ETUDES FONCTIONELLES SUR MODELES CELLULAIRES

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1 ETUDES FONCTIONELLES SUR MODELES CELLULAIRES UE2 - La cellule et les tissus Professeur Aksam Merched Laboratoire de Biologie Cellulaire, UFR de Pharmacie et INSERM U1053 (Groupe de Recherches pour l Etude du Foie) Bordeaux 2 COURS PACES

2 UE2- La cellule et les tissues Structure générale et programme fonctionnel de la cellule: 1. Etudes fonctionnelles sur modèles cellulaires (cours précédent) 2. Structure de la membrane plasmique 3. Fonctions membranaires Place du cours dans l UE2

3 1 UE2- La cellule et les tissues Structure générale et programme fonctionnel de la cellule: 1. Etudes fonctionnelles sur modèles cellulaires 2. Structure de la membrane plasmique 3. Fonctions membranaires Place du cours dans l UE2

4 Place du chapitre STRUCTURE DE LA MEMBRANE PLASMIQUE 1. Concepts de membrane plasmique 2. Composition chimique des membranes 3. Contribution de la composition chimique de la membrane plasmique à son architecture moléculaire

5 INTRODUCTION Définitions

6 La membrane plasmique La membrane plasmique est la frontière de la vie, la ligne de démarcation entre la cellule et son environnement. Elle présente une perméabilité sélective. La membrane plasmique se servent pas seulement à séparer la cellule du milieu externe, elle lui permet de remplir ses fonctions.

7 CYTOPLASME ET HYALOPLASME Le hyalopasme, ou cytosol, est le milieu biologique aqueux, plus ou moins visqueux, où s effectuent les réactions métaboliques de la cellule (hors noyau). Le cytoplasme est l ensemble de l intérieur de la cellule (hors noyau), comprenant le hyaloplasme et les organites délimités ou non par une membrane.

8 Universalité du terme membrane Toute cellule, procaryote ou eucaryote, animale ou végétale, est délimitée par une membrane plasmique. Mais, la membrane plasmique peut être doublée chez certaines: par une paroi chez certaines bactéries, par une paroi pecto - cellulosique chez certains végétaux supérieurs.

9 Biomembranes : membrane plasmique et membranes intracellulaires Si toute cellule est délimitée par une membrane plasmique, les cellules eucaryotes présentent aussi d autres membranes intracellulaires qui séparent le cytoplasme en différents compartiments appelés organites subcellulaires. Ces membranes sont appelées sous un terme général «biomembranes» Ce chapitre présente la structure générale des membranes, mais également les arrangements moléculaires particuliers au niveau des différentes membranes qui permettent de définir leur spécialisation

10 1/ Concepts de la membrane plasmique - évolution historique Modèle de bicouche lipidique de Gorder et Grender Modèle de «sandwich» de Davson et Danielli Modèle de mosaïque fluide de Singer et Nicolson

11 L évolution des concepts sur la structure membranaire Les scientifiques ont élaboré des modèles moléculaires de la membrane bien avant l ère de la microscopie électronique (1950): 1915, l analyse chimique de membranes des globules rouges a révélé une composition en lipides et en protéines. ~1926 Gorter et Grendel: hypothèse d une organisation membranaire en bicouche de phosphoglycérolipides. tête hydrophile eau Queue hydrophobe Cell Biology Pollard Earnshaw,Saunders Elsevier eau

12 Autres modèles de structure membranaire Modèle de Davson et Danielli (1943): bicouche était recouverte de protéines pour renforcer la résistance membranaire; modèle de «sandwich» Groupements polaires Chaines d acides gras Protéines de surface Les premières images de microscopie électronique (ME) montraient une organisation en: 2 lignes foncées séparées par un espace clair La membrane plasmique (MET) d un globule rouge apparait sous la forme de 2 bandes sombres séparées par une bande claire Structure trilamellaire

13 La structure membranaire 1970s: démonstration que les protéines traversent la bicouche lipidique: La microscopie électronique et le cryodécapage ont montré la présence de particules protéiques au sein de la bicouche lipidique. La technique de marquage chimique a montré que de nombreuses protéines traversent la bicouche

14 LA TECHNIQUE DU CRYODECAPAGE Application: cette technique permet de séparer les deux couches de la membrane plasmatique. Le microscope électronique révèle la structure interne de chacune des couches Technique: on plonge la cellule dans l azote liquide pour la congeler puis on la casse à l aide d une lame réfrigérée. Le plan de fracture suit souvent l intérieur hydrophobe d une membrane, ce qui divise la bicouche des phosphoglycérolipides en 2 couches distinctes. Les protéines membranaires demeurent entières dans l une ou l autre des couches TECHNIQUE Couche extracellulaire Lame Protéines Membrane plasmatique Couche cytoplasmique

15 Résultat du cryodécapage Ces moulages des membranes montrent les protéines membranaires («les bosses») dans les deux couches, ce qui prouve que ces protéines sont enchâssées dans la bicouche de phosphoglycérolipides RESULTATS Intérieur de la couche extracellulaire Intérieur de la couche cytoplasmique

16 Modèle de mosaïque fluide de la membrane 1972: Singer et Nicholson intègrent toutes ces données et proposent leur concept de mosaïque fluide où les protéines flottent dans une mer fluide de lipides. Révélation ultérieure de la structure tridimensionnelle de plusieurs protéines membranaires et transmembranaires, et un réseau de protéines cytoplasmiques qui limite la mobilité de plusieurs protéines transmembranaires.

17 2/ COMPOSITION CHIMIQUE DES MEMBRANES A. ETUDES IN SITU: DONNEES HISTOCHIMIQUES B. ISOLEMENT DE FRACTIONS MEMBRANAIRES C. LES PRINCIPAUX CONSTITUANTS DE LA MEMBRANE PLASMIQUE

18 2-A. ÉTUDES IN SITU - DONNÉES HISTOCHIMIQUES Intérêt et limites: Les études in situ et in vitro sont, historiquement, les premières à avoir permis de connaître la composition chimique des membranes plasmiques. Elles ont, très tôt, démontré la présence de: - lipides - protéines - glucides associés au protéines (glycoprotéines). Mais, les informations apportées sont limitées.

19 Histochimie et structures membranaires lipidiques Mise en évidence de la nature lipidique de la membrane Sur des algues, observations que les substances liposolubles pénètrent plus vite que les substances hydrosolubles. Mise en évidence de la position des lipides en «double couche» Les lipides extraits des membranes d hématies se dispersait à la surface de l eau en une monocouche qui occupent une surface double de celle des hématies.

20 Histochimie et structures membranaires protéiques La mesure des tensions superficielles membranaires chez les amibes montre des valeurs inférieures aux celles attendues pour des membranes constituées purement de lipides. Ces données suggèrent la présence de protéines associées aux lipides Etudes en cyto-électrophorèse de la migration des hématies soumises à des traitement enzymatique ont mise en évidence la présence des glycoprotéines Mise en évidence des polysaccharides des glycoprotéines par oxydation avec l acide périodique.

21 Le manteau cellulaire ou glycocalyx Biological Membranes, Harrison and Lunt, 2 ème édition

22 2-B. ISOLEMENT DES FRACTIONS MEMBRANAIRES Exemples de matériels membranaires Hématies Homogénats tissulaires Fibres myélinisées Cellules en culture

23 L HEMATIE, MATERIEL DE CHOIX POUR L OBTENTION DES MEMBRANES PLASMIQUES Les hématies fournissent un matériel privilégié pour l obtention de la MP: - il est abondant, - il est pur, pas de risque de contamination par d autres types de membranaires cellulaires, - Mais, il est limité à l obtention uniquement d un seul type de matériel membrane plasmique.

24 L hématie humaine mâture ne renferme ni noyau, ni organite Biologie et physiologie cellulaire, Berkaloff et Favard

25 Isolement des membranes plasmatiques des globules rouges

26 Membranes d hématie purifiées après centrifugation et lavage Biologie et physiologie cellulaire, Berkaloff et Favard

27 LES HOMOGENATS TISSULAIRES PERMETTENT L OBTENSION DE DIFFERENTS TYPES DE BIOMEMBRANES Seuls les homogénats tissulaires sont capables de fournir des fractions membranaires issues des différents organites sub-cellulaires. On donnera quelques exemples de données structurales comparatives des différentes biomembranes cellulaires.

28 La gaine de myéline, autour des axones, est un «concentré» de lipides membranaires La myéline: Spirale compacte de membrane plasmique de cellule gliale riche en lipides qui entoure certains axones en formant un gaine autour de ceux-ci (gaine de myéline). Cette gaine isole les axones les uns des autres et permet d'accroître la vitesse de propagation du message nerveux le long des fibres nerveuses.

29 LES CULTURES CELLULAIRES PERMETTENT L OBTENTION DE MEMBRANES PLASMIQUES ULTRA-PURES Des cellules cultivées, sur un support (boite ou micro-billes), subissent un choc osmotique, qui vide leur contenu cellulaire. Après lavage, les membranes sont détachées de leur support, constituant un échantillon de membrane plasmique ultra-pur, sans contamination. Le choix de plusieurs types cellulaires permet de comparer leur composition chimique. Lavage traitement Membrane ultrapure Choc osmotique

30 Critères de pureté (enzymes marqueurs spécifiques) Sauf dans quelques cas particuliers, l isolement d une fraction membrane plasmique s accompagne de risques de contamination d autres biomembranes. Evaluation qualitative et quantitative de la contamination d une fraction «membrane plasmique» par d autres types membranaires. Recherche de marqueurs d autres membranes.

31 2-C. LES PRINCIPAUX CONSTITUANTS MEMBRANAIRES -LES PROTEINES MEMBRANAIRES - LES LIPIDES MEMBRANAIRES

32 ASPECT QUALITATIF ET QUANTITATIF DE LA COMPOSITION CHIMIQUE DES MEMBRANES PLASMIQUES Les membranes cellulaires ont une structure et une composition chimique différente, mais relativement voisines. L étude de la composition chimique de la membrane plasmique va confirmer cette idée générale, mais va montrer de légères variations qualitatives et quantitatives entre les différentes membranes plasmiques et les biomembranes.

33 Composition chimique comparée de quelques membranes cellulaires

34 2-C. LES PRINCIPAUX CONSTITUANTS MEMBRANAIRES -LES PROTEINES MEMBRANAIRES -LES LIPIDES MEMBRANAIRES

35 GENERALITES SUR LES PROTEINES DE LA MEMBRANE PLASMIQUE La membrane plasmatique est un assemblage de diverses protéines insérées dans la matrice d une bicouche de phosphoglycérolipides. La membrane plasmatique et les membranes des différents organites possèdent chacune leur propre ensemble de protéines et celui-ci varie selon le type de cellule. Quant à leur organisation structurale, elles peuvent se situer à l extérieur de la membrane plasmique: elles sont dites protéines extrinsèques. Elles peuvent se situer à l intérieur de la membrane plasmique: elles sont dites protéines intrinsèques (= intégrées, intra-membranaires). Celles qui traversent la membrane sont dites transmembranaires.

36 PROTEINE TRANSMEMBRANAIRE A TRAVERSEE UNIQUE OU MULTIPLE Segment transmembranaire le plus souvent sous forme d hélice alpha stabilisatrice - Les protéines à traversée unique - Les protéines à traversées multiples

37 Structure d une protéine transmembranaire; bactériorhodopsine (une protéine de transport bactérien) côté extracellulaire Hélice a Fig. 7-8 côté intratracellulaire

38 DIVERSITE STRUCTURALE ET SPECIALISATION DES MEMBRANES PLASMIQUES Les protéines déterminent la plupart des fonctions spécifiques des cellules. La nature, le nombre et le pourcentage relatif des différentes protéines détermine la grande diversité structurale des membranes, conférant leur spécialisation et expliquant leur différence fonctionnelle. Plus une membrane est spécialisée, plus la diversité des protéines constitutives diminue (ex. 1 seule protéine du Réticulum Sarcoplasmique représente 90 % de l ensemble).

39 LES DIFFERENTES CATEGORIES DE PROTEINES MEMBRANAIRES Les différentes catégories structurales et fonctionnelles de protéines membranaires: - protéines de structure - protéines enzymatiques - protéines transporteuses - protéines réceptrices - protéines d adhérence (ou d adhésion) - protéines de reconnaissance Chaque catégorie de protéine sera abordée et illustrée brièvement dans la partie «Fonctions de la membrane plasmique» de ce cours.

40 Signaling molecule Enzymes Récepteur Transport ATP Activité enzymatique Signal transduction signalisation Glycoprotein Reconnaissance intercellulaire Adhérence intercellulaire (jonction) Fixation au cytosquelette et à la matrice extracellulaire Fig. 7-9

41 LES PRINCIPALES PROTEINES DE LA MEMBRANE PLASMIQUE Parmi les protéines majeures (= les plus abondantes), on distingue: des glycoprotéines, plus particulièrement riches en acide sialique, comme: 1. la glycoprotéine majeure (très riche en polysaccharides, 64%) ou 2. glycophorine, la mieux connue des protéines de la MP. Ex. de la protéine intra-membranaire avec 1 hélice alpha (voir schéma plus loin). 3. la glycoprotéine mineure (pauvre en polysaccharides, 7%)

42 Les protéines de structure: 1. la protéine bande 3 (1/4 des protéines de l hématie) de 930 AA. Protéine volumineuse, sous forme particulaire, intrinsèque, à 14 passages transmembranaires en hélice alpha. 2. les spectrines (dans les hématies, position particulière côté intracellulaire au contact de l endosquelette de l hématie). Les protéines enzymatiques: exemples: acétylcholinestérase, ATPase, etc.

43 snv.jussieu.fr CAS PARTICULIER DE LA MEMBRANE PLASMIQUE DE L HEMATIE Nature des protéines: transporteurs, canaux membranaires, enzymes, protéines structurales («charpente» du globule), molécules d adhésion ou récepteurs membranaires.

44 2-C. LES PRINCIPAUX CONSTITUANTS MEMBRANAIRES -LES PROTEINES MEMBRANAIRES -LES LIPIDES MEMBRANAIRES

45 LES LIPIDES MEMBRANAIRES a) Les lipides simples; circulants, rôle nutritionnel Glycérol, acides gras, triglycérides b) Les lipides complexes membranaires; constituants essentiels des membranes Les phospho-lipides (glycérophospholipides, sphingolipides) Le cholestérol

46 a- Lipides simples: glycérol et ses substitutions (triglycérides) Glycérol acide gras (acide palmitique) (a) Une des réaction de déshydration dans dans la synthèse d un triglycéride Les triglycérides: Un glycérol estérifié par 3 acides gras identiques ou différents. (Un acide gras (AG) est une longue chaine d hydrocarbures avec un groupement carboxyle terminal) (b) Molécule de triglycéride (triacylglycérol) Fig. 5-11

47 b- Lipides complexes: les substitutions complexes de glycérol Les glycérophosphatides (ou glycérophospholipides), 1 glycérol estérifié par 2 acides gras (AG) et une structure complexe, un phospho-amino-alcool (PAA). Si l amino-alcool est: la choline, le PAA est la phosphatidylcholine la sérine, le PAA est la phosphatidylsérine l inositol, le PAA est le phosphatidylinositol l éthanolamine, le PAA est la phosphatidyl éthanolamine

48 Structure d un glycérophospholipide (phosphatidylcholine) Queue hydrophobe Tête hydrophile Choline Phosphate Glycérol Acides gras Structure d une bicouche formée par l agglomération de phosphoglycérolipides Tête hydrophile Queue hydrophobe (a) Formule développée Fig (b) Modèle compact (c) Symbole des phosphoglycérolipides

49 Lipides complexes: Les substitutions de sphingosine les sphingolipides, avec, par exemple, un sphingosine estérifiée par 2 acides gras (identiques ou différents) et une structure complexe, un phospho-amino-alcool. Propriétés physico-chimiques voisines des glycérophosphatides Acide gras

50 LIPIDES COMPLEXES: CHOLESTEROL (malgré les apparences, molécule amphiphile) Eau Fig Pôle hydrophobe Pôle hydrophile Le cholestérol, un stéroïde dont le noyau hydrophobe s incère entre les queues hydrocarbonées des molécules de phosphoglycérolipides Cholestérol Eau

51 Effet de la composition lipidique sur la fluidité membranaire Les phosphoglycérolipides portant des queues hydrocarbonées insaturées (avec des liaisons doubles, ex. phosphatidylcholine) ne peuvent pas s entasser autant que les queues hydrocarbonées saturées et l espace créé entre ces dernières diminue les interactions hydrophobes, ce qui rend la membrane plus fluide.

52 Le cholestérol comme tampon thermique" de la membrane Le corps hydrophobe du cholestérol interagit avec les queues hydrophobes des glycérophospholipides. A des températures relativement élevées (37 C), il limite partiellement le mouvement des glycérophospholipides et diminue donc la fluidité membranaire. Mais comme il entrave aussi l entassement des phosphosglycérolipides, il abaisse le point de fusion des membranes. Par conséquent, le cholestérol peut être vu comme un «tampon thermique» de la membrane.

53 Variations de la composition chimique des biomembranes Toutes les membranes sont constituées de lipides et de protéines. Toutes les membranes ont une bicouche phospholipidique. La spécificité des membranes vient de leur composition en lipides et en protéines: Les lipides confèrent la variabilité de la fluidité membranaire. Les protéines confèrent la variabilité des fonctions spécifiques de la membrane

54 Variations de la composition lipidique des biomembranes Notion de polymorphisme membranaire Composition lipidique différente des deux hémi-membranes Répartition variable des lipides Répartition variable des phospho-aminolipides SM, Sphingomyelin; GS, glycosphingolipide; PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylethanolamine; PS, phosphatidylsérine. Cell Biology Pollard Earnshaw,Saunders Elsevier

55 ASYMETRIE DE LA COMPOSITION CHIMIQUE DES MEMBRANES Biologie moléculaire de la cellule, Alberts, 4 ème édition

56 Exemples de variabilité de la répartition des lipides membranaires

57 3/ Contribution de la composition chimique de la membrane plasmique à son architecture moléculaire

58 Les constituants membranaires Les constituants membranaires essentiels sont les lipides et les protéines. Toute membrane est en effet: Une bicouche phospholipidique avec des protéines intrinsèques ou extrinsèques Cette bicouche hydrophobe est exposée à l eau (milieu extracellulaire ou hyaloplasme)

59 ORGANISATION MOLECULAIRE D UNE MEMBRANE Interaction protéines lipides membranaires Deux types de protéines membranaires: 1. périphériques (ou extrinsèques). 2. transmembranaires (ou intrinsèques). Dans toutes les membranes, l interaction des lipides essentiellement hydrophobes avec des protéines doit respecter certaines règles;

60 Zone hydrophile Zone hydrophobe Modèle de Singer et Nicholson (1972) Zone hydrophile Les domaines polaires (avec des charges) des protéines doivent rester à l extérieur des régions hydrophobes des phospholipides de la bicouche membranaire Seule les domaines hydrophobes des protéines pourraient traverser la bicouche lipidique (organisation en hélice a hydrophobe)

61 Les différents modes de fixation des protéines périphériques Par l intermédiaire des séquences lipidiques ajoutées aux protéines après la traduction (séquence isoprénylée, myristoylée, ancre GPI) Via interactions électrostatiques avec les phospholipides Via insertion partielle dans la couche lipidique Indirectes à travers des liaisons avec d autres protéines membranaires

62 Le concept de la fluidité sur la structure membranaire Les membranes ne sont pas des structures rigides. La plupart des lipides peuvent dériver latéralement dans le plan de la membrane. Des études ont montrée que la diffusion latérale des lipides est un processus rapide, alors que le basculement d un côté de la bicouche à l autre est lent: Movement lateral (environ10 7 fois par seconde) Movement des phosphoglycérolipides bascule (environ une fois par mois)

63 Les protéines se déplacent elles? Expérience: Les chercheurs ont coloré les protéines de la membrane plasmique d une cellule de souris et d une cellule humaine avec 2 marqueurs différents, puis ils ont fusionné les cellules. A l aide d un microscope, ils ont en suite observé le comportement des marqueurs sur la cellule hybride: RESULATS Protéines membranaires Cellule de souris cellule humaine cellule hybride protéines entremêlées au bout d une heure Conclusion: la fusion des protéines membranaires d une souris et d un humain indique qu au moins quelques protéines membranaires se déplacent latéralement dans le plan de la membrane plasmatique.

64 ARCHITECTURE MOLECULAIRE DE LA MEMBRANE PLASMIQUE Toutes les connaissances: de la composition chimique des membranes, des interactions entre ces différents constituants, des corrélations entre ultrastructure et biochimie Ont permis à Singer et Nicolson de proposer leur modèle de mosaïque fluide qui reste l hypothèse la plus vraisemblable de la réalité structurale des membranes.

65 Le modèle de la mosaïque fluide de Singer et Nicolson (1972) Selon le modèle de la mosaïque fluide, la membrane est une structure fluide constituée d une «mosaïque» de protéines diverses incorporées à sa bicouche de phosphoglycérolipides ou fixées sur elle.

66 LES DIFFERENTS ETATS DE FLUIDITE D UNE MEMBRANE

67 LES RADEAUX LIPIDIQUES INTRAMEMBRANAIRES Dans la bicouche lipidique, ils existent des endroits où les lipides et les protéines ne se distribuent pas au hasard. Il s agit de micro-domaines lipidiques individualisés, soit très fluides (enrichis en phosphatidylcholine), soit peu fluides (enrichis en sphingolipides et cholestérol), appelés radeaux lipidiques. Présence de radeau membranaire riche en cholestérol et sphingolipides SM, Sphingomyelin; GS, glycosphingolipide; PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylethanolamine; PS, phosphatidylsérine. Cell Biology Pollard Earnshaw,Saunders Elsevier radeau

68 CONCLUSION GÉNÉRALE

69 CONCLUSION GENERALE SUR LA STRUCTURE DES MEMBRANES Le modèle de Singer et Nicolson semble le plus vraisemblable depuis les années 70, réactualisé sans cesse, à la lueur des connaissances biochimiques, ultrastructurales et physiologiques récentes. La membrane plasmique est une structure complexe dynamique, en perpétuel mouvement, passant par différents états d organisation structurale dépendants des différentes activités physiologiques.

70 Le modèle actuelle de la membrane plasmique d une cellule animale Fibres de la matrice extracellulaire Glycoprotein glucide Glycolipide Couche extracellulaire de la membrane Cholestérol Microfilaments du cytosquelette Protéines périphériques Protéine intramembranaire Couche cytoplasmique de la membrane