Galan Briceño Juana, Bonvin Grégoire, Origa Magali, Osini Stéphanie

Transcription

1 ANALYSE DE PROTEINES DANS LA LEVURE. I. But : Le but de ce TP est l analyse quantitative d une protéine de levure, l hexokinase, qui joue un rôle essentiel dans le mécanisme de la glycolyse. Nous utiliserons pour ce faire des techniques couramment utilisées pour ce type d analyses. II. Introduction partie théorique : L analyse d une protéine en particulier demande un certain nombre de manipulations dont les principes, découlant de techniques mises au point il y a de ça plusieurs décennies, sont restées pratiquement inchangées. La première étape, l extraction des protéines, se fait en lysant les levures par un moyen mécanique (billes de verres) tout en préservant les protéines de la dégradation, puis en isolant les protéines en les précipitant. Les concentrations des protéines des échantillons ainsi obtenues peuvent être déterminées par la méthode de Lowry, une méthode ancienne et encore largement utilisée car elle est très sensible et assez constante d une protéine à une autre. Cette méthode a pour principe le fait que sous conditions alcalines, les ions Cu 2+ forment un complexe avec les liaisons peptidiques des protéines, ce qui permet la liaison du réactif de Folin-Ciocalteus sur les protéines. Cette liaison est réduite en hétéropolymobyldène bleu par l oxydation catalysée par le cuivre des acides aromatiques. Cette réaction provoque un changement de couleur de jaune à bleu qui peut être mesurée par un spectrophotomètre. Ainsi, on peut déterminer la concentration des protéines en solution dans un échantillon donné en se basant sur une courbe étalon faite à partir d un standard de BSA (bovine serum albumin). Des résultats plus précis peuvent être obtenu en faisant une courbe standard pour la protéine d intérêt mais ce n est pas toujours possible. Puis, la séparation des protéines selon leur poids moléculaire est typiquement réalisée par la méthode de SDS-PAGE. Le SDS est un détergent ionique qui établit en présence de protéines de fortes liaisons hydrophobes avec toutes les chaînes polypeptidiques, formant des complexes caractérisés par un rapport constant SDS:protéines (environ 1,4:1 en masse) de la forme de bâtonnets (à la condition que les éventuels ponts disulfures aient été préalablement réduit, par du 2- mercaptoéthanol par exemple). A ph neutre ou alcalin, le détergent est chargé négativement et les sous-unités dénaturées possèdent toutes la même densité de charge. Lors de l application d une tension électrique à un gel de polyacrylamide contenant du SDS et des échantillons de protéines, la vitesse de migration de ces dernières ne sera fonction que de leurs tailles respectives (telles qu elles interagiront avec la porosité du gel). On évalue le poids moléculaire de chaque espèce en comparant sa migration à celle de chaîne polypeptidique étalons placées dans le même gel. Finalement, la technique de western blotting (aussi appelé immunotransfert) permet d identifier des protéines après transfert du résultat du gel SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose par réaction avec les anticorps 1

2 appropriés. Les anticorps dits primaires sont spécifiques pour telle ou telle protéine transférée, alors que les anticorps dits secondaires sont dirigés contre la région constante des anticorps primaire. De plus, les anticorps secondaires sont couplés à une enzyme comme l horseradish peroxydase (HRP), qui catalyse l oxydation du luminol en conditions alcaline. Ainsi excité, le luminol revient à son état fondamental en émettant une fluorescence qui est détectée par une courte exposition sur un film autoradiographique. III. Résultats : Purification et détermination de la quantité de protéines dans nos échantillons : Après purification de nos protéines, nous avons obtenus trois tubes : deux contenants l extrait brut (= «crude extract», séparé dans les deux tubes) et un contenant le culot obtenu après les dernières centrifugation. On a ensuite préparé 2*10 échantillons (duplicata) pour la détermination de la concentration de protéines dans nos échantillons d extrait brut. Les sept premiers tubes contenaient nos concentrations étalons de protéines BSA et les trois derniers (tubes 8, 9 et 10) contenaient différents volumes de nos échantillons venant d un de nos tubes d extrait brut. Puis on a mesuré l absorbance de nos deux séries de duplicata avant de tracer le graphe de l absorbance A 750 en fonction de la concentration en protéines (en µg/µl) ( voir graphe, page annexe 1) en prenant les moyennes des deux valeurs obtenues à chaque duplicata de 1 à 7, sauf pour les points 4 et 6 car leurs valeurs divergeaient trop. On trace ensuite une droite de régression en ignorant les dernières valeurs qui s éloignent de la linéarité (limites de la loi de Lambert-Beer) et on se sert de cette droite pour obtenir les concentrations des tubes 8 à 10 à partir de leur absorbance. table des absorbances tubes BSA µl / / / protein extract µl / / / / / / / NS solution µl / A750 nm 1er A750 nm 2ème moyenne Pour le tube 8, on a ainsi une concentration de 0.59µg/µL, ce qui correspond à : 0.59µg/µL * 10µL = 5.9µg de protéines dans notre échantillon. Pour le tube 9, on a ainsi une concentration de 0.84µg/µL, ce qui correspond à : 0.84µg/µL * 20µL = 16.8µg de protéines dans notre échantillon. La valeur d absorbance du tube 10 étant très grande, on peut considérer qu on est au-delà des limites de la loi de Lambert-Beer et on n en tient pas compte. 2

3 Pour les calculs suivants on a pris comme valeur celle du tube 8, la plus appropriée car au milieu de nos valeurs standard. C'est-à-dire qu on estime avoir 5.9µg de protéines dans notre échantillon. SDS-PAGE et rouge Ponceau : 15 échantillons sont préparés selon la «tableau pour charger les gels» tableau pour charger les gels sample volume µl sample buffer µl 1 sample buffer x molecular weight stand yeast extract 0.5 µg yeast extract 1.0 µg yeast extract 2.0 µg yeast extract 4.0 µg yeast extract 8.0 µg 20.8 / 8 pellet 20.8 / 9 molecular weight stand purified yeast hexokin ng purified yeast hexokin ng purified yeast hexokin. 25 ng purified yeast hexokin. 50 ng purified yeast hexokin. 100 ng sample buffer x Ces solutions sont chargées sur le gel SDS. A la suite de l électrophorèse sur gel SDS-PAGE, le gel est coloré avec du rouge ponceau pour mettre en évidence la présence de protéines puis est rapidement photocopié ( c.f photocopie du gel SDS-PAGE révélé au rouge Ponceau, page annexe 2). Cette photocopie sert principalement de repère pour la suite des opérations, et permet également de vérifier que la migration a bien fonctionné (mais étant donné que nos standards de poids moléculaires sont déjà colorés, cette étape a surtout lieu juste pour la forme ). Western blotting : La révélation des protéines par le luminol puis la photographie de notre gel après transfert sur nitrocellulose nous permet de déterminer le poids moléculaire de l hexokinase ainsi que la quantité d hexokinase dans notre extrait de levure ( c.f film autoradiographique page annexe 3). Pour rappel et selon le tableau préparé pour charger les gels: Les colonnes n 2 et n 9 représentent les molecular weight sandard. Les colonnes n 3 à n 7 représentent différentes quantités d extrait de levure, la n 8 est notre culot et les colonnes n 10 à 14 représentent différentes quantités d hexokinase purifié. 3

4 Poids moléculaires standard (n 2 et 9 ): On calcule à partir de la ligne du haut (c.f annexe 4), le nombre de millimètres jusqu aux protéines standard dont le poids moléculaire est déjà déterminé (c.f p.16 protocole). Ceci nous permet de tracer sur un graphique logarithmique une droite. Puis pour déterminer le poids moléculaire de l hexokinase, on mesure le nombre de millimètre jusqu a l hexokinase (colonne n 11) et on y reporte sur notre graphique. D après nos résultats le poids moléculaires de l hexokinase est de 45 kda (c.f graphique poids moléculaire de l hexokinase page annexe 4). Selon la théorie, le poids moléculaire de l hexokinase est de 49 kda. Culot (n 8) : la photographie nous montre qu il reste de l hexokinase dans notre culot. Les protéines n ont donc pas été extraites de façon optimale. Quantité d hexokinase dans un extrait de levure : Selon les intensités des colonnes n 3 à 7 comparées à celles des colonnes n 10 à 14, on détermine 50 ng d hexokinase (n 13) dans 2 µg d extrait de levure (n 5). IV. Réponses aux questions 1. Quantité d extrait de levure choisie : 2 µg Quantité d hexokinase purifiée choisie : 50 ng Concentration de protéine dans 1ml d extrait de levure : 5.9 µg/ µl = 5900 µg /ml 0. 5[ µ g] 5900[ µ g / ml] = 1475[ ug / ml] = [ mg / ml] 2[ µ g] 2. 1DO 600 = 1.2*10 7 cellules/ml 10.6 DO 600 = 1.3*10 8 cellules/ml Quantité d hexokinase par cellule levure : 1475[ g / ml] = [ cellules / ml] µ 5 [ µ g / cellules] Quantité totale de protéines Concentration de protéine dans 1ml d extrait de levure : 5.9 µg/ µl Volume prélevé : 0.5 ml = 500 µl 5. 9[ µ g / µ L] 500[ µ L] = 2950[ µ g] 3. masse d hexokinase par cellule : µg / cellules Masse de protéine:2950 µg [ µ g / cellules] 7 % hexokinase par protéines totales : 100 = 4 10 % µ 2950[ 4. poids moléculaire hexokinase= 45 kda Pour 1.16*10-11 g d hexokinase par cellule on a : * [ g ]* = molécules d hexokinase par cellules. g] 4

5 5. Il existe d autres moyens physiques (préférables à des moyens chimiques qui pourraient ensuite s attaquer aux composants de la cellule) pour désintégrer la membrane plasmique des levures, comme la sonication d une suspension de cellules par des ultrasons. On peut aussi déchirer les membranes dans un homogénéiseur sous pression qui lamine les cellules en les poussant dans l interstice étroit formé entre un piston et la paroi de son cylindre. Parfois, on profite du flux osmotique pour faire éclater les cellules ; il suffit de les suspendre dans une solution hypotonique, c'est-à-dire dont la concentration saline est inférieure à celle du milieu extérieur, car la membrane plasmique est tout à fait perméable à l eau mais peu aux sels et autres molécules les solutés du cytosol. L eau passe donc de sa solution diluée extracellulaire à la solution de concentration normale (isotonique) intracellulaire, provoquant le gonflement puis l éclatement de la cellule. 6. Le TCA aide à précipiter les protéines afin des les isoler du reste des composants. L acétone élimine l excès de TCA pour que la suspension ait lieu et qu ainsi les protéines se redissolvent. 7. La méthode de Lowry est basée sur la réduction du Cu 2+ en Cu +, puis le Cu + est utilisé pour réduire le réactif de Folin. Cette méthode est sensible à l EDTA, le DTT, le β-mercapto, l'hepes, le Tris, le triton X-100, le NP-40. Un réactif capable de réagir avec le Cu + empêcherait ce dernier de réagir avec le réactif de Folin. D autres méthodes peuvent être utilisées : Bradford, biuret. [3] 8. Le bleu de Coomassie est un révélateur utilisé dans l électrofocalisation à la place du SDS. Cette méthode est appelée blue native electrophoresis.[3] 9. L électrofocalisation basée sur les proportions respectives des protéines en résidus acides ou basiques permet également de les séparer. Chaque protéine migrera jusqu au ph ou sa charge globale est égale à 0 c'est-à-dire jusqu à son point isoélectrique. 10. Les protéines collées à la membrane de nitrocellulose par interactions hydrophobes sont beaucoup plus accessibles et plus stables. 11. L analyse du culot permet de vérifier si il contient toujours de l hexokinase. V. Discussion L expérience s est bien passée, nous avons pu déterminer la proportion d hexokinase dans notre extrait de levure ainsi que son poids moléculaire. Cette expérience nous a permis de comprendre l électrophorèse sur gel SDS-page ainsi que le Western blotting d un point de vue pratique. 5

6 Bibliographie : [1] Aide-mémoire de biochimie et de biologie moléculaire, 2 ième édition, Wildmer et Beffa, Editions TEC & DOC, p230, 267 [2] Biologie moléculaire de la cellule, Lodish & cie, traduction de la troisième édition, DeBeock Université, p92-94, 164 [3] 6