Détermination des amines primaires aromatiques dans le simulant B ayant été mis en contact avec les ustensiles de cuisine en polyamide

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1 P. : 1/11 Modifications version 9 Extension de la méthode pour 26 AAPs Modifications du 29/10/2012 Suppression points et Suppression Blanc réactif et Blanc matrice dans le programme de mesure (point 6.8) Suppression des points 7.3 et 7.4 Modifications du 1/06/2011 Révision complète de la procédure Modifications du 20/12/2010 Adaptation des conditions de migration suivant le «Guidelines on testing conditions for articles in contact with foodstuffs», CRL. Table des matières 1 Objet et domaine d application Définitions et abréviations Principe de la méthode Sécurité Prélèvement, réception, circulation, stockage et évacuation des échantillons Partie expérimentale Produits consommables Equipement et matériel de laboratoire Préparation des solutions Préparation des solutions des standards de référence... 5 Préparation des solutions pour l analyse Préparation des échantillons Echantillons inconnus... 7 Echantillon de contrôle à 5 ppb Extraction des échantillons Courbe d Etalonnage Analyse par LC-MS/MS Conditions LC... 8 Conditions MS Programme de mesure Evaluation des mesures Interprétation qualitative Interprétation quantitative Evaluation des résultats d analyse Solvant Standard de référence... 10

2 P. : 2/ Echantillon de contrôle Courbe d Etalonnage Echantillon inconnus Validation de la méthode Rapports d essai Contrôle de qualité Normes et Référence... 11

3 P. : 3/11 1 Objet et domaine d application Les amines aromatiques primaires (AAP) sont utilisées dans la production de colorants azotés donnant une couleur noire aux ustensiles de cuisine en nylon. Le but de cette procédure est de vérifier la conformité des ustensiles en nylon émis sur le marché belge, destinés aux consommateurs. En effet, une limite spécifique de migration de 0,010 mg/kg aliment (ou simulant alimentaire), soit de 0,0033 mg/dm 2 (en se référant au rapport conventionnel de 6 dm 2 par kg d aliment), est mentionné dans la Directive 10/2011 pour la quantité totale d amines primaires aromatiques. La recherche des amines primaires aromatiques s étend aux 26 molécules suivantes : Aniline (ANL), 2,4- diaminotoluene (2,4-TDA), 4,4-diaminophenylmethane (4,4 -MDA), Ortho-aminoazotoluene (o-aat), 4- aminoazobenzene (4-AAB), o-anisidine (o-asd), 4-chloro-aniline (4-CA), 4-chloro-o-toluidine (4-CoT), 1,5-diaminonaphtalene (1,5-DAN), 3,3 -dichlorobenzidine (3,3 -DCB), 2,2 -dichloro-4,4 - methylenedianiline (DCMDA), 2,4-dimethylaniline (2,4-DMA), 2,6-dimethylaniline (2,6-DMA), 3,3 - dimethylbenzidine (3,3 -DMB), 3,3 -dimethoxybenzidine (3,3 -DMOB), 4,4 -diaminodiphenylether (4,4 - DPE), 4,4 -methylene-di-o-toluidine (4,4 -MDoT), 2-methyl-5-nitroaniline (2-M-5-NA), 2,4-diaminoanisole (2-M-mPDA), 2-methoxy-5-methylaniline (2-MO-5-MA), m-phenylenediamine (m-pda), p- phenylenediamine (p-pda), 4,4 -thiodianiline (4,4 -SDA), o-toluidine (o-t), 2,6-diaminotuoluene (2,6-TDA) et 2,4,5-trimethylaniline (2,4,5-TMA). La méthode analytique à appliquer pour la détermination de ces amines aromatiques primaires dans des ustensiles en polyamide/nylon s effectue par UPLC-MS/MS. Le processus de validation concerne la méthode analytique pour la détermination de ces AAPs provenant des ustensiles de cuisine dans le simulant. 2 Définitions et abréviations d p AAP UPLC-MS/MS o-aat 4-AAB ANL o-asd 4-CA 4-CoT 1,5-DAN 3,3 -DCB DCMDA 2,4-DMA 2,6-DMA 3,3 -DMB 3,3 -DMOB 4,4 -DPE 4,4 -MDA 4,4 -MDoT 2-M-5-NA 2-M-mPDA 2-MO-5-MA m-pda p-pda 4,4 -SDA o-t Diamètre des particules Amine aromatique primaire Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem Ortho-aminoazotoluene 4-aminoazobenzene Aniline o-anisidine 4-chloro-aniline 4-chloro-o-toluidine 1,5-diaminonaphtalene 3,3 -dichlorobenzidine 2,2 -dichloro-4,4 -methylenedianiline 2,4-dimethylaniline 2,6-dimethylaniline 3,3 -dimethylbenzidine 3,3 -dimethoxybenzidine 4,4 -diaminodiphenylether 4.4-diaminophenylmethane 4,4 -methylene-di-o-toluidine 2-methyl-5-nitroaniline 2,4-diaminoanisole 2-methoxy-5-methylaniline m-phenylenediamine p-phenylenediamine 4,4 -thiodianiline o-toluidine

4 P. : 4/11 2,4-TDA 2,6-TDA 2,4,5-TMA SML 2,4-diaminotoluene 2,6-diaminotuoluene 2,4,5-trimethylaniline Specific Migration Limit 3 Principe de la méthode Les ustensiles (à usage répété) sont mis en contact avec le simulant en respectant les conditions de temps et température de contact pour extraire les amines aromatique primaires (ANL, 2,4-TDA, 4,4-MDA, o-aat, 4-AAB, o-asd, 4-CA, 4-CoT, 1,5-DAN, 3,3 -DCB, DCMDA, 2,4-DMA, 2,6-DMA, 3,3 -DMB, 3,3 - DMOB, 4,4 -DPE, 4,4 -MDoT, 2-M-5-NA, 2-M-mPDA, 2-MO-5-MA, m-pda, p-pda, 4,4 -SDA, o-t, 2,6- TDA et 2,4,5-TMA). Après trois migrations successives le liquide de migration est analysé par UPLC- MS/MS. 4 Sécurité Toutes les précautions seront prises lors de la manipulation des échantillons et des solutions étalons pour éviter toutes contaminations. Le port de gants est recommandé lors des différentes étapes de l analyse. L utilisation de solvants organiques se fera de préférence sous une hotte bien ventilée. L élimination des solvants et des solutions se fait dans les bidons «solvants» appropriés. Rem : Il est conseillé de manipuler avec précaution le réactif pur (masque) et d utiliser des gants car il est irritant pour la peau et les voies respiratoires. 5 Prélèvement, réception, circulation, stockage et évacuation des échantillons Les échantillons sont prélevés par le client. Dès leur arrivée dans l institut, les échantillons sont enregistrés au dispatching suivant leurs procédures (SOP 40/DIS/002/N, SOP 40/DIS/003/NF, DOC 40/DIS/003/NF, DOC 40/DIS/004/F) et ensuite pris en charge par le service. Les analyses et les échantillons sont suivis dans le LIMS suivant les SOPs 20/26/F et 20/27/F. 6 Partie expérimentale 6.1 Produits consommables Les réactifs doivent être de qualité analytique et prévus pour la LC-MS. Ci-dessous les différents standards utilisés dans cette méthode. Leurs numéros de CAS, leurs fournisseurs et leur place de stockage sont également renseignés. Ortho-aminoazotoluene o-aat Sigma-Aldrich Armoire chimique 4-aminoazobenzene 4-AAB Sigma-Aldrich Armoire chimique Aniline ANL Sigma-Aldrich Armoire chimique o-anisidine o-asd Sigma-Aldrich Armoire chimique 4-chloro-aniline 4-CA Sigma-Aldrich Armoire chimique 4-chloro-o-toluidine 4-CoT Sigma-Aldrich Armoire chimique 1,5-diaminonaphtalene 1,5-DAN Sigma-Aldrich Armoire chimique 3,3 -dichlorobenzidine 3,3 -DCB Sigma-Aldrich Armoire chimique 2,2 -dichloro-4,4 -methylenedianiline DCMDA Sigma-Aldrich Armoire chimique 2,4-dimethylaniline 2,4-DMA Sigma-Aldrich Armoire chimique 2,6-dimethylaniline 2,6-DMA Sigma-Aldrich Armoire chimique 3,3 -dimethylbenzidine 3,3 -DMB Sigma-Aldrich Armoire chimique 3,3 -dimethoxybenzidine 3,3 -DMOB Sigma-Aldrich Armoire chimique

5 P. : 5/11 4,4 -diaminodiphenylether 4,4 -DPE Sigma-Aldrich Armoire chimique 4.4-diaminophenylmethane 4,4 -MDA Acros Armoire chimique 4,4 -methylene-di-o-toluidine 4,4 -MDoT Sigma-Aldrich Armoire chimique 2-methyl-5-nitroaniline 2-M-5-NA Sigma-Aldrich Armoire chimique 2,4-diaminoanisole 2-M-mPDA Sigma-Aldrich Armoire chimique 2-methoxy-5-methylaniline 2-MO-5-MA Sigma-Aldrich Armoire chimique m-phenylenediamine m-pda Sigma-Aldrich Armoire chimique p-phenylenediamine p-pda Sigma-Aldrich Armoire chimique 4,4 -thiodianiline 4,4 -SDA Sigma-Aldrich Armoire chimique o-toluidine o-t Sigma-Aldrich Armoire chimique 2,4-diaminotoluene 2,4-TDA Sigma-Aldrich Armoire chimique 2,6-diaminotuoluene 2,6-TDA Sigma-Aldrich Armoire chimique 2,4,5-trimethylaniline 2,4,5-TMA Sigma-Aldrich Armoire chimique Acide Formique Acétonitrile Méthanol Eau préparée par le système Milli-Q Acide acétique (LC Grade, Biosolve) (LC Grade, Biosolve) (LC Grade, Biosolve) (Millipore) (HPLC grade, Merck) 6.2 Equipement et matériel de laboratoire Pipettes en verre Pipettes pasteur Ballons jaugés en verre Tube Falcon de 15 ml (Eppendorf) Fioles à injection pour UPLC (Alltech) Bain à Ultrasons Balance analytique 0,1 mg (Satorius CP 2245) Agitateur Vortex Centrifugeuse UPLC-Xevo ou équivalent + Masslynx software + consommables liés à l appareil analytique (Waters) Colonne Acquity UPLC C18 BEH 2.1 X 100mm, 1.7 µm (Waters) Rem : Du matériel équivalent peut être utilisé. 6.3 Préparation des solutions Préparation des solutions des standards de référence Rem.: l étiquetage de toutes les solutions s effectue selon le SOP I/03/27/NF. Si pas applicable, créez une étiquette contenant les données suivantes : Code de la solution Solvant Nom de la personne préparant la solution Date de préparation Date de péremption Mode de conservation Solutions stock des Amines Aromatiques Primaires (AAP) à 1000 mg/l Chaque standard séparément en solution. Préparer des solutions stock de 1000 mg/l des différents standards de référence des amines aromatiques primaires. Peser avec précision 100 mg de substance pure dans un ballon jaugé ombré de 100 ml et mettre au trait avec du méthanol. Etiqueter et conserver 5 ans au congélateur ( -15 C). La pureté et le poids de la substance définissent la concentration exacte de la solution.

6 P. : 6/11 Solutions intermédiaires des AAP à 10 mg/l Effectuer une dilution du stock afin d obtenir une solution standard intermédiaire avec une concentration d environ 10 mg/l pour chaque AAP. Transférer environ 100 µl de la solution o-aat 1000 mg/l 100 µl de la solution 4-AAB 1000 mg/l 100 µl de la solution ANL 1000 mg/l 100 µl de la solution o-asd 1000 mg/l 100 µl de la solution 4-CA 1000 mg/l 100 µl de la solution 4-CoT 1000 mg/l 100 µl de la solution 1,5-DAN 1000 mg/l 100 µl de la solution 3,3 -CB 1000 mg/l 100 µl de la solution DCMDA 1000 mg/l 100 µl de la solution 2,4-DMA 1000 mg/l 100 µl de la solution 2,6-DMA 1000 mg/l 100 µl de la solution 3,3 -DMB 1000 mg/l 100 µl de la solution 3,3 -DMOB 1000 mg/l 100 µl de la solution 4,4 -DPE 1000 mg/l 100 µl de la solution 4,4 -MDA 1000 mg/l 100 µl de la solution 4,4 -MDoT 1000 mg/l 100 µl de la solution 2-M-5-NA 1000 mg/l 100 µl de la solution 2-M-mPDA 1000 mg/l 100 µl de la solution 2-MO-5-MA 1000 mg/l 100 µl de la solution m-pda 1000 mg/l 100 µl de la solution p-pda 1000 mg/l 100 µl de la solution 4,4 -SDA 1000 mg/l 100 µl de la solution o-t 1000 mg/l 100 µl de la solution 2,4-TDA 1000 mg/l 100 µl de la solution 2,6-TDA 1000 mg/l 100 µl de la solution 2,4,5-TMA 1000 mg/l dans un ballon jaugé ombré de 10 ml et porter au trait avec du méthanol. Déterminer avec précision la teneur en mg/l de cette solution. Etiqueter et conserver 1 mois au congélateur ( -15 C). Solutions intermédiaires des AAP à 0.5 mg/l Effectuer une dilution du stock afin d obtenir une solution standard intermédiaire avec une concentration d environ 0.5 mg/l pour chaque AAP. Transférer environ 500 µl de la solution intermédiaire des AAP à 10 mg/l dans un ballon jaugé ombré de 10 ml et porter au trait avec du méthanol. Déterminer avec précision la teneur en mg/l de cette solution. Etiqueter et conserver 1 mois au congélateur ( -15 C). Solution pour la courbe d étalonnage Ajouter des volumes différentes des solutions intermédiaire des amines aromatiques primaires à 1 mg/l dans des ballons jaugés ombrés de volumes différents, comme indiquées dans le tableau ci-dessous afin d obtenir une courbe d étalonnage.

7 P. : 7/11 Niveau V (Solution intermédiaire V (Solution intermédiaire des AAP à 0.5 mg/l) des AAP à 10 mg/l) V final (ml) [AAP] (µg/l) «CAL 0» 10 ml 0 «CAL 1» 10 µl 10 ml 0.5 «CAL 2» 20 µl 10 ml 1 «CAL 3» 40 µl 10 ml 2 «CAL 4» 100 µl 10 ml 5 «CAL 5» 10 µl 10 ml 10 «CAL 6» 20 µl 10 ml 20 «CAL 7» 30 µl 10 ml 30 Mettre au trait avec de l eau Milli Q avec 3 % acide acétique. Calculer avec précision la teneur de ces solutions. Etiqueter et conserver 3 jours au frigo ( 10 C) Préparation des solutions pour l analyse Eau Milli Q avec 3% acide acétique Estimer le volume de la solution nécessaire et préparer la solution comme décrit ci-dessous : Par exemple : Pour un volume de 100 ml : Mettre 3 ml d acide acétique dans un ballon jaugé de 100 ml. Amener au trait avec de l eau Milli Q. Etiqueter et renouveler après 1 mois. Phase mobile A : 0.1% acide formique dans l acétonitrile Mélangez 1 ml de l acide formique avec 999 ml d acétonitrile. Etiqueter et renouveler après un mois. 6.4 Préparation des échantillons Echantillons inconnus Rem : Les guidelines du document Technical guidelines on testing the migration of primary aromatic amines from polyamide kitchenware and for for formaldehyde from melamine kitchenware du EU-RL doivent être suivies. (Voir site CRL JRC) Mettre l échantillon dans un bécher. Si l étiquette indique des instructions avant l usage des outils, ils doivent être suivis avant l analyse. Si rien n est mentionné, immerger complètement l échantillon avec le simulant. Suivre la procédure Echantillon de contrôle à 5 ppb Mettre 5 ml d un extrait du matériel de référence dans un tube en verre. Ajouter 50 µl de la solution intermédiaire des AAP à 0.5 mg/l Mettre en vial. 6.5 Extraction des échantillons Pour les échantillons, suivre les étapes suivantes : Placer à l étuve 2h à 100 C ± 3 C. Il faut répéter 3 fois l opération de migration. Le liquide issu de la troisième migration est analysé directement par LC-MS/MS.

8 P. : 8/ Courbe d Etalonnage Injecter les différentes solutions «CAL 0» - «CAL 7» afin de construire la courbe d étalonnage. 6.7 Analyse par LC-MS/MS Conditions LC Colonne LC Acquity UPLC BEH C18, 2.1 I.D. x 100 mm, 1.7 µm d p Volume d injection 10 µl Phase mobile A 0.1% acide formique dans l acétonitrile Phase mobile B Eau Milli Q Gradient pour l analyse (3 AAP): Temps Phase mobile A Phase mobile B Flux (%) (%) (ml/min) Courbe initial Gradient pour l analyse (26 AAP): Temps Phase mobile A Phase mobile B Flux (%) (%) (ml/min) Courbe initial Conditions MS Ionisation mode ESI+ Capillary voltage 3 kv Cone voltage 30 V Source offset 30 V Source Temperature 150 C Desolvation temperature 450 C Cone gas flow 50 L/hr Desolvation gas flow 650 L/hr Collision gas flow 0.15 ml/min

9 P. : 9/11 La méthode d acquisition MS décrit les transitions suivies pour chaque molécule: Analyte Ion parent (MH+) (m/z) Ions filles (m/z) Collision Energy (ev) Temps de retention** (min) Temps de retention*** (min) ANL 94 51, 77* 25, o-t *, 93 15, 15 / 3.02 p-pda , 92* 20, 15 / 0.69 m-pda , 92* 20, 15 / ,4-DMA , 107* 15, 15 / 3.5 2,6-DMA , 105* 20, 15 / ,4-TDA , 108* 20, ,6-TDA , 106* 15, 15 / 0.99 o-asd , 109* 25, 15 / CA *, , 25 / ,4,5-TMA , 121* 20, 20 / MO-5MA , 123* 30, 15 / M-mPDA *, , 15 / CoT *, , 15 / M-5-NA , 107* 30, 15 / ,5-DAN , 143* 40, 25 / AAB *, 93 30, 30 / ,4 -MDA , 106* 25, ,4 -DPE , 108* 25, 20 / ,3 -DMB , 198* 30, 20 / ,4 -SDA *, , 20 / 4.12 o-aat *, , 25 / ,4 -MDoT *, , 25 / ,3 -DMOB *, , 30 / ,3 -DCB , 218* 30, 20 / 5.62 DCMDA , 232* 40, 20 / 5.76 * Ion fille utilisé pour la quantification ** Temps de rétention avec le gradient pour 3 AAP *** Temps de rétention avec le gradient pour 26 AAP 6.8 Programme de mesure Le programme suivant reprend les différentes injections qui doivent se trouver dans la séquence (contrôle, blancs, etc) et l ordre dans lequel ces injections doivent être faites. En fonction des analyses à effectuer, des injections de solvant peuvent être ajoutées si c est nécessaire. aaaammjj_solvant01 aaaammjj_stdref01 Standard de référence = Courbe d étalonnage «CAL 3» aaaammjj_spike01 Echantillon de contrôle 5 ppb aaaammjj_solvant02 aaaammjj_cal00 Courbe d étalonnage «CAL 0» aaaammjj_cal01 Courbe d étalonnage «CAL 1» aaaammjj_cal02 Courbe d étalonnage «CAL 2» aaaammjj_cal03 Courbe d étalonnage «CAL 3» aaaammjj_cal04 Courbe d étalonnage «CAL 4» aaaammjj_cal05 Courbe d étalonnage «CAL 5» aaaammjj_cal06 Courbe d étalonnage «CAL 6» aaaammjj_cal07 Courbe d étalonnage «CAL 7»

10 P. : 10/11 aaaammjj_solvant03 aaaammjj_routine01 Echantillon inconnu: Réf de l échantillon aaaammjj_routine02 Echantillon inconnu: Réf de l échantillon.. aaaammjj_solvant04 aaaammjj_stdref02 Standard de référence = Courbe d étalonnage «CAL 3» 6.9 Evaluation des mesures Interprétation qualitative L identification des amines aromatiques primaires dans un échantillon s effectue en se basant sur le temps de rétention et le ratio des ions spécifiques pour chaque amine aromatique primaire : On considère qu il y a présence de AAP si : Le temps de rétention ne varie pas plus de 5 % en comparant avec le temps de rétention de l analyse de référence (échantillon de contrôle ou standard de référence) Il y a la confirmation du rapport des ions spécifique des AAP : Le rapport d intensité du signal des deux ions filles obtenu pour les échantillons ne peut pas différer plus que 30 % comparé avec le rapport obtenu de l analyse de référence (échantillon de contrôle ou standard de référence) Interprétation quantitative Les résultats sont interprétés sur base de la courbe d étalonnage. L aire des pics chromatographiques des ions utilisés pour quantifier, obtenus pour les standards en fonction des concentrations en AAP permet de déterminer la droite de calibration. L aire du pic chromatographique d AAP pour les échantillons est rapporté dans la droite de calibration afin d obtenir la concentration en AAP contenue dans l échantillon. Les résultats bruts en mg/l sont ensuite corrigés en fonction du taux de récupération obtenu. Les résultats sont exprimés en mg/dm² après avoir tenu compte du volume d extraction et de la surface de contact de l ustensile avec le liquide de migration puis reconvertis en mg/kg en tenant compte du facteur conventionnel de 6 pour exprimer le résultat final. Y=aX+b avec a = coefficient angulaire de la droite, b = origine de la droite, Y = aire AAP, X = concentration AAP (mg/l) après correction Résultat AAP en mg/dm² = (X*V)/S avec V = Volume de simulant (L), S = Surface de l ustensile en contact avec le simulant (dm 2 ) 7 Evaluation des résultats d analyse 7.1 Solvant L injection de solvant ne devrait donner aucun pic au temps de rétention des composés recherchés, ce qui démontre l absence d effet de mémoire significatif. 7.2 Standard de référence Le standard de référence en début de programmation sert de référence pour contrôler le bon fonctionnement du système avant la nouvelle série d analyses. Tous les composés recherchés doivent être présents avec une intensité pour lequel S/N > 6. Le standard de référence à la fin de la programmation sert de référence pour contrôler le bon fonctionnement du système à la fin de la série d analyses. Tous les composés recherchés doivent être présents avec une intensité pour lequel S/N > 6.

11 P. : 11/ Echantillon de contrôle L échantillon de contrôle correspond à un échantillon blanc fortifié à 5 ppb pour chaque analyte. Les résultats quantitatifs sont encodés dans la carte de contrôle et doivent se situer dans les limites acceptables. 7.4 Courbe d Etalonnage La droite d étalonnage sert à quantifier les résultats. Le coefficient de corrélation de la droite doit être égal ou supérieur à 0, Echantillon inconnus La présence d un pic au temps de rétention relatif à un des analystes et présentant les ions diagnostiques recherchés implique la présence de la molécule. Donc, la quantification est aussi exécutée pour déterminer la concentration en analyte(s) dans l échantillon. 8 Validation de la méthode Voir le dossier de validation DOC 23/0558/F. 9 Rapports d essai Utiliser les instructions de la procédure 20/25/NF 10 Contrôle de qualité Une évaluation régulière de la qualité de chaque essai doit être réalisée à plusieurs niveaux : Au moins deux des trois lignes de contrôles doivent, si possible, être appliquées. Contrôle de 1ère ligne : Le résultat de l échantillon de contrôle est encodé dans une carte de contrôle afin de valider la série d analyse. Contrôle de 2ème ligne : Analyse d un échantillon dopé à une valeur inconnue, préparé par le responsable d analyse. L échantillon est analysé par l analyste. Cette analyse doit être réalisée au minimum une fois par an si une troisième ligne de contrôle n est pas effectuée. Contrôle de 3ème ligne : Participation au minimum une fois par an, à des essais d aptitude ou des tests interlaboratoires lorsque ceux-ci sont organisés. Voir aussi la SOP I/03/24/NF pour une description plus détaillée du contrôle qualité. 11 Normes et Référence Les normes d assurance de qualité ISO sont d application pour les analyses. Technical guidelines on testing the migration of primary aromatic amines from polyamide kitchenware and for for formaldehyde from melamine kitchenware, EU-RL, NRL-FCM publication, version 7, April 30 th, 2011.