Découvrez le vaccin contre le paludisme

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1 Découvrez le vaccin contre le paludisme Atelier d expérimentation PROTOCOLE

2 Introduction Le paludisme est considéré comme la maladie la plus importante du monde due à un parasite et est responsable du décès de près de personnes chaque année, en particulier d enfants de moins de cinq ans et de femmes enceintes. Selon l Organisation mondiale de la santé (OMS), près de millions de personnes risquent de contracter l infection, et 225 millions de cas de paludisme se sont produits dans le monde en 2010, dont 90 % ont eu lieu en Afrique. De nos jours, le paludisme est endémique dans plus de 100 pays localisés en Afrique subsaharienne et dans les régions du sud de l Asie, d Amérique latine et d Océanie. Les derniers rapports montrent que la moitié de la population mondiale vit dans des zones présentant un risque de contracter la maladie et où le paludisme n a pas seulement des conséquences sur la santé de la population, mais contribue aussi à fragiliser davantage la situation économique de la zone. Afin d éradiquer la maladie dans les zones à haut risque de transmission, plusieurs inter- ventions sont menées à bien sous la forme de différentes mesures combinées comprenant l utilisation de moustiquaires imprégnées d insecticide, d aérosols insecticides et de traitements de prévention, ainsi que l implantation de programmes éducatifs et d interventions environnementales, entre autres. La communauté scientifique travaille intensément pour mettre au point un vaccin qui, associé aux mesures actuelles, pourrait contribuer de manière significative, selon les experts, à un meilleur contrôle du paludisme. Il existe déjà actuellement un vaccin en phase d étude clinique, qui sera efficace dans 50 % des cas. Cet atelier vous permettra d étudier différents candidats-vaccins afin de décider quel candidat est le plus efficace. Pays ou zones où a lieu la transmission du paludisme Pays ou zones à risque réduit de transmission du paludisme Source : Organisation mondiale de la santé (OMS). Données de

3 Comment se transmet le paludisme? Le paludisme est une maladie infectieuse transmise par la piqûre d un moustique du genre Anopheles qui transmet des parasites du genre Plasmodium et agit par conséquent comme un vecteur. Au sein de l organisme humain, les parasites se multiplient dans le foie pour infecter ensuite les globules rouges. Parmi les symptômes du paludisme, les plus significatifs sont la fièvre, les maux de tête et les vomissements, survenant 10 à 15 jours après la piqûre du moustique. Quelles sont les interventions mises en place pour contrôler le paludisme? Les principales interventions pour contrôler le paludisme sont réparties en plusieurs groupes : 1 Des stratégies contre le moustique ou vecteur, telles que la fumigation des espaces fermés à l aide d insecticides. Pourquoi un vaccin contre le paludisme est-il nécessaire? Historiquement, les vaccins ont constitué l un des moyens les plus efficaces pour prévenir des maladies et sauver des vies, en particulier dans le cas des maladies infectieuses. L obtention d un vaccin partiellement efficace pourrait représenter la possibilité de sauver des centaines de milliers de vies. L obtention d un vaccin impliquera une avancée majeure. Il pourra être ajouté à l arsenal actuel de mesures utilisées pour la prévention du paludisme, telles que les moustiquaires imprégnées d insecticide ainsi que le traitement opportun et adéquat des cas diagnostiqués de paludisme. Comme son efficacité à court terme sera partielle, il ne remplacera pas ces mesures, mais les complètera, constituant ensemble une réponse complète pour la prévention du paludisme. 2 Des stratégies permettant d éviter le contact vecteur- hôte, comme l utilisation de moustiquaires imprégnées d insecticide. 3 Des stratégies contre le parasite. Ce dernier groupe comprend le traitement à base d une association de médicaments mis au point à partir d une molécule appelée artémisinine, qui est rapide et efficace. Un vaccin serait aussi une stratégie de contrôle du parasite qui, en combinaison avec d autres stratégies, pourrait contribuer de manière significative à l éradication du paludisme. 3

4 Que faisons-nous à l ISGLOBAL, l Institut de santé globale de Barcelone? L Institut de santé globale de Barcelone (ISGlobal) est une organisation à but non lucratif, dont l objectif est d améliorer la santé et le développement des populations les plus vulnérables par la génération, la gestion, la transmission et l application de connaissances. Sa vision est un monde où nous puissions tous être en bonne santé et il compte avec le soutien de l œuvre sociale «la Caixa», entre autres institutions. L un des piliers essentiels de l ISGlobal est la recherche centrée sur les problèmes de santé affectant les populations les plus vulnérables et elle se déroule au Centre de recherche sur la santé internationale de Barcelone (CRESIB). La recherche sur le paludisme effectuée au CRESIB est consacrée aux travaux suivants : 1. Étude des bases moléculaires de la maladie, ainsi que des différentes réponses immunitaires. 2. Mise au point de nouveaux médicaments et évaluation de leur sécurité, efficacité et effectivité. 3. Évaluation des caractéristiques épidémiologiques du paludisme au sein de différents environnements et des aspects socioculturels qui l entourent. 4. Analyse de l efficacité de différents outils de prévention, ainsi que du rapport coût/efficacité des interventions. Dans le cadre du point (4), le CRESIB réalise des études cliniques de sécurité, d efficacité et d effectivité des vaccins. Il participe actuellement à la mise au point du vaccin RTS,S contre le paludisme, qui est efficace chez plus de 50 % des enfants infectés. Parallèlement, le travail des chercheurs du CRESIB porte sur l identification de nouveaux candidats-vaccins. 4

5 Objectifs de l atelier Dans le cadre de cet atelier, nous vous proposons de travailler sur différents candidats-vaccins contre le paludisme en cours d étude au CRESIB, pour identifier le meilleur candidat. Les candidats-vaccins du CRESIB ont été obtenus à partir de protéines du parasite préalablement purifiées. 1 Afin de procéder à leur étude, vous disposerez de plusieurs échantillons de sang de personnes résidant dans des zones affectées par le paludisme, qui ont déjà souffert de la maladie à plusieurs reprises et sont immunisées. Pour confirmer l efficacité de nos candidatsvaccins, nous devons vérifier si les personnes immunisées ont développé une réponse contre ces candidats. Si une activation de la réponse immunitaire contre les protéines candidates est observée, cela signifie qu elles pourraient constituer de bons candidats-vaccins car elles pourraient aussi déclencher la réponse nécessaire à la protection contre de futures infections

6 Cet atelier a pour vocation de vous familiariser avec l une des techniques les plus utilisées dans les laboratoires de biomédecine, la technique ELISA («Enzima Linked Immuno Sorbent Assay»). Il s agit d une analyse permettant de détecter la présence d anticorps dans les échantillons de sang. La présence d anticorps spécifiques contre les candidats indique la capacité à déclencher une bonne réponse immunitaire et qu il peut donc s agir d un bon candidat. Grâce à cette technique, nous découvrirons en particulier lequel des antigènes disponibles dans le laboratoire est un bon candidat-vaccin contre le paludisme. Principes fondamentaux de la technique ELISA Le principe fondamental de cette technique repose sur l interaction du candidat-vaccin, ou antigène (1), avec l anticorps (2). Un anticorps spécifique se lie à un antigène spécifique pour former un complexe antigène-anticorps exclusif. La technique ELISA nous permet de mettre en évidence la présence des anticorps et, par conséquent, la formation de complexes antigène-anticorps lors du contact des échantillons de sang avec les candidats-vaccins. Pour mener à bien l identification, nous utilisons des anticorps liés à une molécule appelée enzyme (3) ayant la capacité de réagir avec une substance appelée substrat (4) que nous ajoutons, et de produire une couleur. Ainsi, si l échantillon contient l anticorps que nous voulons détecter, celui-ci se lie à celui que nous ajoutons lié à une enzyme, ce qui fait apparaître un changement de couleur du substrat, nous indiquant de cette manière un résultat positif. Anticorps Enzyme Substrat Antigène 1. Antigène : toute substance étrangère susceptible de se lier de manière spécifique aux anticorps ou lymphocytes spécifiques et de déclencher une réponse immunitaire. En général, les antigènes ont un poids moléculaire élevé et sont normalement des protéines ou des polysaccharides. 2. Anticorps : protéines (immunoglobulines - Ig) du sérum générées en réponse à l invasion de molécules étrangères dans l organisme, soit par exposition naturelle à un antigène, soit par immunisation au moyen de vaccins. Ils ont la forme d un Y et sont constitués de quatre chaînes polypeptidiques liées grâce à des liaisons disulfures intercaténaires. Les anticorps possèdent une région constante et une région variable. 3. Enzyme : protéine contribuant aux réactions spécifiques du métabolisme. 4. Substrat : solution contenant un composé sur lequel agira une enzyme. 6

7 Organisation de l atelier Afin de découvrir lequel des candidats-vaccins ou antigènes est le plus efficace, nous analysons si les échantillons de sang de personnes immunisées contre le paludisme ont des anticorps contre ceux-ci. Pour ce faire, l expérience est divisée en 3 étapes principales. 1. LIAISON DES PROTÉINES CANDIDATES (OU ANTIGÈNES) À LA SURFACE DES PUITS La première étape consiste à fixer les protéines candidates faisant l objet de l étude sur un support solide. 2. FORMATION DE COMPLEXES ANTIGÈNE-ANTICORPS Nous ajoutons ensuite les échantillons de sang, plus précisément le sérum (correspondant aux échantillons de sang après extraction des cellules et des facteurs de la coagulation), et un anticorps marqué par une enzyme que nous appelons anticorps secondaire. Les échantillons de sang contenant l anticorps à étudier présentent la formation de complexes antigène-anticorps, qui se lient à leur tour à l anticorps marqué par l enzyme. Sérum des patients Anticorps secondaire marqué par une enzyme 3. LECTURE DE LA RÉACTION Enfin, nous ajoutons le substrat de l enzyme, qui, en présence du complexe antigène-anticorps, change de couleur. Nous pouvons ainsi savoir si les échantillons de sang contiennent l anticorps à étudier et la quantité d anticorps. Substrat de l enzyme Résultats et conclusions Les résultats obtenus permettent de décider quel candidat-vaccin déclenche une réponse immunitaire plus intense et peut donc être le meilleur candidat. 7

8 Équipement et matériel nécessaire Instruments et ustensiles de laboratoire Agitateur magnétique (1) (pour préparer le PBS-Tween) Chronomètre Noyau magnétique et «extracteur de noyaux» Éprouvette de 100 ml Micropipette de 20 à 200 µl (2) Flacon en verre de 250 ml Entonnoir Consommables Barrettes de 12 puits d ELISA et portoirs Pipettes Pasteur en plastique graduées Pointes pour micropipette Papier absorbant Feutre permanent Gants, lunettes et blouse 1. Si vous ne disposez pas d agitateurs magnétiques, vous pouvez acheter le PBS liquide 2. Si vous ne disposez pas de micropipettes, vous pouvez utiliser des pipettes Pasteur de petit volume 8

9 Réactifs et échantillons A B Substrat Candidats-vaccins (antigènes) Substrat ou solution révélatrice Détergent Tween-20 (4) C+ C- Contrôles positifs et négatifs (5) 1 Eau distillée Anticorps secondaire Solution tampon PBS (3) 2 Anticorps secondaire lié à une enzyme (peroxydase) 3 4 Échantillons de sérum de quatre personnes résidant dans des zones où le paludisme est endémique, qui sont immunisées contre la maladie 3. Permet de maintenir le ph de la solution grâce aux phosphates de sodium et de potassium. 4. Permet de prévenir des liaisons d anticorps non spécifiques. 5. C+ : contient un mélange de sérums de personnes résidant dans des zones où le paludisme est endémique, qui sont immunisées contre la maladie. C- : mélange de sérums de personnes n ayant jamais été exposées au paludisme. 9

10 Procédures Pour déterminer la présence ou l absence d anticorps spécifiques contre les deux antigènes candidats-vaccins disponibles dans le laboratoire, nous mettons en contact le sang (plus précisément le sérum) de différents patients résidant dans des zones où le paludisme est endémique avec ces antigènes afin d observer si des anticorps spécifiques contre nos antigènes sont présents dans ces sérums. 1 Liaison des antigènes à la surface des puits Les barrettes de micropuits sont recouvertes de candidats-vaccins (antigènes) à analyser pour découvrir s il s agit de bons candidats-vaccins contre le paludisme. La liaison de ces antigènes à la surface des puits se produit facilement car ces derniers sont constitués d un plastique traité ayant une grande affinité pour lier des protéines. PROTOCOLE POUR LA LIAISON DES ANTIGÈNES À LA SURFACE DES PUITS 1 Annotez ensuite le contenu de chaque puits (contrôles, échantillons de sang et nom des antigènes à étudier). 2 Étiquetez les puits en marquant le lieu de dépôt de chaque échantillon. 10

11 3 Préparez une solution de lavage (PBS-Tween à 0,05 %). A B Mesurez 200 ml d eau distillée à l aide de l éprouvette et complétez au volume avec la pipette Pasteur. Versez les 200 ml d eau distillée dans le flacon à l aide de l entonnoir. C Introduisez le noyau magnétique dans le flacon et diluez dans l eau une pastille de PBS à l aide de l agitateur magnétique. D Après dissolution de la pastille, procédez à l extraction du noyau magnétique et ajoutez 100 µl de Tween-20 à l aide d une pipette Pasteur en plastique. Agitez bien le contenu du flacon en le retournant plusieurs fois. Remarque : La solution de lavage contient du PBS (phosphate buffer saline) permettant de maintenir les anticorps dans un environnement stable qui aide à la conservation de leur structure. Le Tween-20 est un détergent permettant d éliminer les protéines liées de manière non spécifique. Il se lie aux parties du puits non recouvertes d antigène, réduisant ainsi le bruit de fond. 11

12 4 5 Ajoutez les deux antigènes à étudier aux puits correspondants à l aide de la micropipette (50 µl par puits). Il est important d utiliser une pointe propre pour déposer les antigènes, afin d éviter des contaminations. Laissez incuber pendant 5 minutes à température ambiante. 6 7 Lavez pour éliminer l excès d antigène non lié à la barrette. Pour ce faire, remplissez les puits avec la solution de lavage à l aide d une pipette Pasteur en plastique. Éliminez les résidus d antigène en retournant la barrette sur un papier absorbant. 8 Éliminez la solution de lavage en retournant la barrette sur un papier absorbant. 9 Répétez une fois les étapes 7 et 8. 12

13 2 Formation de complexes antigène-anticorps Au cours de cette étape, nous préparons d abord le sérum des patients pour détecter la présence d anticorps contre le candidat-vaccin. Nous appelons anticorps primaires ces anticorps que nous voulons analyser. Nous ajoutons ensuite un anticorps secondaire marqué par une enzyme appelée peroxydase. Comme chaque anticorps primaire peut être lié à plus d un anticorps secondaire, nous observerons une augmentation de la quantité de couleur obtenue lors de l étape trois. La technique sera ainsi plus sensible. Sérum des patients Anticorps secondaire marqué par une enzyme PROTOCOLE DE FORMATION DE COMPLEXES ANTIGÈNE-ANTICORPS 1 2 Ajoutez les contrôles positifs et négatifs aux puits correspondants à l aide de la micropipette (50 µl par puits). Le contrôle positif (C+) contient un mélange de sérums de personnes résidant dans des zones où le paludisme est endémique, qui sont immunisées contre la maladie. Le contrôle négatif (C-) contient un mélange de sérums de personnes n ayant jamais été exposées au paludisme. Ajoutez les différents échantillons de sérums de quatre personnes résidant dans des zones où le paludisme est endémique aux puits correspondants à l aide de la micropipette (50 µl par puits). 13

14 3 4 Laissez incuber pendant 5 minutes à température ambiante. 5 Éliminez l excès d échantillon par retournement de la barrette sur un papier absorbant. 6 Lavez tous les puits afin d éliminer les anticorps n ayant pas réagi avec les antigènes, qui sont par conséquent non spécifiques. Remplissez les puits avec la solution de lavage à l aide d une pipette Pasteur en plastique. 7 Éliminez la solution de lavage par retournement de la barrette sur un papier absorbant. 8 Répétez deux fois les étapes 5 et 6. Ajoutez l anticorps secondaire lié à une enzyme à tous les puits à l aide de la micropipette (50 µl par puits). 14

15 9 10 Éliminez l excès d anticorps secondaire par retournement de la barrette sur un papier absorbant. Laissez incuber pendant 5 minutes à température ambiante Lavez les puits en les remplissant avec la solution de lavage à l aide d une pipette Pasteur en plastique. Éliminez la solution de lavage par retournement de la barrette sur un papier absorbant. 13 Répétez trois fois les deux étapes précédentes. 15

16 3 Lecture de la réaction À la fin du lavage pour éliminer toutes les molécules marquées non liées sous la forme de complexes antigène-anticorps, ajoutez le substrat enzymatique en solution, qui facilitera le changement de couleur. Substrat de l enzyme PROTOCOLE DE LA LECTURE DE LA RÉACTION 1 2 Ajoutez le substrat de l enzyme à l ensemble des puits à l aide de la micropipette (50 µl par puits). Laissez incuber pendant 5 minutes au cours desquelles le substrat se lie à l enzyme pour faire apparaître la couleur à température ambiante. 16

17 3 Annotez les résultats sous la forme d un graphique à barres. ANTIGÈNE 1 maximum Intensité Intensité minimum Échantillons C+ C- M1 M2 M3 M4 ANTIGÈNE 2 maximum minimum Échantillons C+ C- M1 M2 M3 M4 17

18 Résultats et conclusions Interprétez et notez les résultats 1. Quel antigène parmi ceux que vous avez analysés est, selon vous, le meilleur candidat-vaccin? Pensez-vous que les antigènes que vous avez analysés sont des bons candidats-vaccins? Pourquoi? 2. Quand une réaction est-elle positive ou négative? Pourquoi? 3. Pourquoi, selon vous, faut-il utiliser les contrôles? 18

19 4. Quelle partie de l anticorps primaire est reconnue par l anticorps secondaire : la région constante ou la région variable? Justifiez la réponse. 5. Que se passerait-il si les lavages n étaient pas effectués avant l ajout du substrat révélateur? 6. Du sang des collègues de votre classe peut-il être utilisé pour déterminer si nos antigènes de laboratoire sont de bons candidats pour mettre au point un vaccin contre le paludisme? Justifiez la réponse. 7. Pensez-vous que cette expérience ait démontré que le candidat sélectionné déclenche la réponse immunitaire? Faut-il effectuer un autre type d expérience en vue d évaluer s il est aussi capable de déclencher un autre type de réponse? 19

20 Annexe I Consignes de sécurité PORT DES LUNETTES OBLIGATOIRE PORT DE LA BLOUSE OBLIGATOIRE PORT DES GANTS OBLIGATOIRE INFORMEZ-VOUS Localisez les éléments de sécurité du laboratoire ou de l espace prévu pour effectuer des expériences (extincteurs, douches ou bain, sorties, etc.). Veuillez lire attentivement les instructions avant de commencer une expérience. N oubliez pas de lire les étiquettes de sécurité des réactifs et des appareils. UTILISEZ DES VÊTEMENTS ADÉQUATS Gants, blouse et lunettes de protection. RÈGLES GÉNÉRALES Il est interdit de fumer, de manger ou de boire dans le laboratoire ou l espace prévu pour effectuer des expériences. Lavez-vous les mains avant de sortir du laboratoire. Travaillez de manière ordonnée, proprement et calmement. Si un produit se répand sur le sol ou sur la paillasse, nettoyez-le immédiatement. Nettoyez et rangez le matériel. N utilisez jamais un équipement ou un appareil sans connaître parfaitement son fonctionnement. MANIPULATION DU VERRE Protégez-vous les mains lorsque vous manipulez du matériel en verre. N utilisez pas du verre fissuré. PRODUITS CHIMIQUES N utilisez jamais un flacon de réactifs sans étiquette. Ne sentez, n inhalez, ne goûtez et ne touchez jamais les produits chimiques. Ne pipetez jamais avec la bouche. Mettez des gants et lavez-vous souvent les mains si vous utilisez des produits toxiques ou corrosifs. N approchez pas des récipients contenant des réactifs d une flamme. Ne chauffez pas des liquides inflammables. Transportez les flacons en les tenant par le fond, en aucun cas par l ouverture. ÉLIMINATION DES DÉCHETS Déposez dans des conteneurs prévus à cet effet et dûment identifiés le verre cassé, les réactifs toxiques, nocifs ou néfastes pour l environnement et les déchets biologiques. Ne jetez jamais des résidus solides dans l évier. En cas d accident, prévenez immédiatement l éducateur. Rappel : en cas de doute, veuillez consulter l éducateur. PRÉCAUTIONS SPÉCIFIQUES À PRENDRE LORS DE CET ATELIER Au cours de cette pratique, vous devez manipuler les réactifs en respectant les précautions courantes prévues pour la manipulation des produits chimiques. Seuls les produits présentant les degrés de danger suivants sont indiqués ci-dessous : PBS : toxique par ingestion, inhalation et contact avec la peau. Tween 20 : toxique par ingestion, inhalation et contact avec la peau. Irritant. Annexe II Références des réactifs NOM PBS Tween-20 CHK IGY, bagged (= ANTIGÈNE) RB ANTI-CHK, bagged (= PLASMA) GAR-HRP, bagged (= ANTICORPS SECONDAIRE) SUBSTRAT RÉVÉLATEUR RÉFÉRENCE P TAB P ML EDU EDU EDU EDU SOCIÉTÉ COMMERCIALE Sigma Sigma BioRad BioRad BioRad BioRad 20

21 Continuez vos recherches sur Xplore Health! Chercheurs ayant collaboré avec les contenus : Laura Puyol, chercheuse au CRESIB, ISGlobal. MIS AU POINT PAR Cet ouvrage est sous une licence Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Pour voir une copie de la licence, consultez le lien suivant :