Sénescence réplicative: Théorie de l horloge mitotique. Taille critique Sénescence. jours. Taille critique. 6 Kb

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1 14/2/13 Sénescence réplicative: Théorie de l horloge mitotique Divisions Taille critique Sénescence Raccourcissement des télomères jours Perte télomérique / division cellulaire Cellules somatiques Taille des télomères Kb Southern blot Taille critique 6 Kb Sénescence (fibroblastes) Nombre de divisions LES TELOMERES RACCOURCISSENT REGULIEREMENT AU COURS DES DIVISIONS CELLULAIRES TR F m o y en s (K b ) n d i v i s i o n s 5 j 5 m. 26 a n s 28 a n s 81 a n s

2 Athletes: Longueurs télomériques et nombre de cellules satellites In vivo Exercise intensif: - TRFmin plus courts - Nombre plus élevé de cellules satellites In vivo Les télomères mesurés in vivo sont dramatiquement plus courts dans les dystrophies Min TRF length Control Muscular dystrophies ( n = 21 ), r =. 64, m = - 13 b p / y. A g e ( n = 11 ), r =. 76, m = b p / y. 2

3 TELOMERES ET TELOMERASE Il existe un mécanisme pour remettre l horloge mitotique à zéro, par exemple à chaque génération : C est la télomerase qui allonge les télomères Au cours du développement : - Les télomères sont longs - La télomèrase est active dans les cellules précoces Après la naissance : et chez l'adulte - Les télomères raccourcissent - La télomérase est inactive sauf : dans certains tissus prolifératifs (couche basale de la peau, crypte intestinale, etc...) dans la lignée germinale - La télomèrase est active dans la grande majorité des tumeurs invasives Peut-on manipuler la capacité proliférative? La télomérase exogène peut augmenter la capacité proliferative, mais n est pas suffisante pour immortaliser les myoblastes humains Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours affiché, vous devrez peut-être supprimer l'image avant de la réinsérer. Il existe un mécanisme supplémentaire qui provoque un arret prolifératif dominant sur l horloge mitotique 3

4 La sénescence cellulaire peut être induite par des voies multiples instabilité de la chromatine Cassures d ADN non télomérique Arrêt irréversible du cycle cellulaire Signaux de stress Oncogènes, mutations oncogéniques Télomères courts/dysfonctionnels (Sénescence réplicative) Voies impliquées dans l arrêt prolifératif des myoblastes humains Telomerase Longueur X télomérique critique pas d immortalisation = p53 = p21 E2F Rb Cycline CDK Sortie du cycle en G1 Stress p16 E2F + XP P P Rb Implication de la voie p16? 4

5 Cycle Cellulaire p16 INK4a M Cycline D CdK4/6 p15 INK4b p18 INK4c INK4 G2 R G1 p19 INK4d p21 CIP1 S p27 KIP1 p57 KIP2 CIP-KIP p16 se lie à cdk4 pour inhiber la progression du cycle cellulaire Implication de la voie p16 dans l arrêt prolifératif? Inhibition de la voie p16 par surexpression de Cdk4 PDL Control-CdK4 Control Taille critique TRF (Kb) ** jours en culture. Contrôle Contrôle-CdK4 Délai de l arrêt prolifératif Les télomères atteignent la valeur critique L arrêt prolifératif est déclenché par p16 avant que les télomères n atteignent la taille critique 5

6 HSK + htert (donneur adulte) + p16 Cdk-4 LHCN population clonage LHCNM2 Clone myogénique Les myoblastes immortalisés ont dépassé les 2 divisions Pas de tumeurs observées in vivo. Telomeres = 18-2 kb LHCNM2 : myoblastes (TRFs 18-2 kb) Collaboration avec Woody Wright LHCNM2 : myotubes (D33) Implication de la voie p16 en pathologie Dystrophie myotonique DM1 : Expansion de triplets CTG dans la région non codante du gène DMPK N div max ** TRF moyens (kb) ** Ratio p16 / Emerin ns 2 1 Contrôle DM Contrôle DM1.5. Cont-S DM1-S 33% capacité proliférative Télomères plus longs à l arrêt prolifératif Même niveau de p16 à l arrêt prolifératif Les myoblastes DM1 s arrètent avant les contrôles Arrêt précoce Ils s arrètent avec des télomères «long» Arrêt p16? 6

7 Implication de la voie p16 en pathologie n div n div DM1 Contrôle DM1-CdK4 jours DM1 25 DM1-hTERT DM1-hTΔ jours Taille critique TRF moyens (kb) DM1 DM1-Cdk4 L inhibition de p16 supprime l arrêt précoce : Les télomères atteignent la taille critique - S 5aza htert seule ne peut immortaliser les cellules DM1 Le seul clone immortalisé est défectif pour p16 Les répétitions CTG pourraient générer un signal de type stress qui déclencherait la voie p16. p16 GAPDH : clone defectif pour p16 Conclusions 1 - Le vieillissement est caracterisé par une baisse du nombre de cellules satellites - Et par une baisse de leur capacité proliferative - La sénescence (en fait l arrêtproliferatif) perturbe le programme myogénique - La prolifération des cellules humaines est contrôlée par l érosion télomérique MAIS La voie de stress interfère avec la prolifération et peut déclencher, au moins in vitro, un arrêt précoce. La voie p16 peut être activée précocemment en pathologie Q : Quelle est l implication de la voie p16 in vivo? 7

8 Capacité proliférative Jeune Agé sédentaire Agé Actif P16ARNm Nombre max de divisions - Pas de différences dans la capacité proliférative in vitro - Augmentation du niveau d expression dep16 dans les cultures de sujets âgés sédentaires. Diminution de l efficacité de régénération avec l âge 1. Facteurs environnementaux Rongeurs - Greffe d un muscle de rat âgé dans un rat jeune (Carlson and Faulkner, 1989) - Parabiose hétérochronique souris jeune - âgée (Conboy et al., 25) l efficacité de régénération du muscle âgé Dérégulation de facteurs systémiques avec l âge: Hormones, Facteurs de croissance 1. Les cellules des rongeurs sont plus sensibles au stress Sensibilité à l'environnement 2. Expression de la télomérase constitutive chez la souris Pas de vieillissement réplicatif 8

9 Facteurs secrétés et vieillissement musculaire Sarcopenie Perte de masse musculaire (atrophie) force Contractions plus lente Réponse hypertrophique à la surcharge Modification du comportement avec l age Jeune Injury Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours affiché, vous devrez peut-être supprimer l'image avant de la réinsérer. Cellules Satellites Vieux Soluble factors Descendance cellulaire Impossible Impossibl d'afficher e l'image. d'afficher Votre l'image. ordinateur Votre manque ordinateu peut-être r manque de peut-être mémoire de IRM de sujets jeunes et agés Viellissement de l environnement Vieillissement local Regeneration perturbée Maintien de la niche perturbée Dérégulation de facteurs secrétés avec l âge? Caractérisation du secrétome des myoblasteshumains en différenciationin vitro Analyse du milieu de cellules en cours de différenciation (sans sérum) Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours affiché, vous devrez peut-être supprimer l'image avant de la réinsérer. 4% Potentiellementsecrétées Secretées classiquement Non classées 257 Soluble Secreted Secrétées sans signal Sécretion d exosomes et de microparticules Qui contiennent des protéines, Mais aussi des mrnas et des mirnas 9

10 Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur manque peutêtre de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est Exosomes Le secretome des myotubes humains Les myotubes secrètent des vésicules : exosomes et microparticules Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours affiché, vous devrez peut-être supprimer l'image avant de la réinsérer. MPs Exosomes Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur manque peutêtre de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est Microparticules MPs NB : Ces vésicules contiennent aussi des mrnas et des mirnas Stress p16 Stress oxidatif Inflamm-aging VIEILLISSEMENT Capacité régénératrice Renouvellement nucléaire? Modifications du secrétome Sénescencecellulaire Horlogemitotique Baisse du nombre de progéniteurs Capacitéproliférative avec arrêtprématurépotentiel Retard et baisse de la capacitéà se différencier Altération du protéasome et du renouvellementprotéique (coll B. Friguet) Augmentation du stress oxidatif et de l oxydation des protéines (coll B. Friguet) Modification du secrétome:baisse du niveau de signalisation Augmentation de remodelage de l ECM et des cytokines inflammatoires 1

11 Les myoblastes ne sont pas tout seuls! Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours affiché, vous devrez peut-être supprimer l'image avant de la réinsérer. Comportement in vivo? Cryodommage Sur le TA + myoblastes humains RAG - / γc - / C5 - Alymphoide, pas de NK Detection de fibres humaines (spectrine) Et de noyauxhumains (lamins A/C) à l aided anticorps ne reconnaissant quelesprotéineshumaines Analyses post-injection précoce : 24hrs-5jours tardive :1-2 mois Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur manque peutêtre de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours affiché, vous devrez peutêtre supprimer l'image avant de la réinsérer. 11

12 Co-injections avec des macrophages : Differenciationin vivo Expression de MHC néonatale Lamine A/C humaine (noyaux) Impossible d'afficher l'image. Votre ordinateur manque peut-être de mémoire pour ouvrir l'image ou l'image est endommagée. Redémarrez l'ordinateur, puis ouvrez à nouveau le fichier. Si le x rouge est toujours affiché, vous devrez peut-être supprimer l'image avant de la réinsérer. 5j in vivo P=,55 ** * Les macrophages pro- inflammatoires retardent la differencia8on, Les an8- inflammatoires favorisent la differencia8on Régénération musculaire Cellule satellite quiescente Inflammation lésion Cytokines, chemokines Cellule satellite activée Autres types cellulaires Fibroblastes, etc Angiogénèse Facteurs secretés, vesicules Facteurs circulants Innervation Facteurs trophiques 12

13 Conclusions 2 Interactions cellulaires : secretome - Les cellules musculaires en différenciation secrètent des cytokines (myokines) - Le secretome varie en fonction de l âge prolifératif - Les cellules sénescentes favorisent la prolifération et inhibent la différenciation Macrophages - Les macrophages pro-inflammatoires favorisent la prolifération (cytokines) - Les macrophages anti-inflammatoires favorisent la différenciation (cytokines) Il existe un dialogue entre les acteurs cellulaires de la réparation, entre autre via des molécules secrétées ou des vésicules dédiées, qui participe à la régulation de la régénération musculaire. 13