Mutag6nkse de la proteine Vpu du virus de I'immunod6ficience humaine de type 1

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1 Mutag6nkse de la proteine Vpu du virus de I'immunod6ficience humaine de type 1 Par Jacques Friborg jr. DCpartement de microbiologie et immunologie Facult6 de mddecine Thtse prdsende 2 la Facult6 des hdes supdrieures en w e de l'obtention du grade de Philosophia: Doctor (Ph.D.) en microbiologie et immunologie Janvier, 1996 "Jacques Friborg jr., 1996

2 National Library 1*1 of Canada Acquisitions and Bibliographic Services Bibliotheque nationale du Canada Acquisitions et services bibliographiques 395 Wellington Street 395, rue Wellington Ottawa ON KIA ON4 Ottawa ON KIA ON4 Canada Canada The author has granted a nonexclusive licence allowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distriiute or sell copies of hidher thesis by any means and in any form or format, making this thesis available to interested persons. The author retains ownership of the copyright in hidher thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fiom it may be printed or otherwise reproduced with the author's permission. L'auteur a accord6 une licence non exclusive pennettant a la Bibliotheque nationale du Canada de reproduire, prgter, distriiuer ou vendre des copies de sa these de quelque madre et sous quelque forme que ce soit pour meme des exemplaires de cette these a la disposition des personnes int6resstes. L'auteur conserve la propriete du droit d'auteur qui protege sa &&e. Ni la these ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent &re imprimes ou autrement reproduits sans son autorisation.

3 Universite de Montr6al Facult6 des 6tudes sup6rieures Cette thhe intitulbe: Mutag6nbe de la proteine Vpu du virus de I'immunod6ficience humaine de type 1 prksentk par: Jacques Friborg jr. a CtC Cvalu6 par un jury composb des personnes suivantes: Dr Daniel Lamarre, president-rapporteur Dr ~ ric A. Cohen. directeur de recherche Dr Louise Poulin, membre du jury Dr Marc Wainberg, examinateur externe TMse acceptde le: 1 2. \=w

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5 Le gkne vpu code pour une phosphoprotkine membranaire de 80 h 82 acides arninis unique au cycle rkplicatif du viurs de I'imrnunodificience humaine de serotype 1 (VM-1). Bien que la proteine Vpu ne soit pas esserttielle pour la replication in vitro, elle pourrait jouer un r61e dans la r6gulation de l'expression virale. Au cours de I'infection par le VIH-1, le reliichement de la prog6nie virale peut etre reduit de 10 fois dans les souches vpu-. Il semble que Vpu soit impliquie dans I'assemblage et/ou le bourgeomement des particules virales de la surface des cellules infecdes. De plus, les effets pathogenes du virus en culture sont retard& lors de l'expression de Vpu. Enfin, de re'centes etudes ont montr6 que cette prodine pouvait dgstabiliser les complexes intracehlaires capable de se former entre le prkcurseur gp160 des glycoprotkines d'enveloppe virale et le recepteur CD4, en induisant la d6gradation spdcifique de ce dernier dans le riticulum endoplasmique. L'apport fonctionnel de Vpu dans la propagation du VIH-1, tant in vitr~ que vivo, reste jusqu'2 ce jour knigmatique. Les objectifs de ce projet de doctorat consistent B identifier le(s) domaine(s) actif(s) de Vpu irnplique(s) dam l'activid biologique de la prodine. Dans un but ultime, nous tenterons de caracte'riser les diverses fonctions de Vpu afin de mieux cerner son mode d'action au cours de I'infection par le VIH-1. La presence de Vpu pourrait en partie ttre responsable de la disshination plus rapide du VIH-1 face h celle observie avec le VIH est donc important de dkfinir les aspects structuraux et fonctionnels de la protdine afin de developper une approche prbventive dans le contr6le de cette pande'mie. Pour delimiter des regions et/ou des sequences de Vpu essentielles B son activit6 biologique, nous avons utilis6 des techniques de mutag6n&se dirigke et &amplification d'adn g6nomique par PCR ("Polymerase Chain Reaction") afin d'introduire des mutations spkcifiques dam le gtne vpu. Ces genes muds ont par la suite tt6 ins&& dans un clone molkculaire infectieux du VIH-1, autrement isoginique, dans le but d'entamer des analyses de replication virale dam divers syst&mes cellulaires in vitro.

6 Dans un premier temps, nos rbsultats dkmontrent que la phosphorylation de Vpu est essentielle B l'activid biologique de Ia proteine au cours de l'infection virale. En effet, Ies substitutions ponctuelles ou combides des dsidus serine en positions 52 et 56, identifies comme les sites de phosphorylation de Vpu, abolissent la capacitd de la proteine B retarder les effets cytopathiques du VIH-1 en culture. En revanche, ces mutations n'ont eu aucun impact majeur sur la propridd que poss&de Vpu de faciliter le relfichement de virions matures. Les sites de phosphorylation de Vpu sont localisies dans une r6gion C-terminale hautement conservde qui pourrait renfermer I'un des domaines actifs de la proteine. Par ailleurs, l'introduction de mutations dam l'extrbrniti N-terminale de Vpu a permi de montrer que cette rkgion renferme non seulement le domaine d'ancrage de la proteine, mais prbsente bgalement des d6terminants n6cessaires 2 sa capacit6 de faciliter le reliichement de particules virales. Ainsi, nos observations suggirent fortement que Vpu peut agir distincternent dam la cellule infectke afin d'optimiser la replication du VH- 1. Finalement, nous avons proced6 A une etude exhaustive du phhomkne de degradation de la molt5cule CD4 observd lors de I'expression de Vpu afin de mieux cemer son made fonctionnel. L'ensemble de nos rbsultats demontrent clairement que Vpu est capable d'interagir avec la mol6cule CD4 dam le rcticulum endoplasmique. Toutefois, cette liaison n'est pas suffisante pour engendrer la protdolyse de celle-ci. La phosphorylation de Vpu semble moduler la formation de complexes VpuKD4 mais pourrai t egalement activer le(s) m&anisme(s) mol&ulaire(s) ntcessaire(s) au processus. D'autre part, notre analyse de mutagcn&se sur la queue intracytoplasmique de CD4 a rt5vel6 que cette rdgion prgsente des determinants confdrant ii la moltcule sa sensibilite au mode d'action de Vpu. En resume, l'integritb d'une structure secondaire en alpha- hclice predite de se former dam la queue intracytoplasmique de CD4 apparait importante dam la capacite de liaison de Vpu et au processus subsequent de degradation de la molecule.

7 TABLE DES ~~ATI&Es PAGE TlTRE IDENTIFICATION DU.JURY SOMMAIRE TABLE DES MATI~RES LISTE DES TABLEAUX LISTE DES FIGURES LISTE DES AB&VIATIONS D~DICACE REMERCIEMENTS Page xvi CHAPITRE 1 REVUE DE LA LITT&ATURE. Le virus de 1'immunodCficience humaine. Le VM: un rktrovirus pathoghe chez I'homrne ~tiolo~ie du syndrome d'immunodeficience humaine Morphologie du VIH Organisation gbnomique du VM Cycle rdplicatif du VM- 1. La mol6cule CD4: principal rt5cepteu.r cellulaire du VIH Caractkristiques gen6rales de la rnol&ule CD L'interaction entre la gp120 et la mokule CD4: une liaison de haute afedt Rigulation de I'expression de la mol&uie CD4 par le VM- I. Les glycoprot6ioes d'enveloppe du VIH Structure et synthese des glycoprotkines de I'enveloppe virale. Les protkines de structures du VIH Structure et synthtse des protdines Gag du VM La machinerie enzymatique du WH-1. Assemblage et maturation du VM-1.

8 vii 6. Les effets cytopathiques du VM La proteine Vpu du VIH Synthbe de la prodine Vpu Le r6le de Vpu dam le cycle replicatif du VM-I Vpu augmente le relfichement des particules virales Vpu diminue les effets cytopathiques du VM Vpu degrade sp6cifiquement la molccule CD4. 8. Le projet de recherche. Article 1 : Functional analysis of the phosphorylation sites on the human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein. Anicle 2: Structural and functional anaiysis of the membrane-spanning domain of the human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein. Article 3: Degradation of CD4 induced by human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein: a predicted alpha-helix structure in the proximal cytoplasmic region of CD4 contributes to Vpu sensitivity. CHAPITRE 5 Article 4: Structural requirements for the binding of the human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein to the cytoplasmic domain of CD4.

9 viii CHAPITRE 6 Discussion. 157 CKAPITRE 7 Conclusions et perspectives. CHAPITRE 8 B ibliographie.

10 LISTE DES TABLEAUX Page Tableau 1 : Fonctions et description des protdines viraies du VIH- 1. Tableau 2: Mdcanismes possibles ii l'origine des effets cytopathiques du VIH-I ou de ses protbines virales. CHAPITRE 2 Tableau 1: Effect of Vpu mutants on the level of Env glycoproteins at the cell surface.

11 LISTE DES FIGURES Page Figure 1: Figure 2: Figure 3: Figure 4: Figure 5: Figure 6: Figure 7: Figure 8: Figure 9: Reprksentation schdmatique des diffkrents stades de l'infection par le VIH- 1. Representation sch6rnatique du VM- 1 et de son organisation g6nomique. Cycle rdplicatif du VM- 1. Representation schtmatique de la mol6cule CD4 et de la tyrosine kinase p56fck. Maturation de la progenie virale. Analyse irrrmunobiochimique de la proteine Vpu au cours du cycle rbplicatif du VIH- 1. Reprdsentation sch6matique de la protiine Vpu du VIH- 1. Schema reprksentant le relichement de particules virales i la surface des cellules infectees. La formation de syncytium au cours de l'infection par le VIH- 1 de cellules CD4+. Figure 1: Figure 2: Figure 3 : Mutations introduced into the vpu dodecapeptide sequence of m-1. Replication of vpu mutant proviruses in MT4 cells. Viral protein expression of vpu mutant proviruses in HeLa cells.

12 Figure 4: Figure 5: Effects of Vpu mutants on HIV-1 cytotoxicity. Effect of Vpu mutants on syncytium formation. Figure 1: Figwe 2: Figure 3: Figure 4: Figure 5: Figure 6: Figure 7: Mutagenesis of the predicted 8 1 amino acid Vpu protein. In vitro translation of Vpu mutants in presence of canine pancreatic microsomal membranes. Expression of wild-type and mutated Vpu proteins. Effect of mutations in the N-terminal hydrophobic region of Vpu on the enhancement of virion release. Effect of mutations in the N-terminal hydrophobic region of Vpu on CD4 degradation. Effect of mutations in the N-terminal hydrophobic region of Vpu on HIV- 1-mediated cytotoxicity. Structural and functional analyses of the Vpu protein. CHAPITRE 4 Figure 1 : Figure 2: Figure 3 : Figure 4: Effect of deletion of the cytoplasmic domain of CD4 on Vpu-induced degradation. Sensitivity of CD4 cytoplasmic domain substitution mutants to Vpu-induced degradation. 127 Effect of substitution mutations in the proximal cytoplasmic region of CD4 on Vpu-induced degradation. 127 Effect of deletion and substitution mutations in the cytoplasmic domain of CD4 on the predicted alpha-helix conformation. 128

13 CHAPITRE 5 Figure 1 : Figure 2: Figure 3: The formation of Vpu/CD4 complexes in the ER: phosphoacceptor sites of Vpu modulate the binding to CD4 molecules. Effects of mutations introduced in the cytoplasmic tail of CD4 on the capacity to form Vpu/CD4 complexes. 152 A putative a-helix in the proximal portion of the cytoplasmic tail of CD4 is required for the stability of Vpu/CD4 complexes. 154 CHAPITRE 6 Figure 1: Reprbsentation schkmatique du transit intracellulaire de la protiine Vpu du VIH Figure 1: Representauon schhatique des domaines actifs de la protcine Vpu du VIH- 1,

14 xiii a AcM ADN Ag ARN ARNm ARNt Gsn ATP BFA C CD cm CMH CMM CYS D DRB Glu gp41 gp120 gp160 His k kda Alpha Anticorps monoclonal Acide dcsoxyribonucl~ique Acide ribonuclkique Acide ribonucl6ique messager Acide ribonuclcique de transfert Adknosine triphosphate Brkfeldine A Rkgion constante Marqueur de differenciation ou "Cluster of differentiaton Complexe majeur &his tocompatibilitd "Canine Microsomal Membranes": Membranes microsomales canines Acide glutamique Glycoprot6ine transmembranaire de l'enveloppe vide GlycoprotCine de surface de l'enveloppe virale Pr6curseur polypeptidique de l'enveloppe virale Histidine Kappa Constante de dissociation

15 xiv LTR To 'Pi PH RE Ser SIDA Thr v VIH (1 ou 2) "Long Terminal Repeat": Longue dquence r6pktitive Pourcentage Orthophosphate inorganique Potentiel hydroghe R&iculum endoplasmique Stkine Syndrome de l'immunod6ficience humaine Thrkonine Region hypervariable Virus de 11immunodc5ficience humaine de s6rotype 1 ou 2

16 A mes parents et P mon friire qui m'ont encourag6 et support6 tout au long de mes travaw

17 xvi Je voudrais exprimer ma tr&s grande reconnaissance A I'endroit du Dr Eric A. Cohen pour son excellente direction. Je tiens B le remercier particulitrement pour llintbr& et le dynamisme qu'il a su rt5flkter tout au long de ce projet de recherche et qui ont kt6 des plus motivateurs. Les prtcieux conseils scientifiques et les nombreux encouragements qu'il m'a prodigut5 ont 6tt trh apprkcibs ii maintes reprises. Tant au niveau de l'enseignement qu'au niveau humain, cette &ape de mon apprentissage a 616 des plus enrichissantes. Je le remercie dgalement pour m'avoir permis de participer B de nombreux congr2s nationaux et intemationaux et pour m'avoir encourag6 A poursuivre un stage post-doc toral l'institut medicale Howard Hugues de 11universitt5 du Michigan. J'adresse rnes remerciements au Dr. Serge Montplaisir, directeur du dkpartement de rnicrobiologie et immunologie de la facult6 de medecine de 11universit6 de Montrkal, pour m'avoir conseiller dans mon choix de laboratoire d'acceuil et pour avoir accept6 ma candidature au programme de doctorat. Je remercie kgalement le Dr. Guy Lemay, professeur-chercheur au dkpartement de rnicrobiologie et immunologie de la facult6 de mddecine de 11universit6 de Montrkal, pour son support tout au long de mon doctorat et sa contribution au cours de discussions d'ordre scientifique. Mes remerciements s'adressent aussi ii toute i'tquipe du Dr. Cohen dont la camaraderie a toujours 6t6 omniprksente tant dans les meilleurs que dans les plus dues moments. Je remercie en particulier Sylvie Beaulieu, Xiao-Jian Yao, Claude LavaMe et Azim Ladha avec qui j'ai entamt mon doctorat et dont la prdsence et I'amitid ddvoil6e ont 6t6 grandement apprdcides.

18 xvii Je tiens B remercier Nash G. Daniel, mon protege au cours de nombreux stages d1&6 et qui maintenant vole alldgrement de ces propres ailes. Je lui souhaite les plus belles dussites dam son projet de maltrise et une continuit6 qui saura le satis faire. J'adresse des remerciements sinctres ii Carole Danis, Janique Forget, Dominique Bergeron, Gary Pignac-Kobinger et Mabrouck Taoufik qui ont subit mes alkas et qui ont bt6 des amis(es) proches au cows de mon doctorat. Je tiens aussi ii remercier d'excellents compagnons de travail mais avant tous des amis: Florent, Ramu, Serge, Robert, Jean-Philippe et Nie. Je dgsire souligner et remercier Johanne Mercier, Fran~oise Boisvert, Nicole Rougeau et Angelo Tiganos pour leur amiti6, leur patience et leur assistance technique des plus apprdci6e dam Ie laboratoire, Je remercie dgalernent Serge Sdndchal pour son assistance technique en cytofluomktrie en flux. Je voudrais tdmoigner ma reconnaissance B toutes les personnes qui ont 6t6 associies de prh ou de loin ii la r6alisation des publications obtenues au cours de mon doctorat et specialement aux organisrnes suivants pour leur soutien financier: - Programme national de recherche et d6veloppement en matibe de sate (PNDRS) - L'universitk de Montrdal Je tiens findement B remercier et ii dkdier cette these a mes parents, Jacques Sr. et Marie-Claude, et ik mon petit fdre, Jean-Claude qui m'ont soutenu et encourage tout au long de mes dudes.

19 CHAPITRE 1 Revue de la littkrature

20 Le virus de I'immunodCficience hurnaine. Le virus de I'immunodkficience humaine (VTH), l'agent infectieux responsable du syndrome de I'immunodificience acquise (SIDA), est un rctrovirus cytopathoghe appartenant 2 la sous-famille des Lentivirinae. Les lentivirus sont associees k des maladies d6g6niratives Cvolution lente affectant gknkralement les systiimes imunitaire et nerveux de 11h6te. Depuis de nombreuses annees, des virus tel le virus Visna-maedi du mouton ont CtC assocics 3 ce type &affections chez l'animal. On observe maintenant l'tmergence de rctrovirus humain dont le prototype est le VIH. Aujourd'hui, la classification exhaustive des rktrovirus est surtout bas6 sur leurs morphologies en rnicroscopie 6lectronique et particuli2rement leurs modes de rkplication. Comme tous les rctrovirus, le VIH est un virus enveloppt5, surmonti de spicules entourant la nuclkocapside virale. La particule virale infectieuse contient deux moi&cules d'arn gcnomique monocathaire qui lors de I'infection pourront &re transcrites en un ADN bicatenaire afin de s'integrer dam le rnatkriel gcn6tique de la cellule. Par contre, outre les gknes gag, pol et env responsables de la formation de la particule virale, le VIH posskde une combinaison complexe de ghes additionnels dits "auxiliaires" qui lui confere I'un des modes d'infection et de replication des plus Cnigmatiques. Le VIH jusqufk ce jour fait l'objet d'ctudes des plus intensives. Afin de mieux comprendre la pathologie du SIDA, il est donc primordial de bien dbfinir et caracteriser les principaux acteurs de cette veritable pandimie.

21 1. Le VIH: un r6trovirus pathoghe chez I'homme ~tiolo~ie du syndrome de I'immunod6ficience humaine. Au debut des annces 80, le centre de contr6le des maladies (CDC: "Centers for Disease Control") note une augmentation de frequence inexpliquee de certaines affections rares. On rapporte plusieurs formes de pneumonies causees par le protozoaire Pneumocystis carinii. Dam d'autres cas, une forme particulii5re d'une tumeur de la peau est diagnostiquee, le sarcome de Kaposi. Ces sympt8mes semblent etre le resultat d'un ddsordre commun, un &at d'immunosuppression scv&re chez les sujets atteints. En 1982, le CDC reconnut l'existence d'une nouvelle maladie d6sormais connue sous le nom du syndrome de I'imrnunod~ficience hurnaine (SIDA). Ce n'est que trois ans aprh son apparition que l'agent etiologique du SIDA est is016 par l'iquipe du professeur Montagnier de l'institut Pasteur en France A partir de cellules ganglionnaires d'un sujet atteint (Barre-Sinoussi et al., 1983; Montagnier et al., 1984). Cet agent infectieux qui poss$de toutes les caractkristiques d'un r6trovirus fut nomme LAV ("Lymphadenopathy- associated virus"). Au cows de la meme annee, l'equipe de Robert Gallo aux ~tats-~nis fit la dkouverte d'un virus genetiquement apparent6 B un r6trovirus responsable d'une leuc6mie de type T (Gailo et al., 1984) qu'il dksigne HTLV-UI ("Human T-cell lyinphotropic virus type IT). Subs&pernment, plusieurs groupes (Gallo et al., 1984; Montagnier et al., 1984; Levy et al., 1984) d6montr5rent qu'un seul rktrovirus etait responsable du d6veloppement du SIDA. Ce virus resut l'appelation de virus de l'immunodkficience humaine de type 1 (VIH- 1) par le cornit6 international de taxonomic des virus. Par la suite, un second virus apparent6 au WI-1, le VIH de serotype 2 (WI- 2), fut is016 chez des individus dlafrique de l'ouest (Clavel et al., 1986). Bien que l'organisation genornique r6we l'existence d'une parent6 entre le VIH- 1 et le VM-2, I'homologie des proteines virales n'est de I'ordre que de 50 A 60%. Aujourd'hui, le SIDA a pris des proportions catastrophiques Zi travers le monde. L'organisation mondiale de

22 la sate (WHO: "World Health Organization") estime qu'environ 19 millions d'individus ont it6 contamint5s par le VDI-1 depuis Ie dibut de cette pandirnie. Jusqu'h ce jour, plus de 2 millions d'individus s6ropositifs ont developpk le SIDA, et la plupart en sont morts. Le VIH-1 se propage principalement par les voies genito-urinaires Iors de relations sexuelles, par transmission materno-fetale et par transmission sanguine. L'infection par le VIH-1 se caracterise initialement par une courte p&iode de rdplication virale intense (figure 1). Au cours des mois et des annces qui vont suivre, le systirne immunitaire parvient A mdtriser la vir6mie. Durant cette phase asymptomatique de la mdadie qui peut durer entre deux A dix ans, il est difficile de detecter ou d'isoler le virus dam le sang des personnes atteintes. Cette longue periode de "latence clinique" n'est toutefois pas le reflet d'une inactivitk virale. La rkplication du VIH-1 est des plus dynamique tout au long de l'infection dam des tissues Iymphoi'des telles les ganglions lymphatiques et dam les macrophages (Pantdeo et al., 1993; Weiss et al., 1993). Recemment, il a 6t6 dernontrc5 qu'au cows de cette phase asyrnptomatique, le VIH-1 se replique continuellement de maniire active chez les individus atteints (Wei et al., 1995; Ho et al., 1995). Ll semble exister un kquilibre constant entre l'infection de novo des populations cellulaires, la dplication virale et le renouvellement des cellules dktruites par le virus. Le VIH-1 proc*de donc B une destruction silencieuse et gradueile des principaux acteurs de l'immunid Zi mediation cellulaire, les lymphocytes T auxiliaires, privant I'organisme de ses mecanismes de defense. Bknificiant ainsi du deficit immunitaire, de nouvelles souches virales, issues du taux eleve de r6plication et de la grande variabiiit6 genctique du VM- 1, pourront se propager sans que l'organisme puisse contraler leur disskmination. Une chute irr&ersible du nombre de lymphocytes T circulants et des troubles neurologiques deviendront alors des symptames apparants de 1'6volution de la maladie.

23 Infection Phase ARC SIDA aigiie asymptomafimafique Infection virale Figure 1. Reprbentation schhatique des diff&-ents stades de I'infection par le VIH-1. Avant la s6roconversion, on peut noter une courte piriode - de rkplication virale intense (-). Au cours des mois et des annkes qui vont suivre, la virernie est dduite A un faible niveau (phase I). Pendant cette pbriode, le nombre de lymphocytes CD4+ circulants (----.) chute progressivement. En revanche, le nombre de cellules CD8+ (----) est devi tout au long de la phase asymptomatique. On observe par la suite une seconde phase de replication vide intense (phase 2) et l'apparition des premiers symptdmes associt5s la maladie. Les celtules CD8+ ( ) qui ont un r6ie jouer dans ta rkponse anti-virale vont disparaitre. C'est l'installation du dkficit immunitaire et la progression vers le SIDA. (modifike de la rdf6rence Levy, 1988)

24 Par ailleurs, on observe chez I'individu dipourvu d'un systsme immunitaire efficace, la proliferation de nombreux autres micro-organismes, dont Pneurnocystis carinii et Mycobacterium avium, provoquant de nornbreuses infections opportunistes qui peuvent s'averer fatales (revue par Nelson et al., 1990). Il est clair que le VIH-1 a diveloppi de nombreux strataghes afin de survivre et de pouvoir se multiplier. Les mdcanismes par lesquels le VIH-1 induit une dkstruction progressive du sytkme immunitaire e t dans certains cas, du s yst&me nerveux, demewent encore enigmatiques Morphologie du VIH-1. L'analyse en microscopic dlectronique du VM-1 mature laisse per~evoir un c6ne dense cylindrique recouvert d'une enveloppe lipidique acquise au cours du bourgeonnement 2 la membrane plasmique de la cellule infectde. Sa morphologie est celle d'un ritrovirus (famille retroviridae) membre de la sous-famille des lentivirus (lentivivirirrae). La particule virale enveloppee poss2de un diamktre d'environ 100 nm i la surface de laquelle apparaissent de multiples (72 unitis trimdriques ou t&tram&iques) projections en fome de spicules, les glycoprotdines d'enveloppe virale (gp 120 et gp4 1 ) (figure 2). Le c6ne ou la capside virale est en grande partie composie de protiines structurales qui sont codties par le gene gag. La matrice interne de la capside est constitube de la proteine myristylde p17gag, tandis que la protdine p24gag, composante majeure de la capside, donne ii la particule sa fonne de csne excentrique. La particule virale infectieuse posside deux moldcules identiques d'arn monocatinaire d'environ 9.3 Kb qui sont etroitement associkes aux prodines de la nucldocapside (p9gag).

25 Figure 2. Reprkentation schkmatique du VIH-I et de son organisation gcnornique.

26 De plus, le matiriel nicessaire B la replication du VIH-1 lors d'infection subsequente sera entraher au cours des processus de maturation, soit: un complexe enzymatique form6 de la transcriptase inverse, d'une protease et d'une intkgrase, toutes d'origine vide (Gelderblom, 199 1; Stevenson et al., 1992). On retrouve kgdement un ARN de transfert (ARNt) cellulaire codant pour une lysine, qui servira d'amorce au processus de ritrotranscription virale (Barat et al., 1989; Coffin, 1990). Findement on retrouve la proteine Vpr, la seule protiine accessoire du VM-1 incorporie la particule virale (Cohen et al., 1990). Son incorporation est mkdii par une interaction spicifique avec le domaine p6gag du prkcwseur polypeptidique Pr55gag (Paxton et al., 1993; Kondo et al., 1995; Checroune et al., 1995). Par ailleurs, au cours du bourgeonnement, la particule virak entrdinera avec elk des protcines cellulaires prksentes sur la membrane plasmique de la cellule h8te. Ainsi, en fonction de la cellule infectee, on peut retrouver sur Ie VM-1 des antiggnes (Ag) de classe I et de classe li du complexe majeur d'histocompatibilitt5 (CMH) (Gelderblom et ai., 1987). Tandis que les glycoprotiines d'enveloppe vide representent 0.1% de la masse totale du virion, les moltcules HLA- DR (HLA:"Human Leucocyte Antigens") peuvent constituer 4.4% des proteines totales associ6es au VM- 1 (Henderson et al., 1987). On peut Cgalement dktecter une variete de recepteurs cellulaires de surface tels les moiccules CD3 et CD4 (Meerloo et al., 1992) Organisation g6nomique du VIH-1. L'organisation gdnornique du VIH-1, est sans contredit, la plus complexe de celles des rctrovirus connus. A l'instar de ceux-ci, son materiel genitique est forme d'arn monocathaire qui au cours de l'infection sera transcript en un ADN bicatenaire. On retrouve alors, bordant 2 chaque extrimitd de I'ADN, deux longues sequences ripdtitives, les LTR ("long Terminal Repeats"), qui contiennent tous les elements en cis nccessaires 5 l'intigration et l'expression adequate du genome viral. Cependant, en plus

27 des genes de structures gag, pol et env comrnuns 3 tous rktrovirus, le gdnome du VIH- 1 prksente divers cadres de lecture ouverts (ORF: "Open Reading Frame") additionnels situks entre pol et em. Cette region centrale renferrne les genes tat et rev auxquels ont associe des fonctions de r6gulation de l'expression des genes viraux, et les g5nes vif, vpr et vpu dits accessoires puisque exprimes tardivement dam le cycle viral et non essentiels & la replication vide dam les ligndes cellulaires CD4+ transformkes (tableau 1). Findement, on retrouve il l'extr6rnitc 3' du gdnome, le gene nef dont la fonction prccoce apparst ttre essentielle 3 la pathogthese du SIDA in vivo. Au cows du cycle rkplicatif, le VIH-1 aura donc recours B un epissage alternatif de 1'ARN genomique afin de lui permettre l'expression indipendante de ses nombreux gines. Le produit du gene tat ("Trans-activator") est un rdgulateur positif de l'expression de tous les ARN messagers ( a m ) viraux (revue par Cullen, 1993). La protkine Tat, exprimke t6t lors du cycle viral, se retrouve dans le noyau et dam le nuclkole de la cellule infectce. Elle reconnait sur les ARNm viraux, une structure secondaire en forme d'kpingle 3 cheveux, appelde TAR ("Trans-acting responsive element"). En association avec des facteurs cellulaires, Tat se fixe sur une chaine naissante d'arn par l'intermkdiaire de TAR afin d'en assurer I161ongation et de stirnuler Itinitiation de la transcription. La protiine Rev ("Regulator of Virion protein Expression") posside kgalement une fonction de regulation positive (revue par Wong- Staal et Haseltine, 1992). Elle permet aux ARNm viraux gag, pol et env d'ichapper aux mecanismes dlcpissage dam le noyau en se liant 8 une structure particuli&re, le RRE ("Rev Responsive Element"). Ces ARN seront transport& vers le cytoplasme oii ils seront traduits en protdines. Rev favorise ainsi la synth5se des protkines de structure formant les nouvelles particules virales et celle des protkines accessoires Vif, Vpr et Vpu. Les prodines Tat et Rev peuvent agir en trans afin de stimuler l'expression des autres genes et elles s'averent indispensables 3 l'infection productive du VM- 1.

28 Gat! GagrPol int&mtion de IfADN viral Env Tat Rev mrscur polypeptidique de l'envebppe virak! Glymprot&ne de dace de Iyenvekppe virale; bison ao epleur CW Sous-unite trzu~~membrsaairt de I1envebppe vide; pmprmd frrsiogbe Nef Vi f VP~ VP~ Augmente k rehhement des virions, d&rade les momcules CD4, climinue les effets cytopathiques du vim

29 Malgrk certains aspects fonctionnels encore ne%uleux, le r61e de la protiine Nef dam le cycle riplicatif du VIH-1 est maintenant rnieux caracterisk. Les premieres itudes ont sugg5rk que Nef ("Negative Factor") pouvait agir come rigulateur negatif rkprirnant la transcription des ghes du VIH-1 (Terwilliger et al., 1986; Luciw et al., 1987; Ahmad et Venkatesan, 1988). On retrouve ainsi dam la siquence U3 du LTR une skquence spkcifique, le NRE ("Negative Regulatory Region"), qui semblerait 2tre mediateur des effets de Nef. Les recentes etudes tendent plut8t dcmontrer que Nef augmenterait le taux de replication virale in vitro (Miiler et al., 1994; Chowers et al., 1994; Spina et al., 1994). Les observations divergentes accumulkes jusqu'8 ce jour semblent Stre le rksultat d'un inorme polymorphisme entre les protkines Nef des diffkrents isolats du VM-1 (Tendliger et al., 199 1; Zazopoulos et Haseltine, 1993). Nef ne posssde aucun effet substantiel quantitatif ou qualitatif sur l'expression des gknes du VIH-1 dam la cellule infecte'e (Miller et al., 1994; Chowers et at., 1994). Toutefois, la proteine augmenterait Ia dissimination vide in vivo par un ou des mkcanismes encore ma1 dkfinis (Jamieson et at., 1994). Ainsi, Miller et al. (1995) ont ricemment dkmontrc que Nef pouvait agir en trans afin d'augmenter l'infectiviti du VIH-1 indkpendamment de l'expression de l'enveloppe virale et de ltentrce du virus. Par ailleurs, l'un des phenotypes consistants avec l'expression de Nef est la capaciti que posskde la proteine d'induire l'internalisation et la degradation spkcifique des mol&xks CD4 exprimdes B la surface de la cellule infectce (Garcia et al., 1991 ; Garcia et al., 1993; Aiken et al., 1994). Cette internalisation ferait suite 8 la dissociation par Nef de complexes pouvant se former entre CD4 et la tyrosine kinase p562ck (Salghetti et al, 1995; Bandres et at., 1995). Ces phknomhes sembleraient inhiber l'activation et la prolifiration norrnale des lymphocytes T infect& (Niederman et al., 1992; Greenway el al., 1994; Greenway et al., 1995). Les effets de Nef sur l'infectivite du VM-1 et la dkgradation des molecules CD4 sont indkpendants I'un de l'autre lors de la rkplication

30 virale (Goldsmith et al., 1995). Aujourdlhui, Nef est perp cornme essentiel i la rkplication du VIH-1 et 2 la pathogcn2se du SIDA (revue par Cullen, 1994). La proteine Vif ("ViraI Infectivity Factor1') influence l'infectiviti des particules virales. Les hdes fonctionnelles montrent que des virus Vif negatif sont 1000 fois moins infectieux que des virus Vif positif lorsque produit dam certains types cellulaires (Fisher et al., 1987; Strebel et al., 1987; Gabudza et al., 1992a). Rkcernment, la production in vitro de particules virales immatures a ktk associke avec l'absence d'expression de la protiine (Hoglund et al., 1994; Borman et al., 1995). Vif semble donc augmenter I'infectivitk vide en assurant la morphogknkse adkquate du virus dans certaines IignCes cellulaires. Le produit du ghe vpr est la seule prot6ine accessoire incorporie dans la particule virale (Cohen et al., 1990; Paxton et al., 1993; LavallCe et al., 1994). EIle s'accumule dans le noyau de la cellule suivant I'infection par le VIH-1 en l1absence de toutcs autres protkines virales (Lu et al., 1993). Ces observations laissent prgsager un r6le prkcoce de Vpr au cows du cycle rkplicatif. Ainsi, Vpr peut s'associer au complexe de preintigration du VM-1 et serait impliquc dam son transport dans le noyau de cellules qui ne se divisent pas telles les macrophages (Heinzinger et al., 1994). Une ktude ricente a d'ailleurs dkmontr6 que I'expression de Vpr 6tait essentielle i la r6plication du VIH-1 dans les macrophages (Connor et al., 1995). Il est donc indressant de noter que Vpr poss5de un effet transactivateur mod&& sur le LTR du VIH-1, toutefois plus faible que Tat, mais kgalement sur divers promoteurs h6t6rologues (Cohen et al., 1990). Vpr semble egalernent capable d'induire en culture la replication du VM-1 chez des monocytes circulants du sang lorsque fourni de maniiire exogiine (Levy et al., 1995). Par ailleurs, Vpr induit la differentiation de cellules musculaires humaines, les rhabdomyosarcomes (Levy et al., 1993) et inhibe la prolif6ration des lymphocytes T en altkrant la progression du cycle cellulaire (Rogel et ab, 1995). Les effets cytostatiques

31 de Vpr laisse entrevoir la possibilite que la protcine puke moduler la permissivite de certains types cellulaires au cours de l'infection in vivo en influenpnt leur cycle de division ou leur programme de diffkrenciation. Finalement, l'une des particularit& du VIH-1 est la presence du gene vpu qui ne se retrouve pas chez le VIH-2 et dont le r6le sera dccrit en details dam les sections subsiquentes, En revanche, le VIH-2 possgde un cadre de lecture ouvert inexistant chez le VIH-1, le ghe vpx. Le produit du gkne vpx presente certaines homologies avec la protcine Vpr (Tristem et al., 1992, Westervelt et al., 1992). La conservation en acides amines entre ceux-ci permet d'envisager la possibilite que le ghe vpx, situe en arnont du g&ne vpr, provient originalement de la duplication de ce dernier (Tristem et al., 1990). De plus, tout comme Vpr, Vpx est incorpork dam le VIH-2 via une interaction avec le domaine p6gag du precurseur polypeptidique Pr55gag et semble contribuer avantageusement B la replication virale dam certaines lignies cellulaires (Yu et al., 1991; Wu et al., 1994). Ainsi, la conservation et la prisence de ces nombreux gkes chez le VIH de serotype 1 ou 2 aura un impact kvident sur la rkplication et l'infectivit6 virale, et dans la progression de la maladie.

32 1.4. Cycle r6plicatif du VIH- 1. Le cycle rcplicatif du VM-1 ne differe que quelques peu de celui des autres retrovirus (figure 3). Dans ces grandes lignes, suite B l'entree du VIH-I dans la cellule cible, 1'ARN genomique viral est libere de la capside pour Etre transcrit en un ADN bicatenaire, qui sera integri au sein du matbriel ginetique de la cellule h6te. Lors de I'activation cellulaire, les gkes virawc seront exprimks, commandant ainsi la synth5se des protkines nicessaires B la formation de nouvelles particules viraies. Suivant les Ctapes d'assemblage, les particules virdes matures seront libkrees par bourgeonnement i la membrane plasrnique et iront infecter d'autres cellules. Toutefois, le cycle rkpticatif du VIH-I prisente certaines particularitis puisqu'il met en jeu de multiples acteurs viraux et cellulaires. Le VIH-1 reco~dt sp&ifiquement B la surface de la cellule cible, le recepteur CD4 (cellule CD4+). La glycoproteine mernbranaire CD4 est presente sur une grande varikte de cellules d'origine hkmatopo'i6tique. Elle joue entre autres un r61e essentiel dans l'elaboration de la rdponse immunitaire. Ainsi, les lymphocytes T matures et irnmatures, principaux rouages du syst5me immunitaire, constitue I'une des cibies privalentes du VIH-I. Le rkcepteur CD4 est aussi apparant, quoique en plus faible concentration, la surface des monocytes/macrophages et des cellules prksentatrices d'antigknes telles les cellules dendritiques. Par ailleurs, certaines expkriences in vitro ont dkmontr6 que le VIH-1 est capable d'infecter des cellules n'exprimant pas la molicule CD4 telles les cellules nerveuses (Harouse et al., 1991) et les cellules fibroblastiques (Tateno et al,, 1989). Dans cet ordre d'idie, le galactocir~broside (GalC) (Bhat et al., 1991 ; Yahi et al., 1992) et la molccule CD26 (Callebaut et a!., 1993) ont Ct6 dicrits cornrne de potentiels co-rtkepteurs du VIH-1.

33

34 Lors d'infection de cellules CD4+, le VM-1 interagit avec sa future cible par I1intermCdiaire de la glycoprotcine de surface de L'enveloppe virale, la gp 120. Cette interaction de haute affinitd entraine un changement de conformation de la gp120 conduisant ainsi B la fusion de la membrane cellulaire et de la membrane virale. Cette fusion est mcdi6e en grande partie par la sous-unite transmembranaire de la glycoprot6ine d'enveloppe, la gp41. La liaison entre la gp120 et le rccepteur CD4 entraine un changement de conformation dam la glycoproteine d'enveloppe necessaire B la presentation des domaines de fusion de la gp41. Cette Ctape permet par la suite la penetration de la capside viraie dam la cellule. Ce processus, contrairement 5 la plupart des virus enveloppis, ne s'effectue pas par endocytose et est ainsi indipendant du ph 5 la surface cellulaire (Stein et al., 1987). Au terme de plusieurs Ctapes rt5sumcs dam la figure 3, I'ARN monocatinaire du VIH- 1 relargui dam le cytoplasme est transcrit en un ADN bicatenaire par la transcriptase inverse. Cet enzyme vide posdde 5 la fois une activiti ADN polym6rase et une activitk ribonuclease hi permettant d'effectuer la rktrotranscription du VIH-1. L'ADN nouvellement g6nm presentera alors B chacune de ses extr6mids un LTR sur lequel on retrouve de multiples sequences susceptibles d'ctre reconnues par des facteurs cellulaires et des proteines du VIH-1. Ces elements seront nkcessaires B I'intkgration et l'expression adequate du genome viral. L'ADN sera ainsi achemine vers le noyau cellulaire en un complexe de priintegration incluant une enzyme virale, l'intigrase, pour y &re insiri diatoirement au sein du matiriel ginetique de la cellule. Contrairement aux oncoritrovirus, ce processus de transport nuclkaire du complexe de preintc5gration du VIH-1 est ATP dependant et semble &re independant du cycle cellulaire (Bukrinsky et al., 1992). D'autres part, la rkplication de I'ADN cellulaire ne semble pas ttre un prerequis 2 l'intigration vide puisqu'elle n'est pas ntcessaire lors de reaction in vitro &integration (Fujiwara et Craigie, 1989). L'ADN viral prksent dans le noyau, se retrouve ainsi sous trois formes distinctes; soit linkaire, servant de precurseur B L'intCgration, et des formes circulaires possedant un ou deux LTR

35 (Haseltine, 1992). Une fois integre sous une forrne dite "provirale", le complexe de preintkgration du virus aura accompli sa fonction et toutes les &apes subskquentes de rkplication seront midiies par la rnachinerie transcriptionnelle de la cehle. c. L'expression des ghes viraux sera donc optimisie grgce B des facteurs cellulaires et viraux qui conjointement participeront 2 l'activation des cellules infectees. Ainsi, Ies LTR presentent des motifs specifiques pennettant la transcription du ginome viral en ARN par I'ARN polymkrase II de la cellule (Jones et al., 1986; NabeI et Baltimore, 1987; Folks et al., 1989; Lu et al., 1990; Kato et al., 199 1). On retrouve: (i) une sequence TATA classique servant de prornoteur, (ii) des sites de liaison pour le facteur de transcription ubiquitaire SPl, (iii) des sites de liaison pour le facteur cellulaire NF- KB, et (iv) une scquence NRE oh sont situks de nombreux sites de liaison pour des facteurs de transcription cellulaire. Griice 2 ces motifs le VIH-1 a d6veloppk plusieurs stratagimes do~ant lieu une infection la fois persistante, lente et progressive (revue par Laughlin et Pomerantz, 1994). L'expression des ghes du VIH- 1 de'butera avec la synthkse d'une copie complite D'ARN 5 partir de 1'ADN proviral. Le taux d'initiation de transcription est sujet en grande partie B la nature et 11activitr5 de divers facteurs cellulaires. Un grand nombre de ces proteines, produitent lors de l'activation de la cellule, vont se lier aux motifs situks pr6s du site d'initiation de la transcription, que l'on retrouve dam un des LTR du genome viral integre. 11 existe donc une Etroite relation entre l'activation des cellules et I'expression des ghes viraux. La stimulation des cellules infectees par des agents mitogeniques, des antig5nes exoghes ou des cytokines est une condition prkalable B la replication du VIH-1 autant in vitro que in vivo (Zack et al., 1990). Suite 2 la stimulation des lymphocytes T infect&, on observers l'activation de facteurs de transcription cellulaire tel le NF-KB normdement associc son inhibiteur, le facteur I-. La dissociation de IKB permettra le transport de NF-KB dans le noyau de la cellule oh il se liera aux motifs presents dans le LTR de I'ADN proviral integr6. Cette

36 interaction spicifique induira l'expression basale des gknes viraux. Ainsi, le VIH- I n'entrera dans un cycle replicatif actif que lorsque les cellules infectees auront 6ti elles meme stimulies, favorisant ainsi l'evasion vide et une infection persistante. On doit cependant noter certaines restrictions 2 ce phenomhe puisque I'ADN proviral peut &re traduit dam des populations cellulaires matures telles les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules microglides du cerveau (Watkins et al-, 1990; Langhoff et al., 1991) chez lesquelles la division cellulaire est inexistante. Ces cellules sont consid6rces come des r6servoirs de virus Ctant rkfractaires aux effets cytopathiques du VIH- 1 et pouvant assumer la dplication de ce dernier. Suite & l'activation cellulaire, les LTR du VIH-1 deviennent des promoteurs actifs apte 5 la liaison de llarn polym6rase II cellulaire et contr6lant la synthke des ARNm viraux. A ce stade de la replication, des momcules complbtes D'ARNm nouvellement synthdtisies vont s'accumuler dans le noyau de la cellule. Ils y subissent alors un ipissage alternatif donnant lieu un groupe h6tirogene de transcripts multi- epissks et desquelles sont synthitist5s les protcines Tat, Rev et Nef. La prothe Tat favorisera la synthhe de toutes les nouvelles mol6cules d'arnm viraux, tandis que la protcine Rev permettra le transport dam le cytoplasme des ARNm codant pour les genes de structures et leur disponibilit6 2 la machinerie de traduction cellulaire. Les ARNm qui n'ont subi aucun ou un seul ipissage vont Etre exprimis en protiines de structure soient les protkines de la capside virale (Gag) et les glycoprotkines d'enveloppe (Env), de mcme que les enzymes (GagPol) ndcessaires B la replication du VM- 1. Par la suite, les proteines virales vont subir des modifications post-traductionnelles incluant glycosylation, myristylation et phosphorylation. Les particules virales seront fmalement assemblt5es au nivez~ de la membrane plasrnique, encapsidant du meme coup deux moldcules d'arn ghomique du VIH- 1. Les virions matures nouvellement form& vont dors bourgeomer travers la membrane ceuulaire et vont entrainer avec elles une partie de la bi-couche lipidique de la cellule ainsi que les glycoprotbines de l'enveloppe virale.

37 la gp41 et la gp120. Ces derniers pourront 2 leur tour infecter de nouvelles cellules et ainsi perpetuer le cycle replicatif du VIH-I. Plusieurs aspects de la replication du VIH-1 restent encore 6nigmatiques. Par quel(s) mhtnisme(s) le VIH-1 parvient-il ii infecter et se repliquer efficacement dans des lymphocytes T au repos ou encore dans des populations monocytaires? Les lymphocytes T CD4+ isolcs d'individus en phase asymptomatique representent majoritairement une population de cellules au repos contennant des forrnes dladn proviral non-integre (Bukrinsky et al., 1991). De plus, I'interaction de la gp 120 ou d'anticorps anti-cd4 avec le recepteur CD4 semble inhiber I'activit6 de certains facteurs de transcription nucl6aire (NF-AT, NF-KB et AP-I) qui ont un r6le & jouer dans la regulation d'expression du ghe de l'interleukine-2 (Jabado et al., 1994). La liaison entre la gp120 et la molecule CD4 n'apparait donc pas suffisante pour pallier i I'activation des cellules infectees. Ainsi, il est clair que le VIH-1 entretient d'etroites interactions avec la cellule hate afin d'induire la stimulation ou la differentiation cellulaire, optimisant ainsi l'infection virale. De multiples facteurs cellulaires auront des rales prdponderants dans les diff6rentes &apes du cycle vide (revue par Gaynor, 1992). Par ailleurs, des proteines du VIH-1 telles la p17gqg et Vpr participeront egalement i 116tablissement de l'infection productive dans des populations cellulaires inaptent B se diviser. Elles faciliteront via des interactions spkcifiques le transport du complexe de preintegration viral dans le noyau des macrophages et des cellules tpithiliales (Bukrinsky et al., 1993; Heinzinger et al., 1994). Le VIH- 1 peut donc procdder B l'infection de differentes populations cellulaires, dictant ainsi la progression du cycle viral et 116volution de la maladie.

38 2. La mol6cule CD4: principal r6cepteur ceuulaire du VIH-1. Afin d'entreprendre son cycle d'infection, le VIH-1 reconnait B la surface des cellules cibles, la mol~cule CD4 (Dalgleish et al., 1984; Klatzmann et al., 1984; Maddon et al., 1986; Clapham et al,, 1987). Les travaux effectuks par Maddon et al., (1986) demontrent sans equivoque 1laffinit6 du virus pour les cellules exprimant 2 la surface la molkule CD4. Des anticorps monoclonawr (AcM) dirigis contre ce dernier inhibe l'infection virale. De plus, I'expression de CD4 dans des cellules autrement rdfractaires 5 L'infection par le VM- 1 leur coserent la capacite de lier le virus (Maddon et al., 1986). Malgri certaines homologies avec la molicule CD4 humaine, 1'6quivalent CD4 murin (L3T4) ne lie pas la gp 120 du VM-1 (Landau et al., 1988). L'interaction entre la glycoproteine d'enveloppe virale et le CD4 s'avkre donc des plus sp6cifique et de haute affinite. La moecule CD4 est une glycoproteine membranaire exprimke sous la forme d'un monomkre glycosylk d'environ 55 kda. Elle comporte quatre domaines extracellulaires (Dl-D4), une region transmembranaire de 25 acides aminis et une queue intracytoplasmique de 38 acides aminks son extremiti C-terminale (figure 4). La mol6cule CD4 joue non seulement un r6le important dans 1'Claboration de la reponse irnmunitaire mais sert Cgalement de transducteur dam les phenomknes &activation ce llulaire.

39 Extracellulaire RWRFKK1 tllw88ljte Myrlstlfatlon Unique Cytoplasmique SH3 SH2 Di-Leu Klnase Rcgulatoirc Figure 4. Reprbentation schgmatique de la molcule CD4 et de la tyrosine kinase p5dck. (modifice de la refdrence Geleziunas et nl., 1994)

40 Lors de la reponse imrnunitaire, la mol~cule CD4 n'interagit qu'avec les Ag de classe II du CMH prcsentcs par Ies cellules presentatrices d'antigknes (Bank et Chess, 1985). Cette interaction semble spdcifique puisque des AcM diriges contre l'un ou l'autre des intervenants inhibent leur association. De plus, des Ctudes de mutagknkse effectuies sur la mole'cule CD4 demontrent que des rdsidus pr6sents dam les domaines extracelluiaires D 1 it D3 sont essentiels B I'interaction avec les Ag de classe II (Clayton et al., 1989; Lamarre et al., 1989a). CD4 servirait ainsi de rnol6cule &adhesion afin de stabiliser les complexes formcs entre les Ag de classe 11 sur la cellule cible et le rccepteur de I'antigine des lymphocytes T (TCR; "T Cell Receptor") exprime 2 la surface de la cellule effectrice. En plus de son interaction avec les Ag de classe II, la molc5cule CD4 s'associe Cgalement en cis avec le TCR B la surface de la cellule afin d'amplifier les signaux conduisant B l'activation cellulaire. Cette interaction semble cependant faible et transitoire puisquleile ne s'observe que dans 5 B 10% des lymphocytes T au repos (Anderson et al., 1988). Ainsi, la reconnaissance antighique par les lymphocytes T entrafnera une redistribution des TCR et des mol&ules CD4, autrernent uniformdment reparties 2 la surface cellulaire, i la zone de contact entre les celluies effectrices et les cellules prcsentatrices d'antigtnes (Kupfer el al., 1987; Rivas et al., 1988). La queue intracytoplasmique du CD4 semble jouer un r6le important dam la formation des complexes CD4/TCR (Mittler et al., 1989). Par des techniques de cytofluomc5trie en flux, les auteurs montrent que des moltcules CD4 tronquees, n'exprimant plus le domaine intracytoplasrnique, ne sont plus aptes 5 interagir avec le TCR. De plus, la formation de tels complexes semble avoir un effet synergique sur les &apes conduisant B l'activation cellulaire. L'absence de la queue intracytoplasmique sur la molecule CD4 inhibe 6galement l'activation des lymphocytes T (Sleckman et al., 1988). Il est clair que La molicule CD4 s1av5re un atout important dans les Ctapes de stimulation antigenique des lymphocytes T.

41 Outre sa fonction de molecule d'adhksion, le ricepteur CD4 sert 5 priori de transducteur dam les phinomhes d'activation cellulaire. Les travaux de Veillette et al., (1988) montrent la liaison non covalente de la rnomcule CD4 B la tyrosine kinase p561ck (figure 4). Cette association spicifique est m&we par un motif cystcine-xx-cystiine (risidus en positions 20 et 23) dans la region N-terminale de p56[ck, "X" reprisentant un acide amini quelconque, et deux risidus cystkine situes en positions 420 et 422 de la queue intracytoplasmique de la molicule CD4 (Turner et al., 1990; Collins et al., 1992). La tyrosine base p561ck est un membre de la famille src implique dam la regulation des ph6nomhes d'activation et de diff6renciation cellulaire (Marth et al., 1988; Marth et al., 1989; Sefton, 1991). Ainsi, des mutants de la molicule CD4 incapable de lier la p561ck perdent leur capacite d'induire la sicr6tion d'interleukine 2 en riponse B une stimulation antighique (GIaichenhaus et al., 199 1). L'activation des lymphocytes T n'a donc lieu que si la molecule CD4 est associce Zi la p561~k. Suite B la stimulation des lymphocytes T, on observe la dissociation des complexes ~~4/p561~& et I'internalisation des molicules CD4 qui empechent une stimulation excessive des cellules. La molkule CD4 par son interaction avec la p56lck est ainsi capable de transmettre des signaux d'activation cellulaire L'interaction entre la gp120 et la mol6cule CD4: une liaison de haute aeinit6. L'utilisation de formes solubles de la molecule CD4 a permis de dklimiter les regions de la protkine responsables de l'interaction avec le VlH-1. Ainsi, des mol~cules CD4 tronquies solubles, ne posskdant que les deux premiers domaines extracellulaires de la protkine, peuvent efficacement inhiber la fixation du VIH-1 ti la cellule CD4f (Traunecker et al., 1988; Berger et al., 1988). Des etudes de mutagin2se ont permis de restreindre le site d'interaction de la gp120 au domaine Dl de Ia molt5cule CD4