Applications des lasers impulsionnels en biologie : génération de contraste et résolution

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1 Applications des lasers impulsionnels en biologie : génération de contraste et résolution Pierre-François Lenne et Hervé Rigneault Institut Fresnel CNRS/ Université Aix-Marseille III 1- Introduction L utilisation des lasers impulsionnels ne se cantonne plus aujourd hui aux seuls laboratoires spécialisés en optique mais se répand de plus en plus dans les laboratoires de biologie pour des applications en microscopie. Le but de ce chapitre est de présenter les atouts des sources lasers impulsionnelles en microcopie non-linéaire pour le vivant. En prenant quelques exemples précis, nous montrerons que les sources picosecondes et femtosecondes offrent la possibilité de générer des contrastes utiles à la compréhension des mécanismes du vivant et permettent d atteindre des résolutions sub-longueur d onde. Les exemples seront choisis dans la littérature ou issus de nos propres travaux. La première partie sera consacrée à l imagerie de fluorescence excitée par l absorption de deux photons. Nous y présenterons quelques notions de base de microscopie. Dans la seconde partie, nous expliquerons comment les volumes d observation peuvent être réduits audessous de la limite de diffraction en utilisant des non-linéarités entre champ excitateur et émission de fluorescence; nous prendrons l exemple de la microscopie utilisant la déplétion de la fluorescence par émission stimulée (Microscopie STED). Enfin, dans une dernière partie, nous présenterons une méthode d imagerie vibrationnelle non-linéaire : la microscopie par effets Raman stimulés (CARS : Coherent Anti-Stokes Raman Scattering). Abréviations MP : Microscopie de fluorescence excitée par l absorption de Deux Photons MMP : Microscopie de fluorescence excitée par l absorption de M Photons STED : Déplétion par émission stimulée Stimulated Emission Depletion CARS: Coherent Anti-stokes Raman Scattering F-CARS: Signal CARS émis vers l avant (Forward) E-CARS: Signal CARS émis vers l arrière (Epi) - Microscopie de fluorescence excitée par l absorption de photons Excitation de fluorescence à P et 1P La MP est une microscopie par balayage laser utilisant une excitation localisée non-linéaire pour exciter uniquement un à un les «pixels» de la trame. Proposée il y a une quinzaine d années (Denk, Strickler et al. 1990), la MP est à présent utilisée en particulier pour imager des tissus épais et des animaux vivants (pour une revue voir (Zipfel, Williams et al. 003)). La microscopie de fluorescence excitée par l absorption de 3 photons (M3P) peut être aussi utilisée pour l imagerie. L absorption de P par une molécule peut produire une excitation équivalente à celle produite par l absorption d 1P, dès lors que la somme des énergies des P est égale à l énergie du photon unique. Si la molécule est fluorescente, elle peut émettre un seul photon de fluorescence comme dans le cas de l excitation par un photon unique de plus grande énergie. Dans une représentation dans l espace des énergies suivant le diagramme de Jablonski, le faisceau excitateur est absorbé

2 et peuple des niveaux électroniques supérieurs S1 à partir desquels se produit la fluorescence (Figure 1 A-B). On appelle décalage de Stokes le décalage spectral qui existe entre les maxima de la courbe d absorption à 1P et celle d émission (Figure 1 C). E U.A. S 1 S 1 Absorption Emission nm S 0 S (A) (B) (C) Figure 1 : Diagramme de Jablonski représentant le processus de fluorescence à 1 photon (A) et à photons (B). (C) Spectres d absorption à 1P et d émission typique d un fluorophore. L émission de fluorescence dépend quadratiquement de l intensité d excitation dans le processus à P alors qu elle en dépend linéairement à 1P. Cette dépendance quadratique de la fluorescence en fonction de l excitation est l origine de l effet de localisation de l excitation. Dans le processus par absorption d un seul photon, la fluorescence n est pas seulement excitée au point de focalisation mais dans toute la zone d interaction entre le faisceau excitateur et l échantillon contenant les molécules fluorescentes (fluorophores) (Figure ). Une technique largement utilisée pour limiter le volume de collection de fluorescence (zone de netteté) à 1P consiste à placer un trou devant le détecteur (Figure -B). Ce montage dit confocal interdit aux rayons provenant de fluorophores situés en dehors de la zone de netteté d atteindre le détecteur. Dans le cas de la MP, ce trou confocal est inutile puisque la fluorescence n est produite efficacement qu au point de focalisation. Détecteur Trou laser excitateur Fluorescence échantillon Figure : (A) Fluorescence à 1 photon (haut) et à photons (bas-flèche) (selon le site de Bio-Rad : (B) Montage de microscopie confocale, dans le cas d une fluorescence à photons, le trou confocal est inutile. Un laser continu focalisé ne permet pas d effectuer de MP. Pour s en convaincre, donnons quelques ordres de grandeur : en MP, un laser continu d 1mW focalisé par un objectif de grande ouverture numérique (NA) dans un échantillon de fluorescéine à une concentration de 10 µm ne produira qu environ photons/s. En considérant une efficacité de détection de 5%, l intensité détectée sera de 1000 photons/s. Sachant que le temps d intégration par pixel est typiquement 1 µs, 10-3 photons seront détectés en moyenne par pixel. L utilisation de sources impulsionnelles est nécessaire pour augmenter la probabilité d excitation à P, tout en conservant une puissance moyenne faible. Avec un laser impusionnel, la fluorescence à photons dépend de la moyenne du carré de l intensité d excitation <I (t)> et non du carré de la moyenne <I(t)>. L intensité de fluorescence moyenne est égale au produit du nombre d impulsions par seconde (R) par l intensité intégrée durant une impulsion, ce qui conduit à : I( t) = g I( t) /( Rτ ) (1) p où gp est un nombre sans unité dépendant de la forme de l impulsion (0,66 pour une impulsion de forme gaussienne) et τ est la largeur temporelle à mi-hauteur de l impulsion. Pour des impulsions de 100 fs et R = 80 MHz, la probabilité d excitation est multipliée par gp/(rτ) = 10 5, et ce sont.10 6 photons/s qui sont produits. Dans le microscope imaginaire décrit plus haut, cela conduit à environ 100 photons détectés par pixel.

3 Section efficace d absorption La probabilité d une molécule d absorber P est quantifiée par la section efficace d absorption à P, σp. σp s exprime en cm 4.s et vaut entre 1 et cm 4.s pour les fluorophores standards. En comparaison, la section efficace d absorption à 1P, σ1p, vaut environ cm.s. Il est important de connaître σp en fonction de la longueur d onde pour optimiser l excitation. Doubler la longueur d onde optimale d excitation à 1P est souvent une bonne approximation mais certaines règles de sélection interdisent parfois ce choix. Une caractéristique générale des spectres d absorption à P est qu ils ne sont jamais décalés vers le rouge (mais fréquemment décalés vers le bleu) relativement à la position correspondant au double du pic d absorption à 1P. Par exemple, la protéine fluorescente mutante egfp (Enhanced Green Fluorescent Protein), excitable à 1P à 488 nm et présentant un maximum d émission à 50 nm peut être excitée efficacement à 850 nm à P. Les sections efficaces à P de nombreux fluorophores sont larges (environ 100 nm de largueur pour de nombreuses protéines fluorescentes); pour certaines applications, il est avantageux de pouvoir exciter deux espèces différentes avec le même laser en MP. Résolution Pour comparer les performances des microscopes optiques, il est utile d introduire la notion de réponse impulsionnelle d un instrument d optique (PSF : Point Spread Function). L amplitude de la PSF caractérise le champ électromagnétique dans le plan image du microscope à travers lequel on observe un objet source ponctuel. Il n est pas possible d observer directement la PSF mais son intensité IPSF (qui est n est autre que l image d un point source). Les extensions de l IPSF dans les directions transversales et axiale permettent de quantifier le pouvoir de résolution. En effet, la résolution est définie par la distance minimale de séparation entre deux points objets, telle qu ils soient «suffisamment» distinguables. Le critère de Rayleigh précise l adverbe «suffisamment» en considérant que deux points objets sont distinguables lorsque le premier minimum d une tache d Airy est superposé avec le maximum central de la seconde tache d Airy (Fig. 3). La résolution latérale rxy d un microscope de fluorescence conventionnel est selon le critère de Rayleigh : r xy λem 0.61, () ON où λem désigne la longueur d onde d émission de fluorescence et ON l ouverture numérique de l objectif de microscope de focalisation 1. La largeur à mi-hauteur (FWHM) transversale de l IPSF, qui est plus facile à mesurer expérimentalement que la position d un minimum, est 17% plus petite que la résolution définie par le critère de Rayleigh. Figure 3 : IPSF latérale (i.e. fonction d Airy) de deux points sources séparés par la distance spécifiée par le critère de Rayleigh Un microscope confocal utilise un éclairement et une détection ponctuels. L intensité de fluorescence détectée (IPSF de détection) est donc le produit de l intensité d excitation (IPSF d excitation) par l efficacité de collection à travers le trou confocal (IPSF de collection). A cause de ce produit de fonctions; la FWHM transversale de l IPSF d un microscope confocal à 1P est environ 30% plus étroite que l IPSF d un microscope de fluorescence conventionnel : 1 Cette résolution ne dépend évidemment pas du mode d excitation à 1P ou à P mais seulement de λem. Ce résultat reste vrai pour une excitation à P avec trou confocal.

4 r xy, confoc λem 0. 4 (3) ON En MP, l émission de fluorescence étant une fonction quadratique de l intensité d excitation, l IPSF est donnée par le carré de l IPSF d excitation. La FWHM de l IPSF en MP est environ 15% plus étendue que celle d un microscope de fluorescence conventionnel : r xy,mp λem 0.7 (4) ON Cet élargissement provient de la longueur d onde d excitation qui est environ double de celle utilisée en 1MP. Selon l axe optique, les résolutions en microscopie conventionnelle, confocale 3 et MP sont données respectivement par : λ, (5) ON r emn z λ 1,4, (6) ON r emn z, confoc λ r,3 n em z, (7),P ON avec n l indice de réfraction du milieu. Le volume de détection Vdét est défini comme l intégrale dans tout l espace de l IPSF. En ajustant l IPSF par un volume gaussien 3D, Vdét est une expression simple des FWHM transversale ωxy et axiale ωz de l IPSF : 3/ V dét=π ωxy ω z. (8) Les résolutions indiquées précédemment sont des expressions vérifiées dans des conditions idéales d imagerie qui sont parfois difficiles à obtenir. Ainsi la taille du trou confocal a un effet important sur la résolution axiale en microscopie confocale. La MP qui utilise une excitation localisée présente de ce point de vue un réel avantage. Applications Les avantages de la MP (et des MMP) proviennent principalement de (i) la localisation de l excitation et de (ii) la possibilité d exciter de nombreux fluorophores. (i) L excitation localisée restreint le photoblanchiment et la photodestruction pouvant se produire hors de la zone d excitation 4. Tous les photons produits constituent le signal et le bruit de fond est pratiquement absent, ce qui facilite la détection. (ii) Des molécules excitables par l absorption d 1P UV peuvent être efficacement excitées à P dans le proche IR (par exemple la Rhodamine B). Il est en outre possible d exciter avec un même laser des espèces de couleurs différentes et d effectuer ainsi plus facilement de l imagerie multicouleurs. Les applications des MMP incluent l imagerie simultanée de fluorophores dont les spectres d émission sont distants de plusieurs centaines de nm, l imagerie en profondeur de tissus et de petits animaux (souris) 5. Il est a noter que la fluorescence endogène de certaines substances (élastine ) permet de réaliser de l imagerie en profondeur de tissus par MMP sans avoir recours à l adjonction de marqueurs fluorescents. 3- Réduction du volume de détection et résolution sub-longueur d onde : la Microscopie STED : Comment réduire le volume de détection en dessous de la limite imposée par les lois de la diffraction et augmenter ainsi la résolution? Des techniques optiques faisant appel en particulier aux concepts de l optique non linéaire (Hell 003) ont été proposées récemment pour contourner cette limite (sans toutefois contredire les lois de la diffraction). Cette section concerne une méthode de réduction du volume de détection utilisant une non-linéarité entre le signal d excitation et le signal à détecter (la fluorescence dans ce cas). En 1994, il a été proposé (Hell and Wichmann 1994) d utiliser la saturation d une transition entre deux états électroniques pour empêcher localement l émission de la 3 1P ou P 4 Cependant dans la zone excitée, le photoblanchiment est plus fort à P qu à 1P. 5 Cette imagerie en profondeur est due aux longueurs d ondes du proche IR souvent utilisées en MMP qui sont faiblement absorbées par les tissus (fenêtre thérapeutique).

5 fluorescence. La méthode, consiste à dépléter un état moléculaire fluorescent (préalablement excité) par un faisceau focalisé présentant une intensité nulle en un point. Principe Dans le mode de déplétion stimulée de l émission ou STED (pour Stimulated Emission Depletion) (Klar, Jakobs et al. 000), un fluorophore, excité dans un état S1 par une première impulsion focalisée, (Figure 4-A) est stimulé vers son état fondamental S0 par un deuxième faisceau (faisceau STED) en forme de bouée (Figure 4-C). Seuls les fluorophores se trouvant dans la région centrale de la bouée contribuent au signal de fluorescence détecté. Un effet non linéaire dans la déplétion conduit à l obtention d une zone centrale non déplétée plus petite que la limite de diffraction. Pour obtenir une déplétion efficace, il est important qu une molécule ayant été désexcitée par émission stimulée ne puisse pas absorber à nouveau un photon du faisceau STED l ayant déplété. Pour cela, on ne réalise pas la déplétion vers le niveau fondamental mais vers un niveau vibrationnel situé légèrement au dessus du fondamental, il est alors nécessaire que le taux de transition non radiatif du niveau vibrationnel vers l état fondamental soit beaucoup plus grand que le taux de transition conduisant au peuplement de l état excité fluorescent. Dans ce cas, on peut montrer que la population N1 de l état S1 est une fonction nonlinéaire de l intensité de déplétion ISTED : τσi STED hω N1 e (9) où τ désigne la durée du pulse STED, σ la section efficace de la transition et ћω l énergie du photon STED. Cette nonlinéarité permet de réduire au dessous de la limite de diffraction la région de l espace où les molécules sont dans l état excité de fluorescence, alors que les faisceaux excitateurs et dépléteurs STED sont limités par les lois de la diffraction classique. Fig. 4. Principes de microscopie par émission stimulée de fluorescence (STED). (A) Diagramme d énergie d un fluorophore. Une molécule excitée dans un état S1 peut revenir vers un état fondamental S0 par émission spontanée de fluorescence ou par émission stimulée à l aide d une impulsion STED. (B) Pour que le processus stimulé l emporte sur le processus spontané et que la déplétion soit saturée, les impulsions STED doivent être intenses et arrivées immédiatement après le pulse excitateur. Ce délai t entre l impulsion excitatrice et l impulsion STED doit être plus petit que le temps de vie de fluorescence de la molécule dans S1 (B). Au faisceau d excitation est superposé le faisceau de déplétion STED qui possède une zone centrale d intensité nulle. La déplétion saturée réduit fortement le volume de collection de fluorescence (C) (d après (Hell 003)).

6 Mise en œuvre Le système laser utilise deux trains d impulsions synchronisés (Figure 5): un train d impulsions visibles pour l excitation de la fluorescence et un train d impulsion proche IR pour le STED. Chaque impulsion visible (durée 0. ps) est suivie d une impulsion STED dont la durée (plusieurs dizaine de ps) est choisie beaucoup plus longue que le temps de relaxation typique qui conduit la molécule dans l état fondamental. Les intensités de déplétion de la fluorescence sont de MW/cm. Pour obtenir le faisceau STED dont l intensité au foyer d un objectif de microscope est forte autour du point focal mais pratiquement nulle au centre, on utilise un masque de phase en amont de l objectif (Figure 5). Ce masque introduit un délai de λsted/ sur un disque central, inversant le signe de l amplitude de l onde dans cette zone par rapport au reste de la surface annulaire. Si l amplitude de l onde provenant de la zone du disque centrale est égale à la moitié de l amplitude totale de l onde entrant dans la pupille d entrée, le front d onde focalisé interfère destructivement au point focal (cf figure 4-C). La détection du signal est analogue à celle d un microscope confocal de fluorescence. Ti :Saph 76 Mhz Stretcher OPO + SHG Fig.4. : Mise en œuvre expérimentale de la technique STED. L impulsion STED (766nm - 40ps) est élargie temporellement et retardée par rapport à l impulsion excitatrice (558nm - 0.ps) d un retard t plus petit que le temps de vie de fluorescence de la molécule dans S1. Le masque de phase sur l impulsion STED permet de créer un faisceau en forme de bouée réalisant la déplétion en périphérie du point focal (Fig 5-C) (d après (Hell 003)). Résultats et perspectives Par cette méthode, les volumes de détection ont été réduits à la taille record 6 de l, soit environ 6% d un volume confocal conventionnel (Figure 4 -C). Le volume de détection, situé au foyer d un objectif de microscope, peut être localisé n importe où dans l échantillon, comme en microscopie confocale. Une procédure de balayage permet alors de construire une image. Les premiers exemples en biologie concernent l observation de bactéries de levure qui ne peuvent pas être optiquement séparées en microscopie confocale et de membranes cellulaires (Figure 6). Toutefois, l utilisation de STED avec des fluorophores de couleurs différentes est difficile et le faisceau STED, très intense, endommage la plupart des échantillons biologiques. Cette technique reste pour l instant marginale bien qu ayant ouvert une nouvelle voie dans la microscopie non linéaire. 6 La géométrie du volume final non déplété est sphérique avec un diamètre d environ 100 nm

7 Confocal STED Fig. 6. Comparaisons des images obtenues par la microscopie confocale et par la technique STED. Images de cellules de levure S. cerevisiae avec marquage membranaire (a Image confocale et b Image STED). Image d une membrane cellulaire au voisinage d une lamelle de microscope (c Image confocale et d Image STED). La résolution est augmentée ici d un facteur 3 par rapport à la microscopie confocale (d après (Hell 003)). 4- Le contraste vibrationnel : la microscopie Raman stimulée (CARS) Nous venons de voir que le contraste de fluorescence permettait d obtenir des images de fluorophores localisés dans les objets biologiques (tissus, cellules..) avec une résolution égale ou meilleure (cas du STED) que la limite de diffraction. Les techniques de fluorescence bénéficient en général d une très grande sensibilité et utilisent des fluorophores exogènes ou endogènes (cas des protéines de fusion du type GFP). Dans un cas comme dans l autre se pose la difficulté de venir greffer le fluorophore sur la molécule d intérêt et le problème de l éventuelle altération du comportement biologique de la molécule marquée par le fluorophore reste toujours posé. Pour contourner ces difficultés, il existe un contraste intrinsèque à toute structure moléculaire qui se base sur les états vibrationnels spécifiques de toute liaison et assemblages de liaisons chimiques. La spectroscopie IR (Humecki 1995) ou la diffusion Raman (Turrell and Corset 1996) sont deux techniques permettant d avoir accès à ces signatures vibrationnelles. Nous ne présenterons pas ici la spectroscopie IR par absorption mais une brève description de la diffusion Raman spontanée nous permettra de mieux comprendre l origine du contraste CARS. Principe Le Raman spontané Dans un processus de diffusion Raman, une onde pompe de pulsation ωp incident sur une molécule est diffusée inélastiquement en une onde dite Stokes de pulsation ωs et une onde dite Anti-Stokes de pulsation ωas. L écart en fréquence entre les ondes générées et l onde pompe dépend de la transition Raman moléculaire (de pulsation ΩR) de telle sorte que ωp-ωs= ωas-ωp= ΩR. Dans une vision photonique du processus, les ondes Stokes et Anti-Stokes correspondent à une absorption à partir respectivement du niveau vibrationnel fondamental ou excité (Figure 7 A-B). Il est important de noter que les niveaux énergétiques supérieurs mis en jeu sont à priori virtuels (en pointillé sur la Figure 7) mais peuvent être réels (niveaux électroniques) dans le cas du Raman résonant.

8 E ω P ω ΑS ω P ω P ω S ω P ω S ω ΑS Ω R Ω R (A) (B) (C) Fig. 7. Raman spontané : génération de l onde Stokes (A) et de l onde Anti-Stokes (B). Raman Stimulé CARS (C); le processus de mélange à quatre ondes crée l onde Anti-Stokes. Le processus générant l onde Anti-Stokes, partant du niveau vibrationnel excité, est beaucoup moins probable que le processus créant l onde Stokes qui est le seul observé dans la pratique en Raman spontané. Une étude fine de la répartition spectrale des ondes Stokes renseigne sur les densités de liaisons chimiques présentes dans l échantillon. Mise en œuvre sur des tissus, la diffusion Raman spontanée apporte de précieuses informations en particulier dans la détection d amas cancéreux (Choo-Smith, Edwards et al. 00). Ce processus de diffusion inélastique spontané est très peu efficace 7 comparé à la fluorescence et ne peut pas être mis en œuvre à un niveau sub-cellulaire 8. Le Raman Stimulé : CARS Il existe cependant une technique qui consiste à peupler de façon résonante le niveau supérieur vibrationnel par différence de fréquence. Ce processus d optique non linéaire, dénommé CARS (Coherent Anti-stokes Raman Scattering), est possible au point focal d un objectif de microscope si les ondes pompe et Stokes vérifient ωp-ωs=ωr et se recouvrent spatialement et temporellement. Il se produit alors un mélange à quatre ondes qui conduit à l émission d une onde Anti-Stokes et qui vérifie ωas=ωp-ωs (Figure 7-C). CARS, comme nous le verrons, nécessite des champs optiques intenses et requiert l utilisation de lasers impulsionnels. CARS est beaucoup plus efficace 9 que le processus de diffusion spontanée car le niveau vibrationnel est pompé de façon résonnante par différence de fréquence, il est d autre part sélectif car, contrairement au cas spontané, il est possible de cibler la liaison chimique d intérêt en ajustant la différence de fréquence ωp-ωs. L intensité I(ωAS) de l onde Anti-stokes générée par le processus CARS résultant du mélange à quatre ondes, le signal est proportionnel à : NL I ω ) P ( ω ), (10) ( AS AS NL (3) * avec P ω ) = χ E ( ω ) E ( ω ) (11) ( AS P P S S où P NL (ωas) est la polarisation non linéaire induite par le mélange d ondes, Ep et Es sont les champs pompe et stokes, χ (3) est la susceptibilité du troisième ordre (tenseur d ordre trois) et * indique le complexe conjugué 10. On note d après (10) que, comme l absorption à deux photons, CARS est un processus multiphotonique 11 qui est d autant plus probable que les champs sont forts. Ainsi, comme en fluorescence à deux photons, CARS ne s opère qu au foyer de l objectif de microscope et défini intrinsèquement un volume de collection qui permet d obtenir par balayage des images tridimensionnelles. Nous appellerons volume CARS se volume où se produit l interaction. 7 Les sections efficaces Raman varient entre et 10-9 cm, les plus fortes valeurs étant obtenues pour le Raman résonant, alors que la section efficace d absorption à 1P d un fluorophore atteint σf=10-16 cm. 8 L effet Raman spontané peut être fortement exalté (jusqu à ) par des particules métalliques nanométriques, ce phénomène est connu sous de nom de SERS (Surface Enhanced Raman Scattering) (Kneipp, K., H. Kneipp, et al. (00). "Surface-enhanced Raman scattering and biophysics." J. Phys.: Condens. Matter 14: R597-R64. 9 Ce gain est difficile à quantifier mais se situe autour de La relation (11) est en toute rigueur tensorielle, nous l avons écrite ici en scalaire par souci de simplicité. 11 I ( ω ) I ( ω ) I ( ω ). AS P P S S

9 CARS : un processus cohérent On pourrait croire que outre la difficulté technique nécessitant l utilisation de deux faisceaux lasers synchronisés CARS s apparente à de la MMP. Il en diffère en fait fortement par son caractère cohérent. La relation tensorielle (11) indique qu une relation de phase bien définie existe entre les champs excitateurs (pompe et stokes) et la polarisation macroscopique induite P NL (ωas). Cette polarisation induite dépendant de la position r, il va s opérer des processus d interférences entre l émission CARS des divers points du volume CARS. Dans le cas d ondes planes incidentes, l équation 11 nous indique que la dépendance spatiale de P NL (ωas) fait intervenir le vecteurs d onde kp-ks. Ainsi l onde générée Antistokes ne pourra être en interférence constructive que si son déphasage k=kas-(kp-ks) par rapport à la polarisation la générant P NL (ωas) est nul. Ceci impose une forte contrainte sur la géométrie des faisceaux. Dans le cas d une configuration en faisceau fortement focalisé, cette condition est fortement relaxée car il existe dans le faisceau incident une multitude d incidences et l interférence constructive vers l avant va toujours s opérer. Ce phénomène sera d autant plus sensible que l échantillon est épais. Ce phénomène interférentiel conduit à des diagrammes de rayonnement CARS très différents de ceux qu on peut attendre en MMP et l image CARS n est pas une simple convolution de l objet avec la réponse impulsionnelle optique (PSF) de l objectif comme en MMP(Cheng, Volkmer et al. 00). La figure 8 représente des diagrammes de rayonnement CARS pour des objets sphériques de diamètres différents. On note que l émission vers l avant (et résultant en partie du phénomène d interférence) dépend fortement des dimensions de l objet(volkmer, Cheng et al. 001). Pratiquement on retiendra qu un objet plus petit que la longueur d onde pompe λp émet une radiation CARS qui peut être détectée vers l avant et vers l arrière alors qu un objet de taille égale ou supérieure à λp concentre son émission vers l avant. Dans ce cadre, il est alors commode de parler des signaux CARS détecter respectivement vers l avant et vers l arrière sous la dénomination F-CARS et E-CARS 1. Figure 8 : Rayonnement CARS en champ lointain d objets sphériques de diamètres D différents (en unité de la longueur d onde du faisceau pompe λp). On note que pour un objet de diamètre 3λp, l essentiel du rayonnement est émis vers l avant (d après (Cheng, Volkmer et al. 00)). Il est également important de noter que le signal émis vers l avant et résultant d un phénomène interférentiel entre N diffuseurs élémentaires croit en N et non pas en N comme dans le cas de la MMP. Ceci conduit à des signaux F-CARS qui peuvent devenir assez intenses 13 dans la pratique. La figure 9 illustre cette dissymétrie entre les signaux F-CARS et E-CARS en fonction du diamètre de l objet. On a représenté ici l intégrale du signal optique CARS émis dans les demi-espaces supérieurs et inférieurs. Il résulte de cet effet qu une image F-CARS renseignera sur des diffuseurs CARS dont la dimension sera supérieure ou égale à λp alors qu une image E-CARS donnera des informations sur des objets dont l extension axiale reste inférieure à λp. 1 F-CARS pour Forward CARS E-CARS pour Epi CARS 13 Ce même phénomène interférentiel détruit le signal E-CARS en N dès que la dimension axiale de l objet augmente.

10 Figure 9 : Rayonnements vers l avant (F-CARS) et vers l arrière (E-CARS) d un diffuseur sphérique en fonction de son diamètre (en unité de λp) (d après (Cheng, Volkmer et al. 00)). Cette propriété est utilisée non seulement pour distinguer la taille des diffuseurs mais également pour s affranchir du bruit du solvant (souvent un milieu aqueux) (Cheng, Volkmer et al. 001). En effet le phénomène CARS résulte d une contribution résonante que l on cherche à détecter et d une contribution non résonante présente dans tous les matériaux. Traduit en terme de susceptibilité, nous pouvons écrire : R p A R (3) NR χ (3) = χ Ω ( ω ω ) + iγ + (1) s R Nous distinguons dans cette expression le premier terme résonant autour de la fréquence moléculaire ΩR et un second terme indépendant de ωp-ωs toujours responsable d un signal CARS. Pour le solvant qui occupe la totalité du volume CARS et dont l extension axiale dépasse λp, le signal CARS va essentiellement se construire vers l avant donnant ainsi une image F-CARS qui n est pas sur fond noir mais dont le fond traduit le signal non résonnant du solvant. A contrario, l image E-CARS va être sur fond noir car le signal E-CARS due au solvant est nul (voir figure 14). Ainsi une simple détection en mode E- CARS permet de s affranchir élégamment du bruit de fond du solvant intrinsèque au processus CARS 14. CARS : Mise en oeuvre Largeur spectrale La figure 10-A présente la dépendance du signal CARS avec la largeur spectrale 15 ω des impulsions pompe et Stokes 16. On a choisi une résonance moléculaire de largeur spectrale ΓR=10 cm -1 (très représentatif de ce que l on trouve dans les bio-molécules). On constate que le signal CARS non résonant croit quadratiquement avec ω alors que le signal résonant croit également avec ω mais sature lorsque ω devient plus large que la largeur vibrationnelle moléculaire ΓR. Ce comportement se traduit par une décroissance du rapport entre le signal résonant et le signal non résonant lorsque la largeur des impulsions augmente. La figure 10-B illustre l évolution du profil spectral CARS en fonction de la durée des impulsions utilisées, ici encore on a choisit ΓR=10 cm -1. L utilisation de pulses de 00fs conduit à une large réponse spectrale très peu contrastée par rapport au fort signal non résonant. Avec ps de largeur, le rapport signal sur bruit est très largement augmenté alors que des pulses de 10ps n améliorent pas le rapport signal sur bruit mais diminuent le signal d un facteur 10. On retiendra donc dans la pratique une configuration utilisant deux lasers picosecondes (typiquement 3ps) présentant une largeur spectrale vérifiant ω=γr et optimisant ainsi le rapport signal sur bruit. 14 Une autre méthode basée sur la polarisation permet de s affranchir du signal du solvant en F-CARS : Cheng, J.-X., L. D. Book, et al. (001). "Polarization Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy." Optics Lett. 6: En spectroscopie Raman, il est d usage de parler de largeur spectrale en unité de cm -1. La largeur spectrale entre λ1 et λ sera alors exprimée en cm -1 par la différence des nombres d ondes (1/ λ1)-(1/ λ)i. 16 Ces impulsions sont considérées comme Fourier limitées.

11 Figure 10 : (A) Signaux résonants et non résonants et leur rapport en fonction de la largeur spectrale des impulsions. (B) Profil spectral CARS en fonction de la largeur spectrale des impulsions. On a choisi des paramètres correspondant au polystyrène avec une résonance moléculaire de 10cm -1 de largeur (d après (Cheng and Xie 004)). Système laser La figure 11 présente un exemple de mise en œuvre d une expérience CARS sur la base de deux oscillateurs Saphir:Titane picoseconde 17. La difficulté principale réside probablement dans l utilisation d un système de synchronisation permettant d assurer le recouvrement temporel des faisceaux pompe et stokes au foyer de l objectif de microscope. La solution retenue sur la figure 11 utilise une synchronisation électronique active permettant d asservir la longueur de la cavité d un laser Saphir:Titane (Esclave) sur celle d un laser Saphir:Titane (Maître) et assurant ainsi par blocage de mode des trains d impulsions de fréquence identique 18. L échantillon est translaté grâce à un cadre piézoélectrique XYZ alors que les systèmes optiques de détection F-CARS et E-CARS sont fixes et utilisent des photodiodes à avalanche en mode de comptage de photons. Des cartes de comptage assurent une construction simultanée des images F-CARS et E-CARS. BS : séparatrice 50/50 M : Miroir PZT : Piézoélectrique APD : Photodiode à avalanche APD F-CARS M PZT BS Nd:Vd VERDI 10W Platine PZT XYZ ω AS Filtres Objective Microscope NA 0.5 Echantillon MIRA Saphir Titane (Esclave) Synchro Lock MIRA Saphir Titane (Maître) M Filtre Objective Microscope NA1. ω S ω P ω P +ω S ω AS APD APD Filtres Monochromateur Pulse Select Delai Pulse Select M Télescope APD E-CARS Rétroréflecteur BS M (λ/)+glan M Figure 11 : Expérience CARS de l Institut Fresnel sur base de deux laser Saphir:Titane synchronisés (Coherent Inc.). 17 Des photos de l expérience et des informations sur le système peuvent être consulté sur 18 Le jitter mesuré sur ce système est inférieur à 00fs, les impulsions pompe et stokes faisant 3ps, le recouvrement temporel est assuré.

12 Exemples de résultats La technique CARS a été mise en œuvre dans nombres d applications touchant la chimie, la matière condensée et la biologie(cheng and Xie 004). Sans prétendre être exhaustif, nous présentons ici quelques résultats permettant d illustrer les potentialités de la technique. Caractérisation sur billes de polystyrène Les billes en polystyrène sont souvent utilisées pour caractériser les expériences de microscopie CARS car elles présentent une réponse CARS importante pour la liaison C=C à ΩR=1600cm -1. La figure 1 présente une image E-CARS d une bille de polystyrène de 1µm de diamètre placée dans un gel d agarose, les lasers pompes et stokes fonctionnent à une cadence de 400kHz (grâce aux sélecteurs d impulsion - pulse select Fig.11) et sont réglés respectivement à cm -1 (740nm) et 11913cm -1 (840nm). Les puissances moyennes des faisceaux pompe et Stokes sont respectivement de 160µW et de 80µW. L image de 5x5µm présente un rapport signal sur bruit de 40:1 et comporte 0x0 pixels réalisés avec un temps d acquisition de 10ms par pixel. Ces paramètres sont représentatifs d une imagerie CARS obtenue en déplaçant un échantillon biologique tout en préservant son intégrité. Cependant un système de balayage du faisceau par scanners galvanométriques permet d utiliser des puissances moyennes plus fortes (de l ordre de 10mW) et une cadence des lasers de 80MHz, ceci permet une imagerie plus rapide des objets biologiques (0.01ms/pixel)(Cheng, Jia et al. 00) y (µm) x(µm) Figure 1 : Image CARS d une bille de polystyrène de 1µm de diamètre placée dans un gel d agarose. La liaison ciblée est C=C à ΩR=1600cm Du point de vue spectral, le signal CARS apparaît à ωas=ωp-ωs=ωp+ωr et présente une largeur spectrale similaire à celle des faisceaux pompes et stokes. La figure 13-A présente le signal CARS observé avec un spectromètre tandis que la figure 13-B présente la sensibilité de ce signal au désaccord temporel entre les impulsions pompe et stokes. Figure13 : (A) Signal CARS à λas=πc/ωas=660nm; (B) Evolution du signal CARS à λas en fonction du désaccord temporel entre les impulsions pompe et stokes. 19 C est le régime avec lesquelles les images 14 et 15 ont été obtenues.

13 Exemple en imagerie cellulaire La figure 14 présente les images F-CARS, E-CARS et DIC de cellules NIH 3T3 ; ωp-ωs est accordé sur la vibration de C-H aliphatique à 870cm -1. Alors que le contraste est faible sur l image DIC, les images CARS font apparaître les membranes riches en C-H. Sur l image F-CARS l enveloppe nucléaire est clairement visible alors que la membrane cellulaire est invisible. Ce phénomène est dû au phénomène d interférence constructive vers l avant qui se produit pour la membrane nucléaire. En effet, la bordure de cette membrane présente une plus grande extension axiale que la membrane plasmique. On note d ailleurs sur l image E-CARS que la membrane nucléaire apparaît en sombre du fait de l interférence destructive vers l arrière. On distingue sur l image F-CARS des organelles cytoplasmiques dont le contraste est altéré par le signal non résonant de l eau. A contrario, ce bruit non résonant lié à l eau est absent sur l image E-CARS qui apparaît comme beaucoup plus contrastée. On y distingue multitude d organelles dont celles en forme de tige au voisinage du noyau, et invisible en DIC, sont attribuées aux mitochondries. CARS permet d accéder à une résolution sub-cellulaire tout en gardant un bon contraste. Ainsi la figure 15 illustre l imagerie F-CARS de chromosomes de cellules NIH 3T3 durant la phase de mitose ; ωp-ωs est accordé sur la vibration symétrique de PO - à 1090 cm -1 (une liaison présente dans l ADN). Figure 14 : Images F-CARS, E-CARS et DIC de cellules NIH 3T3. Liaison ciblée : C-H aliphatique à 870cm-1. La fréquence du faisceau pompe est de cm -1 (711nm), celle du faisceau stokes de cm -1 (894nm) (d après (Cheng, Jia et al. 00)). Figure 15 : Image F-CARS de cellules NIH 3T3 pendant la mitose. On distingue la distribution des chromosomes. Liaison ciblée:1090 cm -1. La fréquence du faisceau pompe est de cm -1 (735nm), celle du faisceau stokes de 1503 cm -1 (799nm) (d après (Cheng, Jia et al. 00)). Conclusion Bien que la microscopie de fluorescence à 1P se soit imposée dans les laboratoires de biologie comme un outil indispensable pour explorer le monde du vivant, cette technique est ultimement limitée par les lois de la diffraction et nous avons rappelé en début de chapitre les résolutions accessibles. En première analyse, l utilisation de lasers impulsionnels ne permet pas d accroître la résolution et nous avons vu qu un microscope confocale à P présente un pouvoir de résolution plutôt moins bon qu à 1P. L intérêt de la MMP réside plutôt dans d autres aptitudes comme l excitation conjointe de plusieurs fluorophores, l excitation localisée au foyer de l objectif de microscope, le pouvoir de pénétration dans des tissus... Dans une mise en œuvre plus fine, les lasers impulsionnels permettent d accéder à des régimes où les non linéarités vont permettrent d accéder à de meilleures résolutions ou à de nouveaux contrastes. Nous avons présenté la technique STED qui utilise la saturation d une transition radiative pour générer des volumes de collection présentant les dimensions records de (100 nm) 3. Nous avons poursuivi notre exposé en présentant la technique CARS qui permet de générer une fluorescence paramétrique au foyer d un objectif de microscope par mélange à quatre ondes. Ici encore c est la réponse non linéaire de la matière soumise à des champs optiques intenses qui va permettre de stimuler une diffusion inélastique Raman.

14 L utilisation des lasers impulsionnels pour générer des contrastes non linéaires ne s arrête pas à ces deux techniques et la génération d harmoniques(moreaux, Sandre et al. 000) (seconde et troisième harmonique) apparaît aujourd hui comme une technique très complémentaire de la fluorescence, en particulier car certaines substances contenues dans les tissus présentent des réponses fortes (collagène ). De façon plus générale, il est maintenant certain que de nouvelles sources laser ultrabrèves et compactes vont rapidement être intégrées dans les microscopes commerciaux pour amener ces nouveaux concepts de microscopie non linéaire dans les laboratoires de biologie. Bibliographie Cheng, J.-X., L. D. Book, et al. (001). "Polarization Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy." Optics Lett. 6: Cheng, J. X., Y. K. Jia, et al. (00). "Laser-scanning coherent anti-stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology." Biophys J 83(1): Cheng, J.-x., A. Volkmer, et al. (001). "An Epi-Detected Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (E-CARS) Microscope with High Spectral Resolution and High Sensitivity." J. Phys. Chem. B 105: 177. Cheng, J.-X., A. Volkmer, et al. (00). "Theoretical and experimental characterization of coherent anti-stokes Raman scattering microscopy." JOSA B 19: Cheng, J.-X. and X. S. Xie (004). "Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: instrumentation, theory and applications." J. Phys. Chem. B 108: 87. Choo-Smith, L. P., H. G. Edwards, et al. (00). "Medical applications of Raman spectroscopy: from proof of principle to clinical implementation." Biopolymers 67(1): 1-9. Denk, W., J. H. Strickler, et al. (1990). "Two-photon laser scanning fluorescence microscopy." Science 48(4951): Hell, S. W. (003). "Toward fluorescence nanoscopy." Nature Biotechnology 1(11): Hell, S. W. and J. Wichmann (1994). "Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy." Optics Letters. 1 June 1994; 19(11): 780. Humecki, H. J. (1995). Practical Guide to Infrared and Microspectroscopy. New York, Marcel Dekker. Klar, T. A., S. Jakobs, et al. (000). "Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission." Proc Natl Acad Sci U S A 97(15): Kneipp, K., H. Kneipp, et al. (00). "Surface-enhanced Raman scattering and biophysics." J. Phys.: Condens. Matter 14: R597-R64. Moreaux, L., O. Sandre, et al. (000). "Membrane Imaging by second-harmonic generation microscopy." J. Opt. Soc. Am B 17: Turrell, G. and J. Corset (1996). Raman Microscopy Development and Applications. San Diego, Academic Press. Volkmer, A., J.-X. Cheng, et al. (001). "Vibrational Imaging with High Sensitivity via Epidetected Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy." Phys. Rev. Lett. 87: Zipfel, W. R., R. M. Williams, et al. (003). "Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences." Nat Biotechnol 1(11):