elles offrent l avantage par rapport aux méthodes d'immunoanalyse classiques de pouvoir réaliser très facilement, grâce à la séparation chromatographique, une batterie de tests sur le même instrument lors d un même processus analytique (analyse multiplex) [13]. Cette perspective d analyse multiplex est particulièrement intéressante pour le suivi de biomarqueurs représentant différents critères d évaluation (pharmacocinétiques, pharmacologiques ou toxicologiques) d un médicament Mesure de protéines par SRM dans les liquides biologiques : Plusieurs études ont démontré qu il était possible de quantifier des protéines d intérêt clinique présentes dans le plasma à des concentrations de l ordre du gramme au microgramme par litre avec des méthodes combinant digestion tryptique, HPLC et SRM et en utilisant des peptides standards marqués avec un isotope lourd, [11, 14-16]. Il faut noter que la majorité de ces protocoles inclut une étape d immunodéplétion visant à éliminer les protéines majoritaires du sérum. Un exemple typique de ce type d approches est le dosage de biomarqueurs de souffrance cardiaque, comme le NT-proBNP, la troponine I et la troponine T, dans le plasma humain [17]. Pour atteindre une sensibilité supérieure et pouvoir mesurer des concentrations de protéines de l ordre du nanogramme par litre, il est nécessaire de rajouter une étape d enrichissement des peptides cibles par immunoaffinité avant l analyse par LC-MS/MS [18, 19]. De telles méthodes, combinant immunoenrichissement des peptides et SRM, ont été développées pour différentes protéines classiquement mesurées par immunodosage dans les laboratoires médicaux : la troponine I [20], l antigène spécifique de la prostate (PSA), un biomarqueur de l inflammation et du cancer de la prostate [21], ou la thyroglobuline utilisée pour le suivi des cancers de la thyroïde [22]. Des travaux récents, combinant immunocapture 5

6 de peptides et analyse SRM pour la quantification de la parathormone (PTH) intacte et de certains de ses produits de clivage, ont montré que ce type de techniques pouvait approcher le niveau de performance analytique des immunodosages utilisés en routine par les laboratoires d analyses médicales [23, 24]. Il faut toutefois noter, qu à ce jour, le seul exemple de méthode SRM réellement développée et validée dans une perspective d application en routine pour la médecine de laboratoire concerne des protéines présentes dans le plasma à des concentrations de l ordre du gramme par litre, les apolipoprotéines A1 et B [25]. De nombreuses applications de ces méthodes SRM sont susceptibles d intéresser la recherche biomédicale et l industrie pharmaceutique. La première est la mesure de biomarqueurs sanguins dans le cadre d études cliniques chez l homme pour suivre l évolution d une pathologie ou évaluer l efficacité d un médicament. Bien entendu, la même chose est applicable chez l animal pour des études pharmacocinétiques, pharmacologiques ou toxicologiques. Des méthodes SRM ont ainsi été décrites pour doser dans le sérum de rat le propeptide N-terminal du procollagène de type I (P1NP), un biomarqueur de la formation osseuse [26], ou la myosin light chain 1, un biomarqueur de nécrose cardiaque [27]. Les méthodes SRM peuvent aussi être utilisées dans les processus de découverte de biomarqueurs car elles représentent une alternative intéressante aux immunoessais pour la vérification et la sélection des protéines candidates [28]. En effet, même si les dosages SRM n atteignent pas encore la robustesse des méthodes d immunoanalyse (voir section 4), le développement d un test SRM pour le criblage initial d une protéine candidate est nettement plus simple et plus rapide que le développement d un test d immunoanalyse. Un autre avantage apporté notamment par l utilisation de la spectrométrie de masse est la possibilité d analyser dans le même test plusieurs variants d une même protéine [29]. Enfin, ce type de méthode peut aussi être utilisé pour la mesure de protéines thérapeutiques comme l érythropoïétine [30] Mesure de protéines par SRM dans les tissus : L analyse SRM peut être réalisée sans problème sur des extraits cellulaires ou tissulaires. De nombreux travaux ont été publiés décrivant la mesure de protéines spécifiques [31-33] ou ciblant des modifications post-traductionnelles [34]. Cette approche a aussi été appliquée à des cellules collectées par microdissection laser de coupe de tissus congelés [35]. 6

7 Un nouveau champ d applications des méthodes SRM a récemment été ouvert par le développement de protocoles permettant de réaliser des analyses protéomiques à partir de tissus fixés au formaldéhyde et enrobés de paraffine (FFPE-«Formaldehyde fixed and paraffin embedded») [36, 37]. En effet, ceci offre la possibilité de réaliser des mesures quantitatives de protéines par spectrométrie de masse dans de vastes collections de tissus conservés dans les hôpitaux du monde entier. L intérêt majeur étant que ces prélèvements sont généralement associés à des registres cliniques détaillés sur l histoire médicale du patient (résultats d examens cliniques et biologiques, traitements reçus, effets secondaires éventuels, etc). Le dosage de protéines tissulaires par SRM dans des tissus FFPE ouvre donc de nombreuses perspectives pour l étude de processus pathophysiologiques ou des réponses cellulaires à un traitement donné [37-39]. 4. Limitations à considérer pour la quantification de protéines par SRM : La perspective d application de méthodes de dosage des protéines par SRM pour évaluer les effets thérapeutique ou toxiques de médicaments, dans le cadre d études cliniques ou sur des modèles animaux, impose d évaluer précisément et objectivement les limitations actuelles de ces méthodes. Ceci est d autant plus important qu au delà des démonstrations technologiques, le recul en terme d applications est encore faible. 4.1 Facteurs préanalytiques : Un premier point crucial concerne la capacité à identifier et à contrôler les facteurs préanalytiques : conditions de prélèvement, de préparation, de transport et de stockage des échantillons biologiques [40]. Cette question n est pas spécifique aux méthodes SRM mais elle est particulièrement difficile à résoudre dans le contexte des méthodes protéomiques du fait de la complexité des protocoles analytiques et de la mesure simultanée de multiples analytes [41, 42]. Deux facteurs préanalytiques sont particulièrement critiques pour les analyses SRM : l étape de digestion par la trypsine et la possible dégradation par des protéases endogènes des peptides à analyser et/ou des peptides marqués utilisés comme standards [44-46]. Le rendement de la digestion tryptique peut en effet être fortement influencé par la présence d agents dénaturants, de solvants, la température de la réaction ou la durée de la digestion [43]. Le problème est que les conditions optimales de digestion 7

8 peuvent être très différentes selon les protéines mais aussi pour différents peptides d une même protéine [25, 43]. De plus, pour des conditions de digestion fixées, le rendement de production d un peptide peut varier entre des échantillons de plasma provenant de différents patients [25]. De la même manière, il a été montré que les peptides générés par digestion tryptique ou introduits comme standards internes peuvent être dégradés avant l analyse MS et que la sensibilité à l action des peptidases endogènes varie selon les peptides [44-46]. De plus, comme pour la digestion à la trypsine, l importance de ce phénomène peut être très variable entre les échantillons de différents patients [45]. Lors du développement d un test SRM, il est donc indispensable d évaluer ces deux paramètres et de les prendre en compte dans le choix des peptides cibles. Il est à noter que des procédures visant à maitriser les facteurs préanalytiques en protéomique ont été proposées [47, 48] mais il est très difficile, sinon impossible, d arriver à une parfaite standardisation des procédures de collecte, de transport et de stockage des échantillons biologiques, notamment dans le contexte d études cliniques sur des patients. 4.2 Complexité des protocoles analytiques : La seconde problématique est liée à la grande complexité de la plupart des méthodes de dosage de protéines par SRM. En effet, les étapes de préparation de l échantillon protéique, avant de commencer l analyse sur le spectromètre de masse, incluent notamment la déplétion de protéines plasmatiques très abondantes, l enrichissement par immunoaffinité des peptides cibles, des méthodes de fractionnement des mélanges protéiques et/ou peptidiques pour diminuer leur complexité et la digestion des protéines par la trypsine ou d autres enzymes protéolytiques. Cette complexité peut être une source majeure de variabilité analytique. De plus, la plupart des protocoles utilisent des systèmes HPLC nanoflow ( 1 µl/min) pour améliorer la sensibilité de l analyse. Malheureusement, ce type de systèmes, de par leur robustesse limitée et leur complexité de mise en œuvre, n est pas vraiment adapté à une utilisation en routine dans un laboratoire de production sur de grandes séries d échantillons. La fiabilité étant un élément essentiel dans ce type d applications, le développement de méthodes SRM basées sur des systèmes HPLC conventionnels (débit 400 µl/min) est préférable [25, 49]. Ces questions sont très importantes car la réalisation d études cliniques pour l évaluation d un produit thérapeutique impose de garantir la reproductibilité des résultats sur une longue 8

9 période. La fiabilité, la stabilité et la reproductibilité de la méthode analytique, incluant la préparation de l échantillon, les étapes de fractionnement, l analyse MS et l analyse bioinformatique, doivent donc être garanties. Plus généralement, cette complexité, avec la variabilité analytique qui peut en découler, est un obstacle à la standardisation et à la transférabilité des méthodes entre laboratoires. Sur ce plan, l analyse protéomique est encore très loin des standards de la médecine de laboratoire qui impliquent le développement de méthodes de référence, la standardisation des résultats et l utilisation de programmes nationaux et internationaux de contrôle de qualité externe pour évaluer la fiabilité des procédures analytiques [50]. L utilisation de méthodes d analyse protéomique, dont la SRM, pour la mesure de biomarqueurs lors d études cliniques ou dans le cadre du développement de nouveaux médicaments nécessite encore de progresser dans ce domaine [51]. Différentes initiatives ont été lancées récemment pour évaluer la reproductibilité inter-laboratoires de méthodes d analyse protéomique par spectrométrie de masse mais certains des résultats obtenus soulignent la difficulté de la tâche [52-55]. Un parfait exemple est l évaluation de la reproductibilité inter-laboratoires de dosages de protéines dans le plasma par SRM [53]. Les résultats de cette étude montrent en effet que l imprécision de l analyse SRM est directement liée à la complexité du processus analytique. Les coefficients de variation inter-laboratoires obtenus dans cette étude pour les différentes protéines analysées sont corrects quand l analyse LC-MS/MS est la seule source de variabilité : 8-14% à 46 nmol/l et 6-13% à 2.9 nmol/l, près de la limite de détection. Par contre, lorsque l ensemble du processus de préparation de l échantillon, y compris la digestion par la trypsine, est réalisé par différents laboratoires, ces coefficients de variation montent à des valeurs qui ne sont pas acceptables pour des études cliniques : 20-39% à 46 nmol/l et 22-60% à 2.9 nmol/l, près de la limite de détection [56]. 4.3 Analyse LC-MS/MS : Enfin, certaines limitations de l analyse des protéines par SRM sont inhérentes aux méthodes LC-MS/MS elles-mêmes [57]. Certains auteurs ont également pointé plusieurs facteurs, tels que l inexactitude de mesure des instruments MS et la complexité des échantillons protéiques, qui peuvent potentiellement affecter la spécificité analytique des méthodes SRM [58, 59]. Ces problèmes peuvent être sous- 9

10 estimés lors du développement et de l évaluation de la méthode sur de petites séries d échantillons sélectionnés et la question est de savoir quel niveau de sensibilité et de spécificité analytique peut être obtenu quand ce type de méthodes est appliqué en routine, dans la durée, sur des échantillons biologiques complexes humains ou animaux. 5. Conclusions : L intérêt des méthodes SRM/MRM pour la quantification de protéines spécifiques a été démontré par le développement de nombreux protocoles permettant le dosage de biomarqueurs dans les liquides biologiques ou les tissus. Cependant, l évaluation de ces processus analytiques complexes dans le contexte d études cliniques reste à faire. En effet, la maturité apparaît encore insuffisante pour pouvoir concurrencer les tests d immunoanalyse traditionnels dans le cadre d une utilisation en routine sur de très grandes séries d échantillons. Du fait de leurs limitations actuelles, l application de choix de ces techniques est probablement la sélection initiale de biomarqueurs protéiques issus d expériences «omics» [60]. Il s agit dans ce cas de vérifier les données d expression d un grand nombre de protéines, sur un nombre relativement limité d échantillons ( ). Les limitations en terme de robustesse et de standardisation sont alors moins critiques. Pour ce type d applications, l analyse SRM peut, de plus, être combinée avec des méthodes d immunocapture utilisant des anticorps d affinité moyenne, et donc relativement aisés à obtenir, pour améliorer la sensibilité analytique [60]. D autre part, les méthodes SRM/MRM permettent, plus facilement que les tests d immunoanalyse, l analyse de petites variations de structure des protéines de type mutations ponctuelles ou modifications post-traductionnelles. Elles ouvrent ainsi la porte à l investigation de nouveaux types de biomarqueurs protéiques [61-63]. Mais quelque soit l application considérée, il est indispensable lors de développement de nouveaux dosages de protéines par SRM de prendre en compte l ensemble des paramètres pouvant influencer la précision et l exactitude de la méthode et de réaliser toutes les validations analytiques nécessaires. 10

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