5.0 Méthodes spectroscopiques Infrarouge

Transcription

1 La technique: Absorption d énergie qui résulte en une excitation vibrationnelle (étirement et déformation) des liaisons chimiques à l état fondamental (S 0 ) État fondamental S 0 de la molécule SiO 2 Domaine de λ : 2500 à nm ( cm -1 ) Les différents groupements fonctionnels sur une molécule possèdent des bandes d absorption spécifiques. Ceci permet des études qualitatives structurales. v : états vibrationnels J : états rotationnels 1

2 Types de vibrations Vibration de déformation d angle Vibration d élongation rotation dans le plan cisaillement dans le plan balancement hors du plan torsion hors du plan élongation symétrique élongation antisymétrique 2

3 Types de vibrations Fréquences de vibration des groupements fonctionnels. Aussi appelé: - Fréquences de groupe 3

4 Types de vibrations Fréquences de vibration des groupements fonctionnels (suite) 4

5 Applications de l IR L IR classique (appareil dispersif) est de moins en moins utilisé. La FTIR (infrarouge à transformé de Fourier) est la technique moderne de choix, car elle permet une meilleure sensibilité, une résolution accrue et une vitesse d acquisition de données supérieure. Analyses qualitatives - Très utile dû aux fréquences de groupe qui permettent une caractérisation initiale des fonctionnalités du produit - Possibilité de construction de librairies pour recherche précise de structures connues. Le caractère unique du spectre IR d une molécule permet une identification très spécifique dans un mélange. 5

6 Applications de l IR Analyses quantitatives - Écarts à la loi de Beer-Lambert - Rayonnement diffus ε assez bas en IR - Pic étroits - fentes larges - rayonnement polychromatique - spectres complexes recouvrements facile - rayonnement parasite -l doit rester court dû aux interférences du solvant menant à une faible précision sur l absorbance - reproductibilité difficile erreurs importantes 6

7 Composantes en IR dispersif 7

8 Source Solide inerte chauffé ( K) émission corps noir émission IR - Lampe de Nernst: oxyde de terres rares - Lampe Globar: (Si-C) - Nichrome ou Rhodium - Arc de mercure - Tungstène -Laser CO 2 Échantillon - Près de la source car IR peu énergétique grande sensibilité -Support: pastilles transparentes en IR (NaCl, KBr) - Échantillon solide, liquide pur ou en solution [X] nécessitant un chemin optique l < 1mm ou 0,01. Composantes optiques - Solides polies et transparents Détecteur ( W 0,001 o C) - Transducteur de chaleur: thermocouple ou bolomètre - Transducteur pyroélectrique - Transducteur photoconducteur 8

9 Appareillage FTIR La composante la plus importante dans un FTIR est l interféromètre de Michelson. Un diviseur de faisceau et un miroir mobile permettent de générer un patron d interférence d onde qui mène à des analyses plus sensible qu en IR classique. Interférogramme KBr TRANSFORMÉ DE FOURIER 9

10 Analyse qualitative de molécules organiques Spectre IR du formaldéhyde 10

11 Médicament Spectre IR du tartrate d ergotamine Biomolécule Spectre IR de la bilirubine 11

12 Acides aminés Spectre IR de D-threonine Spectre IR de L-threonine ponts H Interactions intramoléculaires différentes 12

13 Peptides Spectre IR de Ala-Gly Spectre IR de Ala-Ala 13

14 Les techniques en IR IR proche ( cm -1 ) Réflexion totale : granulométrie et détermination de l humidité (blé, amidon, protéine, cellulose) IR moyen ( cm -1 ) 1- Réflexion diffuse : utilisé pour l analyse de de poudres solides 2- Réflexion totale atténuée: solides à faible solubilité, films, pâtes, fils, adhésifs 3- Photoacoustique: analyses quantitatives des solides, liquides avec l très faible IR lointain ( cm -1 ) Étude des espèces inorganiques (déformation métal-ligand). Informations concernant les énergies du réseau cristallin, 14

15 Analyse de protéines par FTIR La spectroscopie infrarouge FTIR a contribué à l'analyse de structures protéiques dans le passé mais n'était pas très attrayante aux chercheurs puisqu elle ne peut pas révéler un image 3D telle la cristallographie et la spectroscopie RMN. Cependant, les restrictions de ces dernières méthodes donne un avantage sérieux à la FTIR. Rayon X - besoin de cristaux RMN - petites protéines (MM ~ kda) - solubilité dans l'eau FTIR - analyses en solution aqueuse ou autres - aucune restriction sur la MM - concentration nécessaire ~ 1 mm 15

16 Analyse de protéines par FTIR Les protéines possèdent des milliers d atomes et par conséquents des milliers de modes vibrationnels. Leur analyse par IR est difficile mais permet plusieurs types d études : L'analyse de la structure secondaire et la classification des protéines Interactions tertiaires des chaînes latérales d'acides aminés Stabilité thermique et chimique de protéines et d ADN / ARN Analyse structurale d ADN / ARN Interactions protéine / protéine et protéine / ADN Dénaturation (unfolding / refolding) et agrégation de protéines Études de processus cinétiques thermiquement et photochimiquement induits 16

17 a.a. vibration cm -1 Analyse de la structure 2 aire de protéines par FTIR Asp -COO st as COOH st 1716 Glu -COO st as 1560 La séquence d acides aminées et les caractéristiques structurales de la protéine d intérêt sont deux facteurs majeurs affectant directement l absorption IR. Le manque de résolution des bandes dans les spectres nécessite une déconvolution des signaux caractéristiques afin de reconnaître la contributions des différentes structures adoptées par les protéines. Les acides aminées listés à droite sont les majeurs contributeurs à l absorptions dans la région d intérêt appelé amide I. -COOH st 1712 Arg -CN 3 H + 5 st as 1673 st s 1633 Lys -NH + 3 bd as 1629 bd s 1526 Asn -C=O st NH 2 bd 1622 Gln -C=O st NH 2 bd 1610 Tyr ring-oh 1518 ring-o 1602 His ring 1596 Phe ring 1494 C -terminal -COO st as COOH st 1740 N -terminal NH3+ bd as 1631 bd s NH 2 bd

18 Analyse de la structure 2 aire de protéines par FTIR Il existe 9 régions d absorption caractéristiques des structures protéiques. Ils sont nommées bandes amides A, B et I à VII. Elles représentent les types de vibrations majeurs présents: C=O stretch, N- H stretch, N-H bend et C-N stretch. Région d intérêt: Amide I La région la plus utile pour la caractérisation structurale est la bande amide I ( cm -1 ) qui est surtout constituée (70-80%) des vibration C=O provenant du squelette protéique. Une analyse mathématique de cette dernière permet de quantifier les structures 2 aire constructrices de la protéines. 18

19 5.0 Méthodes spectroscopiques Analyse de la structure 2 aire de protéines par FTIR Il est difficile de retirer de l information directement de la courbe expérimentale amide I (en noir). Il faut nécessairement appliquer une méthode de déconvolution afin d en extraire les constituants qui nous intéressent pour l analyse structurale. La méthode la plus utilisée est celle d une somme de fonctions gaussiennes représentants chacune une caractéristique structurale. La spectroscopie différentielle peut aussi être employée. région désordonnée cm -1 feuillet β région désordonnée hélice α tours β feuillet β région désordonnée

20 Exemple d analyse FTIR : Lysozyme Pour commencer, une déconvolution du spectre FTIR est réalisée donnant les gaussiennes qui peuvent être assignées aux structures. La réponse totale (l aire) de chaque gaussienne peut être calculé de manière géométrique (AxB). A B Pic Aire Structure feuil-β feuill-β helix-α tour-β tour-β désord. tot.= A 1/2 20

21 Exemple d analyse : Lysozyme (suite) Avec ces résultats, il devient possible de calculer le pourcentage de chaque structure dans la protéine et de les comparer avec l analyse structurale dérivée des études cristallographique par rayon X. Pic Aire Structure FTIR Rayon X feuil-β feuill-β (jaune) 11% 19% helix-α (rouge) 45% 45% tour-β tour-β (bleu) 37% 23% désord. (gris) 7% 13% tot.= % Structure de la lysozyme De toute évidence, il existe un écart entre les résultats de ces deux méthodes. Cependant, il ne faut pas oublier que l analyse par rayon X se fait sur un cristal solide tandis qu en FTIR la protéine est en solution. La structure n est par tout à fait la même dans ces deux états. 21

22 Exercices recommandés Méthodes spectroscopiques Notes de cours WEB Harris 6 ème édition: Chapitre 18, p. 429, Problems No. 1-4, 6, 7, 10, 16 Chapitre 19, p. 451, Exercises No. A et Problems No. 6(sans excel), Chapitre 20, p. 490, Problems No. 3, 5 Skoog, West, Holler 7 ème édition: Chapitre 22, p. 524, Questions et problèmes No. 2(a-c, g, i-k, n-p), 3-10, 12, 14, 16 Chapitre 23, p. 555, Questions et problèmes No. 1, 11, 18 Chapitre 24, p. 598 Questions et problèmes No. 7 et 9 Chapitre 25, p. 609 Questions et problèmes No. 1-7 Exercices supplémentaires qui suivent 22