PLEX-ID, une nouvelle approche pour une identification microbienne rapide

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1 PLEX-ID, une nouvelle approche pour une identification microbienne rapide Pr Jacques Izopet Laboratoire de Virologie CHU de Toulouse & INSERM U ème Colloque National des 41 ème Colloque National des Biologistes des Hôpitaux, Toulouse, 25/09/2012

2 Avancées technologiques en Infectiologie Evolution des stratégies diagnostiques Approche syndromique Personnalisation Résultats attendus dans le temps du soin plateaux techniques + logistique tests unitaires délocalisés Concepts de base Concepts de base Miniaturisation Automatisation Parallélisation multiplexage

3 Pôle de biologie CHU de Toulouse Purpan Rangueil Langlade g

4 Objectifs Simplifier les organisations Accréditation Mutualiser les équipements Réduire les coûts de production Favoriser l innovation, la recherche et les activités pédagogiques

5 Structuration en 5 plateaux techniques Purpan Rangueil Langlade PT Automatisé PT Spécialisé PT Infectiologie PT Automatisé PT Oncologie CPTP I2MC CRCT Centres de recherche INSERM/CNRS/INRA

6 Le plateau technique d infectiologie Regroupement de 3 services Bactériologie-Hygiène Virologie Parasitologie-Mycologie 3 plateformes Sérologie Biologie moléculaire Morphologie & culture

7 IFB - CHU de Toulouse

8 Innovations en infectiologie Test de tropisme HIV : TTT 2007 Séquençage haut débit Spectrométrie de masse

9 Spectrométrie de masse Détermination du poids des molécules Détecteur Echantillon ionisé Temps de vol Champ électrique Analyse des données

10 Spectrométrie de masse en microbiologie MALDI-TOF MS PCR + ESI TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Electro Spray Ionization Protéines Acides nucléiques Acides nucléiques Produits de clivages ARN obtenus après PCR et transcription Amplicons ADN Identification de bactéries et champignons après isolement en culture Identification par MLST Multi Locus Sequence Typing Détection directe dans les échantillons biologiques et identification de bactéries, champignons et virus

11 11 Processus PLEX-ID

12 PCR ESI TOF MS Etape 1 Amplification par PCR Amorces large spectre

13 Amorces influenza PB1 Human and swine H1N1, H1N1 H2N2, H3N2 Canine, equine H3N8 Human, avian i H5N1 6 nucleotide deletion Influenza B and C Other avian, swine

14 PCR ESI TOF MS Etape 2 Etape 3 Etape 4 Mass detection Signal processing Signal processing masses to base compositions

15 Workflow Echantillons : Sang, LCR, sécrétions respiratoires, urine, biopsies tissulaires,... Eau, aliments, échantillons de l environnement Echantillon Extraction acides nucléiques Décalage Analyse de la masse des amplicons 1. Conversion de la masse en composition de base 2. Identification avec la base de données PCR 6-8 h (DNA/RNA) de l échantillon du résultat

16 Extraction : PLEX-ID SP Extraction automatisée fondée sur des billes magnétiques 1 heure / 96 échantillons

17 Pipetage : PLEX-ID FH Automatisation : échantillon et billes magnétiques plaques d extraction ARN extrait plaques PCR

18 Thermocycleurs : PLEX-ID TC PCR dans des plaques 96 puits

19 Instrument PLEX-ID Injection échantillon Collecteur de plaques & dessalage Tampons Unité dessalage Pompe Compression àvide Spectomètre de masse Plaque 96 puits (48 min) Réactifs embarqués (15plaquesen12h) en échantillons/jour Connection Abbott Link Base de données mise à jour régulièrement

20 Panels adaptés à une approche syndromique et/ou épidémiologique Infections respiratoires (B, V) Infections entériques (B, V, P) Infections de l immunodéprimé (V) Infections du système nerveux central (V) Infections transmises par des vecteurs (B, V, P) Champignons Bacteria Bactéries Virus Protozoaires Génotypage Facteur de virulence Marqueurs de résistance

21 Système Plex-ID Flu Détection Influenza A, B & C Identification du sous-type Influenza A

22 Système Plex-ID Flu Détection Influenza A, B et C & génotypage Influenza A 9 paires d amorces réparties dans 8 puits couvrant tous les segments génomiques 9800 souches dans la base de données détection des souches connues & inconnues

23 Système Plex-ID Flu Influenza A

24 Système Plex-ID Flu Influenza B

25 Système Plex-ID Flu Influenza C

26 Etude comparative Echantillons respiratoires collectés au cours de la saison hivernale Enfants / Adultes PLEX-ID Flu vs RespiFinder & PCR temps réel

27 Respifinder & PCR temps réel Respifinder kit PathoFinder : PCR multiplex détectant et différenciant 15 virus dont Influenza A et B Influenza A/H1N1 Detection kit Roche : PCR temps réel détectant Influenza A (M2) & H1N1 pdm 2009 (HA)

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30 Système Plex-ID Flu vs RespiFinder RESPIFINDER Flu A Flu B Négatif Total Flu A ** 70 Flu B PLEX-ID Négatif Echec* Total * : échec > 2 points pour 1 échantillon ** : 3 H1N / 1 H1N1 seasonal / 1 H3N2

31 Système Plex-ID Flu vs RespiFinder Flu A RESPIFINDER Flu B Négatif Total PLEX-ID Flu A Flu B Négatif Echec* Total Concordance = 93 8% Concordance = 93,8 % Sensibilité = 87,4 %

32 Plex-ID Flu vs Influenza A/H1N1 PCR temps réel A H1/pdm2009 A H1/pdm A non H1 0 Total 55 PLEX-ID A H3 Négatif Echec Total

33 Plex-ID Flu vs Influenza A/H1N1 PCR temps réel A H1/pdm2009 A non H1 Total PLEX-ID A H1/pdm2009 A H Négatif Echec Total Sensibilité = 95,3 %

34 Développements attendus Analyse de la résistance avec des amorces adaptées ciblant NA Enrichissement de la base de données

35 Infection virale cardiaque humaine et résultats cliniques Virus Infection virale Susceptibilité cardiotropes cardiaque génétique Myocardite aiguë 5-10/Million/an / Guérison clinique 10-20% Myocardite chronique 9% 12-42% Cardiomyopathie dilatée prevalence: 7 / % Mort subite 80% Transplantation cardiaque Andreoletti et al. ACDV 2009

36 Causes virales de cardiomyopathies dilatées Différents virus pourraient jouer un rôle dans la pathogénèse des cardiomyopathies dilatées Kuhl et al. Circulation 2005 Andreoletti et al. ACDV 2009

37 Détection virale dans le tissu cardiaque PLEX-ID vs RT PCR Enterovirus PCR/ESI TOF-MS + PCR/ESI TOF-MS - PVB19 PCR/ESI TOF-MS + PCR/ESI TOF-MS - HHV6 PCR/ESI TOF-MS + PCR/ESI TOF-MS - RT-qPCR RT-qPCR To otal number of positive ca ses % 17.6% 20.6% 11.8% * 23.5% 2.9% EV PVB19 EV + PVB19 EV + HHV6 Real time Q-PCR assay PCR/ESI TOF-MS EV, PVB19 and EV+PVB19 semblent être les principales infections virales impliquées dans le développement de cardiomyopathies dilatées chez l adulte Andreoletti ECCMID 12

38 Charges virales dans le tissu cardiaque PLEX-ID vs RT PCR Gen nome copies/µg of total RNA Positive EV Samples P=0.26 PCR/ESI TOF-MSRT-qPCR ome copies/µg of total RNA Gen Positive PVB19 Samples P=0.56 PCR/ESI TOF-MSRT-qPCR EV positive samples by PCR/ESI-TOF MS and RT-qPCR PVB19 positive samples by PCR/ESI-TOF MS and RT-qPCR Andreoletti ECCMID 12

39 Viral IC : Virus de l'immunodéprimé Adenovirus Human Adenovirus* (2-54, A-F) Enterovirus* Human Coxsackievirus Human Echovirus Human Enterovirus Human Rhinovirus Herpesvirus Human Erythrovirus V9 Parvovirus Human Erythrovirus VX Cytomegalovirus (CMV, HHV-5*) Human Parvovirus B19* Epstein-Barr-Virus (EBV, HHV-4*) Herpes-Simplex-Virus-1 1(HSV1 (HSV-1, HHV-1*) Herpes-Simplex-Virus-2 (HSV-2, HHV-2*) Varicella-Zoster-Virus (VZV, HHV-3*) Kaposi-Sarcoma-Associated-Herpesvirus i i (KSHV, HHV-8*) HHV-6 A et B Polyomavirus BK-Virus* JC-Virus*

40 HEV : alimentation & environnement Pig liver sausage sample Market* HEV RNA HEV RNA concentration (copies/g) A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 Negative Negative Negative Positive Positive Positive Negative , Mansuy EID 2011

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42 Identification bactérienne par amplification d une région génomique variable Les amorces de PCR ciblent des régions conservées des génomes bactériens. Région Hautement Variable Région informative spécifique de chaque bactérie La signature moléculaire du produit PCR permet l identification bactérienne

43 Panel Bactéries / Candida

44 Panel Bactéries responsables d intoxications i ti alimentaires i

45 Identification des STEC 0157:H7 & non 0157

46 Synthèse Le système PLEX-ID offre une nouvelle approche de diagnostic moléculaire multiplex : virus, bactéries & champignons Analyse directe sur échantillons sans culture ou séquençage Identification possible de nouvelles souches ou espèces émergentes Amélioration de l instrumentation attendue dans les 2 prochaines années

47 Remerciements Laboratoire de Virologie Institut Fédératif de Biologie CHU de Toulouse I. Dasilva C. Mengelle JM. Mansuy Abbott D. Favy M. Picard-Maureau JB. Smith P. Leroux M. de Graff