ÉTUDE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DE LA PROTÉINE INTÉGRASE DU VIH-1 ET DÉVELOPPEMENT D INHIBITEURS

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1 MINISTERE DE L ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté Par Coralie CELLIER Pour l obtention du diplôme de l École Pratique des Hautes Études ÉTUDE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DE LA PROTÉINE INTÉGRASE DU VIH-1 ET DÉVELOPPEMENT D INHIBITEURS Soutenu le, 23 octobre 2007 devant le jury suivant : Dr Thierry DUPRESSOIR Dr Geneviève CORDIER Dr Corinne RONFORT Pr Gérard VERDIER Pr Pierre BOULANGER Président du jury Responsable EPHE Directeur Scientifique Examinateur Examinateur Mémoire préparé sous la direction de : Dr Corinne RONFORT UMR 754 INRA-ENVL-UCBL-EPHE, Lyon Rétrovirus et pathologie comparée IFR128 BioSciences Gerland, Lyon Sud Equipe : Rétrovirus et Intégration Rétrovirale Pr Jean François MORNEX Et de Dr Geneviève CORDIER UMR 754 INRA-ENVL-UCBL-EPHE, Lyon EPHE Banque de Monographies SVT 1

2 Rétrovirus et pathologie comparée Pr Jean François MORNEX IFR128 BioSciences Gerland, Lyon Sud Equipe : Interactions Cellulaires, Rétrovirus et Cancer ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE ÉTUDE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DE LA PROTÉINE INTÉGRASE DU VIH-1 ET DÉVELOPPEMENT D INHIBITEURS Coralie CELLIER RÉSUMÉ Les rétrovirus sont des virus enveloppés à ARN, souvent pathogènes. Le Virus de l Immunodéficience Humaine (VIH), agent étiologique du Syndrome d ImmunoDéficience Aquise (SIDA), appartient à cette famille virale. Le cycle viral des rétrovirus est caractérisé par deux étapes essentielles : la transcription inverse de l ARN simple brin en ADN bicaténaire et l intégration de cet ADN dans le génome de la cellule hôte. L étape d intégration est accomplie par l intégrase (IN) qui réalise l insertion simultanée des deux extrémités virales en un même site de l ADN génomique, par un processus appelé intégration concertée. Les études fonctionnelles et structurales de l IN sont importantes pour acquérir une meilleure compréhension du fonctionnement de cette enzyme. Les travaux présentés dans ce mémoire ont consisté à mettre en place un système d étude in vitro de l intégrase du virus VIH-1 et de mutants ponctuels de cette intégrase (I141K, I203P, I203K, E152D, E246A et E246K). L analyse de la structure et des fonctions des mutants de l intégrase VIH-1 a permis : (i) de conforter l hypothèse selon laquelle un réarrangement conformationnel de la protéine s effectuerait entre les étapes de clivage et de ligation, (ii) de confirmer l implication de certains résidus dans la liaison à l ADN et dans la multimérisation de l enzyme, (iii) d apporter des arguments en faveur du modèle de Wielens, modèle de tétramère de l IN. La deuxième partie de l étude était la conception d inhibiteurs de type peptidique dirigés contre l IN. Un premier inhibiteur a été dessiné par modélisation moléculaire à partir du modèle de Wielens, sur un site potentiel de tétramérisation et de liaison à l ADN et n a pas donné les résultats escomptés. Une seconde approche par phage display semble plus prometteuse puisqu elle a permis de sélectionner des peptides se fixant sur les interfaces de l IN ainsi que des peptides à très haute affinité pour IN. Ces peptides sont en cours d analyse, dans les différents tests d activités in vitro que nous avons développés précédemment, afin de déterminer s ils possèdent un pouvoir inhibiteur important. L ensemble des données obtenues dans notre étude, apporte de nouveaux éléments permettant une meilleure compréhension du mécanisme d intégration. A l issue de ces travaux, nous espérons contribuer au développement de nouveaux inhibiteurs dirigés contre l IN du VIH. Mots clés : Rétrovirus Intégrase - Intégration - VIH-1 - Inhibiteurs Sommaire EPHE Banque de Monographies SVT 2

3 Abréviations Introduction.1 Chapitre I : présentation des rétrovirus et du VIH Classification Structure du VIH L organisation génomique du VIH Le cycle de réplication Chapitre II : L intégration rétrovirale Import nucléaire du complexe de pré-intégration (PIC) Les étapes de l intégration rétrovirale Mécanismes mis en jeu Cofacteur de l intégration Site d intégration Tests d activités in vitro de l intégrase du VIH Mesure des constantes catalytiques de la protéine intégrase L intégration concertée in vitro..11 Chapitre III : La protéine intégrase Structure et fonction des différents domaines Le domaine N-terminal Le domaine central Le domaine C-terminal Structure oligomérique de l intégrase Les formes actives de l intégrase Influence de l ADN sur la structure Modèle de structure de l intégrase..17 Chapitre IV : Sida et thérapie Les antirétroviraux Les inhibiteurs de la RT Les inhibiteurs de protéase ou PI Les inhibiteurs de fusion ou FI Le développement d inhibiteurs de l intégrase Les inhibiteurs de type chimiques Les inhibiteurs de types peptidiques..22 Objectifs de l étude 24 EPHE Banque de Monographies SVT 3

4 Abréviations ADN Acide Desoxyribonucléique ALSV Avian Leukemia and Sarcoma Viruses APS Ammonium Persulfate ARN Acide Ribonucléique Att attachement BAF Barrier Autointegration Factor BIV Bovine Immunodeficiency Virus BS 3 Bis (Sulfosuccinimidyl) suberate CA Capside CHAPS 3-[(3-chloroamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate CPP Cell Penetrating Peptide CTD Domaine C-terminal DKA Diketo Acids DMSO DiMethylSulfOxide DO Densité Optique DTT Dithiothréitol EED Embryonic Ectoderm Development ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay FI Fusion Inhibiteurs FIV Feline Immunodeficiency Virus GFP Green Fluorescent Protein HIV Human Immunodeficiency Virus HMG High Mobility Group IC 50 Concentration de drogue nécessaire pour obtenir 50 % d inhibition IN Intégrase INI1 Integrase Interactor 1 IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside kda kilo Dalton LEDGF/p75 Lens Epithelium-Derived Growth Factor LTR Long Terminal Repeat MA Matrice MLV Murine Leukemia Virus Mg Magnésium Mn Manganèse Mo-MLV Moloney Murine Leukemia virus NC Nucléoprotéine Ni Nickel NLS Nuclear Localisation Signal NRTI Nucleoside/Nucleotide Reverse Transcriptase Inhibitors NNRTI Non Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors NTD Domaine N-terminal pb paire de base PCR Polymerase Chain Reaction PDPs Pyrano - dipyrimidines PEG PolyEthylene Glycol PIC Complexe de pré-intégration PI Proteases Inhibiteurs EPHE Banque de Monographies SVT 4

5 PTD Protein Transduction Domain PR Protease RAV Rous Associated Virus RMN Résonnance Magnétique Nucléaire RSV Rous Sarcoma Virus RT Reverse transcriptase RTC Reverse Transcriptase Complexe SDS Sodium Dodécyl Sulfate SH3 Src Homology 3 SIDA Syndrome de l ImmunoDéficience Acquise SIV Simian Immunodeficiency Virus SQLs Stryrylquinolines SU Suface supf gène suppresseur de mutation amb TM Transmembranaire UV Ultra Violet Zn Zinc EPHE Banque de Monographies SVT 5

6 INTRODUCTION Chapitre I : présentation des retrovirus et du VIH Les rétrovirus sont des virus enveloppés à ARN. La pathogénécité de certains d entre eux leur confère un intérêt important. Ainsi le Virus de l Immunodéficience Humaine (VIH), agent étiologique du Syndrome d ImmunoDéficience Aquise (SIDA), est l un des virus les plus étudiés à ce jour. Le cycle viral des rétrovirus est caractérisé par deux étapes essentielles : la transcription inverse de l ARN simple brin en ADN bicaténaire et l intégration de cet ADN dans le génome de la cellule hôte par l intégrase. La classification des rétrovirus est basée sur la morphologie de la particule virale (enveloppé), la nature de l acide nucléique (ARN) et sa polarité (positive), ainsi que sur leur stratégie de réplication. 1. Classification L ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) a défini une classification des rétrovirus en 7 genres : les Alpharétrovirus, les Betarétrovirus, les Gammarétrovirus, les EPHE Banque de Monographies SVT 6

7 Epsilonrétrovirus, les Deltarétrovirus, les Spumavirus et les Lentivirus. On distingue deux groupes de rétrovirus : - Les rétrovirus à génome simple, qui ne possèdent que les gènes gag, pol, env : il s agit principalement des Alpharétrovirus, les Betarétrovirus et les Gammarétrovirus - Les rétrovirus à génome complexe, qui codent pour des protéines additionnelles (protéines régulatrices ou accessoires) : il s agit des Epsilonrétrovirus, les Deltarétrovirus, les Spumavirus et les Lentivirus. Les Alpharétrovirus, les Betarétrovirus, les Gammarétrovirus, les Epsilonrétrovirus et les Deltarétrovirus sont des virus à potentiel oncogénique. Ils sont responsables de tumeurs aigües avec une période de latence courte (sarcomes, lymphomes, leucémie). Les Spumavirus sont quant à eux caractérisés par des infections persistantes sans signe clinique. Les Lentivirus infectent différentes espèces animales dont les primates (VIH-1, VIH-2, SIV), les félins (FIV) ou encore les bovins (BIV). Ils sont responsables de maladies chroniques à évolution lente d où l appellation «Lentivirus» signifiant virus lent en latin et ne sont pas oncogènes. Après infection, la période d incubation peut s étendre sur des mois voire des années avant que les signes cliniques ne se manifestent. Le représentant le plus connu de ce genre est le VIH. 2. Structure du VIH-1 Le VIH, forme des particules sphériques de 80 à 120 nm de diamètre. Ces particules sont formées d une enveloppe externe constituée d une bicouche lipidique d origine cellulaire et de deux glycoprotéines virales formant des spicules: la gp120 ou glycoprotéine de surface (SU) et la gp41 ou glycoprotéine transmembranaire (TM). La face interne de cette enveloppe est tapissée par la protéine de matrice (MA). La capside virale, de forme conique, est composée de protéines de capside (CA). Elle renferme le génome viral constitué de deux molécules d ARN atteignant 9,2 kb. Ces ARN sont associés aux protéines de nucléocapside (NC). Les enzymes virales : l intégrase (IN), la reverse transcriptase (RT) et la protéase (PR) sont également présentes dans la capside. 3. L organisation génomique du VIH-1 Le génome du VIH-1 est un ARN d environ 9200 nucléotides. A l extrémité du génome se trouvent les séquences terminales non codantes, les LTRs (Long Terminal Repeat). Ces extrémités renferment notamment le promoteur (LTR 5 ) et le site de polyadenylation (LTR 3 ). Il existe également d autres séquences régulatrices impliquées dans la transcription inverse et l encapsidation. Le VIH est un rétrovirus à génome complexe qui comporte neuf cadres de lectures codant pour 15 protéines différentes. Les gènes gag (group specific antigen), pol (polymerase) et env (enveloppe) sont communs à tous les rétrovirus. Le gène gag code pour les protéines de structure essentielles dans l'assemblage et le bourgeonnement des particules virales. Il code pour un précurseur polypeptidique (Pr55 gag) dont le EPHE Banque de Monographies SVT 7

8 clivage enzymatique par la protéase produit trois protéines majeures : la capside, la matrice et la nucléocapside ainsi que le peptide p6 participant à l assemblage et à la libération des nouvelles particules virales. Le gène pol code pour trois protéines enzymatiques nécessaires au cycle de réplication du virus, la reverse transcriptase, l intégrase et la protéase. Le gène pol est exprimé sous la forme d un précurseur polypeptidique (Pr160 gag-pol) codé à partir des séquences gag et pol. La reverse transcriptase est une ADN polymérase ARN dépendante qui permet la transcription inverse de l ARN viral en ADN double brin complémentaire. La protéase va cliver les précurseurs polypeptidiques Pr55 gag et Pr160 gag-pol conduisant à l obtention de protéines virales matures. L intégrase a pour rôle d intégrer l ADN double brin nouvellement formé dans le génome cellulaire. Le gène env code un précurseur polypeptidique (Pr160 env) glycosylé. Le clivage de ce précurseur donne les glycoprotéines de l enveloppe virale : la gp120 (SU) et la gp41 (TM). Le VIH-1 possède des gènes codant pour 6 protéines supplémentaires, régulatrices (Tat, Rev) et accessoires (Nef, Vpr, Vpu et Vif). - La protéine Tat stimule la transcription du génome viral par le biais de la séquence TAR (Transactivation-responsive Region). Elle possède également la capacité de pénétrer dans les cellules grâce à son domaine PTD (protein transduction domain) et peut ainsi affecter les différentes voies de signalisation cellulaire de cellules non infectées (Lee et al., 2005b). - La protéine Rev permet l export nucléaire des ARN viraux non épissés. - La protéine Vpr est impliquée dans le transport de l ADN viral dans le noyau et stimule la réplication virale (Le Rouzic and Benichou, 2005). - La protéine Vif interviendrait dans l assemblage et la maturation des virions. Elle cible également un facteur cellulaire dit de «restriction» en bloquant l action antivirale de APOBEC3G (Santa-Marta et al., 2005). - La protéine Vpu est une protéine qui stimule la libération des nouveaux virions et induit la dégradation des CD4 (Hsu et al., 2004). - Enfin, la protéine Nef stimule l infectivité du virion et serait indispensable pour maintenir une forte charge virale dans les cellules infectées (Campbell et al., 2004; Li et al., 2005). 4. Le cycle de réplication Le cycle de réplication des rétrovirus comprend plusieurs étapes allant de la pénétration du virus dans la cellule hôte jusqu à la production de nouvelles particules virales. 1. La pénétration de la particule virale dans la cellule cible se fait par interaction entre la protéine SU et un récepteur spécifique présent à la surface cellulaire. Le cycle viral du virus VIH-1 débute par l interaction de la glycoprotéine gp 120 à la surface virale avec le récepteur cellulaire CD4. L interaction CD4/gp120 n est pas suffisante pour permettre l entrée du virus et des co-récepteurs spécifiques sont requis. Ce sont des récepteurs naturels aux chimiokines, CXCR4 et CCR5 (Freed, 2001). Après la liaison de la gp120 avec la molécule CD4, la gp41 provoque la fusion des membranes virales et cellulaires (Doms, 2004). Enfin, la dissociation des protéines de la capside, permet la EPHE Banque de Monographies SVT 8

9 libération du contenu de la particule virale dans le cytoplasme cellulaire. 2. La transcription inverse, soit la synthèse d ADN double brin complémentaire à partir d un brin d ARN, est réalisée par la transcriptase inverse dans le cytoplasme, au sein d un complexe de reverse transcription (RTC). 3. et 4. L importation nucléaire du complexe de préintégration (PIC) et l intégration du génome viral au sein du génome de la cellule cible seront décrites dans le chapitre suivant. 5. Une fois intégré dans le génome de la cellule hôte, l'adn viral (provirus) est transcrit par la machinerie cellulaire. Les ARN messagers (ARNm) génomique et sous génomique de différentes tailles sont obtenus par des épissages alternatifs. 6. Certains ARN viraux sont traduits dans le cytoplasme, permettant la formation de nouvelles protéines indispensables à la création de particules virales. 7. Avant de quitter la cellule productrice, le nouveau virion s organise sous la membrane plasmique. L ensemble des constituants protéiques, se rassemble autour de deux molécules d ARN viral génomique. Le bon déroulement de cette étape conditionne le bourgeonnement à la membrane plasmique et donc la production des nouvelles particules virales. 8. Enfin les nouvelles particules virales sont libérées par bourgeonnement. S en suit une phase de maturation des particules nouvellement formées. A la suite de cette maturation effectuée par l action de PR sur les précurseurs Pr55 gag, Pr160 gag-pol, Pr160 env, les particules virales sont infectieuses. Chapitre II : L intégration rétrovirale EPHE Banque de Monographies SVT 9

10 Afin de réaliser l étape d intégration, indispensable au cycle de réplication des rétrovirus, l ADN viral doit être importé dans le noyau cellulaire. 1. Import nucléaire du complexe de pré-intégration (PIC) Après accomplissement de la transcription inverse de l ARN viral en ADN bicaténaire, le complexe RTC devient compétent pour l intégration et prend le nom de PIC (complexe de préintégration). Par le biais du PIC, l ADN viral est transporté du cytoplasme vers l ADN cellulaire situé dans le noyau. Le PIC est un complexe multiprotéique constitué de l intégrase, d ADN viral, de protéines virales telles que MA, CA ou Vpr ainsi que de multiples protéines cellulaires (Miller et al., 1997). La composition exacte de ce complexe n est pas encore bien définie. En effet, les techniques de purification du PIC peuvent faire varier sa composition. Cependant, parmi les protéines virales, l intégrase est le facteur le plus fortement associé à l ADN viral (Farnet and Haseltine, 1991). De nombreuses protéines cellulaires sont rattachées au PIC, les plus étudiées sont HMGI(Y) (High Mobility Group), INI1 (Integrase Interactor 1), ainsi que BAF (barrier to auto-integration factor). La protéine BAF serait incorporée dans le PIC au niveau du cytoplasme (Mansharamani et al., 2003) et interviendrait également dans la formation de ce dernier (Lin and Engelman, 2003). Dernièrement, la protéine LAP2α a été trouvée dans le PIC de MuLV, en association avec BAF (Suzuki et al., 2004). Le rôle des protéines de la famille des HMG sera décrit dans le chapitre 2.2 (cofacteur de l intégration). Enfin, la protéine INI1 est présente dans le noyau et aurait, entre autres, pour rôle d orienter le PIC au sein de ce compartiment (Boese et al., 2004). Afin d atteindre le noyau, le PIC doit migrer dans le cytoplasme. L utilisation d un système double hybride a déjà permis de mettre en évidence l interaction de l IN avec des protéines associées aux microtubules (de Soultrait et al., 2002a). Une protéine Vpr marquée à la GFP (green fluorescent protein) a permis de montrer que le PIC se déplace le long des microtubules dans les cellules infectées par VIH-1 (McDonald et al., 2002). Récemment, une IN possédant une étiquette cystéine marquée a permis de suivre les mouvements intra-cytoplasmiques du PIC, mouvements caractéristiques de l utilisation du système des microtubules et de l actine formant le cytosquelette (Arhel et al., 2006). Pour le rétrovirus MuLV, le transport du PIC vers l ADN cellulaire se fait pendant la mitose lorsque la membrane nucléaire est dissociée (Roe et al., 1993). A l inverse les rétrovirus du genre lentivirus tel que VIH-1 sont capables de se répliquer dans des cellules qui ne se divisent pas ou cellules quiescentes. Pour ces virus, le PIC entrerait dans le nucléoplasme par les pores nucléaires. L import nucléaire du PIC est un système très complexe qui nécessite l interaction de diverses protéines dont le rôle et la présence ne sont pas toujours bien définis. Des protéines virales peuvent contribuer au transport du PIC à travers l enveloppe nucléaire. Des séquences de type NLS (séquences de localisation nucléaire) ont été identifiées sur les protéines MA et Vpr ainsi que sur l intégrase de VIH. De plus, les protéines Vpr contiendraient des séquences permettant au PIC de se fixer aux pores nucléaires (Vodicka, 2001). Cependant, des auteurs ont montré que des virus mutés simultanément au niveau des séquences NLS de MA et Vpr restaient capables de se répliquer dans EPHE Banque de Monographies SVT 10

11 des cellules qui ne se divisent pas (Freed et al., 1995). Au vu de ces résultats, il a été suggéré que l import nucléaire du PIC pourrait être du à l association de plusieurs séquences NLS localisées sur différents constituants du PIC. Il a aussi été montré que la présence d une séquence nommée «DNA flap central» située au milieu du génome viral semble déterminante pour l entrée du PIC par les pores nucléaires (Zennou et al., 2000). L importance de cette séquence a été démontrée sur la réplication de VIH-1. En effet, un virus VIH-1 délété de séquence DNA flap se réplique 10 à 100 fois moinsbien que le virus sauvage (De Rijck and Debyser, 2006). Une fois que l ADN viral est entré dans le noyau, il est intégré à l ADN de la cellule hôte. 2. Les étapes de l intégration rétrovirale 2.1. Mécanismes mis en jeu A l issue de la transcription inverse le génome viral est linéaire et délimité à chaque extrémité, par un «Long Terminal Repeat» ou LTR. Chaque LTR est divisé en trois séquences, U3, R et U5. Les extrémités des séquences LTR sont essentielles pour l intégration de l ADN viral dans le génome de la cellule hôte. En effet, les séquences U3 et U5 possèdent des sites de reconnaissance pour l intégrase appelés sequences «att» pour attachement. L intégration de l ADN viral dans l ADN cellulaire se déroule en plusieurs étapes : (i) reconnaissance par l intégrase des séquences att situées aux extrémités des LTR, (ii) clivage de deux nucléotides aux extrémités 3 virales en amont d un doublet CA conservé et libération des extrémités 3 hydroxyles. L étape de clivage est effectuée dans le cytoplasme cellulaire. Le transfert de brins (iii) est ensuite réalisé par attaque nucléophile des extrémités 3 OH de l ADN viral sur une liaison phosphodiester de l ADN de la cellule hôte, entraînant la ligation des extrémités virales 3 avec les extrémités 5 de l ADN cellulaire au sein du noyau. Le processus d intégration est achevé par des enzymes cellulaires permettant la réparation des brèches formées par l insertion de l ADN viral (Skalka and Katz, 2005). Ces brèches, sont comblées par la duplication de quelques nucléotides de part et d autre du provirus. La taille de cette duplication est spécifique de chaque virus, 6 pb pour les virus ALSV et 5 pb pour HIV-1. Une telle intégration est dite concertée, désignant l insertion simultanée des deux extrémités virales sur un même site de l ADN génomique Cofacteur de l intégration Certaines protéines virales agissent comme des co-facteurs de l intégration. Ainsi la nucléocapside pourrait avoir un rôle de protection du génome viral augmentant sa stabilité (Van Maele and Debyser, 2005). In vitro, elle est notamment capable de stimuler l intégration concertée (Carteau et al., 1999). Différentes protéines cellulaires sont associées à l intégrase lors du processus d intégration. Diverses études ont cherché à identifier des facteurs cellulaires qui pourraient avoir un rôle dans l intégration. Ainsi les protéines HMG ont été identifiées, elles jouent un rôle dans la transcription et l architecture des chromosomes. In vitro, elles ont un effet sur la structure de l ADN favorable à l interaction avec l IN (Gao et al., 2003). La protéine BAF est elle aussi un cofacteur de l intégration, EPHE Banque de Monographies SVT 11

12 elle empêcherait l auto intégration de l ADN viral dans un autre ADN viral et stimulerait la capture de l ADN cible (Suzuki and Craigie, 2002; Van Maele et al., 2006). La technique de double hybride a permis de démontrer une interaction entre l IN et la protéine INI1 (integrase interactor) (Kalpana et al., 1994). Cette protéine est un constituant du complexe SWI/SNF intervenant dans le remodelage de la chromatine pour faciliter l accès à la machinerie transcriptionnelle (Mahmoudi et al., 2006). Cette interaction INI1 et IN pourrait faciliter l intégration dans des sites privilégiés du génome cellulaire (Turelli et al., 2001). La protéine LEDGF/p75 est, à ce jour, le cofacteur le plus étudié car elle est clairement impliquée dans le processus d intégration. A partir d extraits nucléaires, un isolement de l intégrase a permis de montrer que la protéine LEDGF était associée à cette dernière. Une forte interaction avec un tétramère d intégrase a également été mise en évidence (Cherepanov et al., 2003) et le domaine d interaction avec l IN a été identifié (Busschots et al., 2007; Cherepanov et al., 2004). Cette protéine accroît fortement l activité de transfert de brins in vitro (Cherepanov et al., 2003). Elle stimule également l activité de liaison à l ADN et augmente la solubilité de la protéine IN VIH-1 et VIH-2 (Busschots et al., 2005). De plus, cette protéine pourrait favoriser l accrochage de l IN à la chromatine (Emiliani et al., 2005). Enfin, elle aurait un rôle dans la sélection du site d intégration (Ciuffi and Bushman, 2006; Ciuffi et al., 2005). Cependant, la protéine LEDGF/p75 est un cofacteur des lentivirus uniquement et n a pas d action sur l intégrase des autres rétrovirus. Il existe d autres cofacteurs de l intégration, comme la protéine EED (embryonic ectoderm development) qui interagirait avec l intégrase au niveau de son domaine C-terminal. Elle montre un effet positif sur l activité de l intégrase (Violot et al., 2003). Cependant, il a été montré que EED possédait une interaction plus importante avec la matrice et la protéine Nef (Rakotobe et al., 2007; Witte et al., 2004) Site d intégration Actuellement les éléments impliqués dans le choix du site d intégration restent indéterminés. Néanmoins, outre le cas des ALSV, pour lesquels les sites d intégration se répartissent au hasard dans le génome, des zones préférentielles d intégration ont pu être définies. Pour le virus MLVet PERV (Porcine Endogenous Retrovirus), les sites d initiation de la transcription et les îlots CpG seraient préférentiellement ciblés lors de l intégration (Moalic et al., 2006; Tsukahara et al., 2006). Concernant le VIH, l intégration s effectuerait préférentiellement dans des régions fortement transcrites à l intérieur même des gènes (Lewinski et al., 2006). Ainsi, l implication de plusieurs protéines peut être envisagée dans la sélection des sites d intégration, notamment LEDGF/p75 dans le cas du VIH (Ciuffi and Bushman, 2006). A noter que, pour la totalité des rétrovirus les régions d hétérochromatine situées au niveau des centromères et des télomères ne sont pas des sites favorables à l intégration. 3. Tests d activités in vitro de l intégrase du VIH-1 L étude des mécanismes de l intégration, ainsi que le développement d inhibiteurs dirigés contre l IN du VIH-1 ont été rendus possibles grâce à la mise en place de tests in vitro. EPHE Banque de Monographies SVT 12

13 Ces tests ont été développés afin de mieux connaître les mécanismes mis en jeu dans le processus d intégration. Il en existe plusieurs : (i) des tests d activités de l IN permettant d étudier chaque étape du mécanisme séparément (tests des constantes catalytiques) et (ii) un test portant sur le mécanisme global d intégration (test d intégration concertée) Mesure des constantes catalytiques de la protéine intégrase. La mesure des activités catalytiques se fait par trois tests différents : clivage, transfert de brin et désintégration, les deux premiers reproduisant les étapes de l'intégration. A noter que la désintégration est la réaction inverse de la réaction de transfert de brin. Cette réaction inverse a été observée uniquement in vitro et son existence in vivo est peu probable (Chow et al., 1992). Ces mesures sont réalisées avec la protéine intégrase purifiée à partir de vecteurs bactériens, de virus, du PIC ou encore à partir de cellules. Ces tests utilisent des oligonucléotides de synthèse mimant la séquence att des extrémités du génome viral (Hindmarsh and Leis, 1999; Moreau et al., 2004). La réaction de clivage : La réaction de clivage en 3 mime la première réaction catalysée par l intégrase lors du processus d intégration. Elle consiste à mettre en présence l IN et des oligonucléotides marqués, contenant eux même la séquence U3 ou U5 virale. Les produits d intégration sont analysés par électrophorèse. Si l intégrase a clivé l oligonucléotide de départ, un produit plus court de 2 nucléotides sera détecté. Le transfert de brin : Il s agit de la deuxième réaction catalysée par l intégrase. Elle consiste à mettre en présence l intégrase avec des oligonucléotides marqués déjà préclivés présentant une extrémité CA-OH en 3. Plusieurs bandes migrent moins loin sur le gel et sont appelées bandes «retardées», elles correspondent aux produits de transfert de brin et sont observables en cas de réaction positive. La réaction de désintégration : Cette activité dépend uniquement du site catalytique de l enzyme, son intérêt est donc de déterminer si le site catalytique de la protéine est fonctionnel. Des oligonucléotides mimant les produits de la réaction de transfert de brin et l IN sont coincubés. Si l IN est active, le produit sera clivé et les oligonucléotides présentant une extrémité CA- OH en 3 seront observés sur gel. EPHE Banque de Monographies SVT 13

14 3.2. L intégration concertée in vitro Les tests précédants permettent d étudier l activité de l IN en mimant les différentes étapes de l intégration. Cependant, ces tests correspondent au mécanisme d intégration d une seule des extrémités virales. Or, in vivo, l intégration correspond à l insertion simultanée des deux extrémités virales sur un même site de l ADN cellulaire, on parle d intégration concertée. Un test d'intégration a été développé in vitro afin de reproduire l intégration concertée observée in vivo (Goodarzi et al., 1995; Hindmarsh and Leis, 1999; Moreau et al., 2004; Moreau et al., 2003; Sinha et al., 2002). Cette reconstitution de l'intégration in vitro nécessite plusieurs éléments : - Un plasmide receveur représentant l'adn cible, qui peut être présenté sous forme superenroulé ou circulaire, - La protéine IN purifiée à partir de bactéries (production grâce à un vecteur d'expression) ou à partir de virions, - L'ADN donneur, qui varie selon le virus étudié. Il est de petite taille (environ 300 pb) et se compose d un gène de sélection et des 10 à 20 nucléotides terminaux des séquences LTR (séquences att). L insertion de l ADN donneur marqué au sein de l ADN receveur est catalysée par l intégrase. Cette réaction donne naissance à trois types de produits : - Les produits d intégration concertée : correspondant à l insertion simultanée des deux extrémités virales de l ADN donneur sur un même site de l ADN receveur et entrainant la duplication de quelques paires de bases afin de combler les brèches causées par l intégration. - Les produits d intégration non concertée : correspondant à l insertion d une seule ou de plusieurs extrémités provenant d un même ADN donneur, ou de plusieurs, en différents sites de l ADN receveur. - Les produits d auto-intégration : correspondant à l insertion d un ADN donneur dans un autre. Dans ces tests in vitro, d autres éléments semblent indispensables tel que l addition d ions métalliques divalents (Mg 2+, Mn 2+ ). Les ions Mg 2+ / Mn 2+ sont requis pour la formation d un complexe stable IN/ADN (Wolfe et al., 1996) ainsi que dans les étapes de clivage et de transfert de brin. In vivo, l ion Mg 2+ est considéré comme le cofacteur de l intégration car il est présent en grande quantité dans la cellule. D après certaines études Mg 2+ influence la reconnaissance spécifique de l ADN par l intégrase in vitro (Johnson et al., 2006). Cependant, les ions Mn 2+ sont parfois utilisés car l activité de IN est généralement plus importante en leurs présence (Wolfe et al., 1996). Les ions Mn 2+ pourraient néanmoins favoriser l intégration non concertée (Vora et al., 1994). Il a été montré que les ions Zn 2+ stimulent l activité catalytique de l IN (Yang and Roth, 2001) et EPHE Banque de Monographies SVT 14

15 augmentent l activité Mg 2+ dépendante (Asante-Appiah and Skalka, 1999; Leh et al., 2000). Par ailleurs, la présence de zinc influence l oligomérisation de la protéine en favorisant la formation de tétramères (Leh et al., 2000). Dans d autres expériences, des protéines cellulaires ou virales ont été ajoutées afin d améliorer l efficacité du test (Sinha et al., 2002). Ainsi, l ajout de la protéine HMG-I (Y) ou de la protéine BAF dans la réaction d intégration in vitro favorise la formation du complexe ADN donneur / IN (Harris and Engelman, 2000). Enfin, la protéine NC (Viral Nucleocapsid protein) peut être ajoutée, elle favoriserait l intégration via son domaine en doigt de zinc (Carteau et al., 1999). Chapitre III : La protéine intégrase 1. Structure et fonction des différents domaines L intégrase du VIH est une protéine de 288 acides aminés divisée en trois domaines fonctionnels bien définis et conservés entre les différentes intégrases rétrovirales: (i) le domaine N terminal, (ii) le domaine central et (iii) le domaine C terminal. Tous sont nécessaires au processus d intégration aidant à la formation d un complexe intégrase/adn viral/adn cellulaire. La structure de la protéine IN entière n a pas été déterminée. En effet, plusieurs facteurs, en particulier la faible solubilité et l agrégation de la protéine rendent difficile les expériences de cristallisation et donc la détermination de la structure entière de l IN. L utilisation de mutants tel que le F185K chez le VIH, permettant d augmenter la solubilité de l intégrase (Jenkins et al., 1996) ont permis d obtenir la structure cristallographique des domaines 2 à 2 de l intégrase. Le domaine central a été cristallisé avec le domaine N-terminal (Wang et al., 2001) et avec le domaine C-terminal (Chen et al., 2000). EPHE Banque de Monographies SVT 15

16 1.1. Le domaine N-terminal Le domaine N-terminal ou NTD (résidus 1 à 50), est caractérisé par un motif protéique HHCC (His-12, His-16, Cys-40, Cys-43) conservé chez toutes les IN des rétrovirus. La détermination de sa structure a été faite par RMN (résonance magnétique nucléaire)(cai et al., 1997) et montre qu il a une structure dimérique et que chaque monomère est composé de quatre hélices α et d un ion Zn 2+. Ce domaine a également été cristallisé avec le domaine central pour HIV. Ce domaine possède la capacité d interagir avec les ions zinc pour stabiliser la conformation de la structure hélice-bouclehélice de la protéine (Eijkelenboom et al., 1997). Ce domaine est impliqué dans la multimérisation de la protéine (Zheng et al., 1996). En effet, la fixation des ions Zn 2+ favoriserait l oligomérisation, notamment la formation de tétramère d IN (Lee et al., 1997). Cette multimérisation stabiliserait le complexe IN/ADN augmentant ainsi l activité de la protéine. La délétion ou la mutation de ce domaine (Khan et al., 1991) induisent une perte des activités de clivage et de ligation mais n affectent pas la réaction de désintégration. Ces résultats suggèrent que ce domaine pourrait donc être impliqué dans la reconnaissance des extrémités virales, mais ceci reste encore très controversé (Katzman and Sudol, 1998) Le domaine central Le domaine central (résidus 50 à 212) est le domaine le plus conservé entre les différentes protéines intégrase. La structure de ce domaine a été obtenue par cristallographie (Dyda et al., 1994). Le domaine central se présente sous forme de dimère en solution, il est constitué de 5 feuillets β et de 6 hélices α. L interface de dimérisation est formée par des liaisons hydrophobes entre l hélice α1 et l hélice α5. La structure de ce domaine révèle que l IN fait partie de la famille des nucléases et des polynucléotidyltransférases telle que la RNaseH d E.Coli. L analyse de la structure du domaine central par rayon X, a mis en évidence la présence d une boucle flexible entre les résidus 141 et 148 de l IN VIH qui se situerait, après repliement de la protéine, à proximité du site catalytique (Chen et al., 2000) Ce domaine porte le site catalytique de l enzyme, site défini par le motif DDE (deux résidus Asparagine et un résidu Glutamine). Ces résidus sont situés respectivement en position 64, 116 et 152 pour l intégrase VIH-1. Les résidus D64 et D116 interviennent dans la fixation du Mg 2+, augmentant l activité catalytique de la protéine (Goldgur et al., 1998). Toute mutation de l un des trois résidus du site catalytique empêche les réactions de clivage, de ligation et de désintégration in vitro (Engelman and Craigie, 1992; Gao et al., 2004). Par exemple, pour le mutant E152D, toutes les activités catalytiques de la protéine sont inhibées. D autre part, des mutations ponctuelles de résidus appartenant à la boucle flexible, citée précédemment, ont montré (i) son implication dans la fixation à l ADN, (ii) l importance de sa EPHE Banque de Monographies SVT 16

17 flexibilité pour les activités catalytiques de l IN (De Lucas et al.,2005; Lee et al.,2005a). Ce domaine serait également impliqué dans la reconnaissance spécifique des extrémités de l ADN viral et la fixation de l ADN cible (Chen et al., 2006). Néanmoins, ce rôle dans la reconnaissance de l ADN viral ne semble pas être porté exclusivement par le domaine central. Il semble que la reconnaissance de l ADN viral et de l ADN cible ne puisse pas avoir lieu sans les domaines N et C terminaux (Lee et al., 2005a). On peut noter que le domaine central interagit avec le facteur LEDGF/p75. Cette interaction est essentielle pour l association de l IN avec la chromatine et la stabilité de la protéine virale dans les cellules humaines (Maertens et al., 2003) Le domaine C-terminal Le domaine C-terminal ou CTD, constitué des acides aminés 212 à 288, est le domaine le moins conservé entre les différentes intégrases rétrovirales. La structure de ce domaine, qui dimérise en solution, a été déterminée par RMN (Lodi et al., 1995). Il est formé de 5 feuillets β, caractéristiques des domaines SH3 (Src-homology 3), généralement impliqués dans la liaison et la fixation des molécules d ADN. La structure dimérique de ce domaine présente un sillon, composé de nombreux résidus chargés. De par sa taille, ce sillon pourrait fixer une hélice d ADN double brin. De plus, une mutation de la lysine 264 entraîne une baisse importante de la liaison à l ADN, suggérant ainsi que ce résidu est impliqué dans l intéraction ADN-intégrase (Lutzke et al., 1994). Le domaine C-terminal est également impliqué dans la multimérisation de la protéine (Lutzke and Plasterk, 1998). Enfin, la localisation des domaines C-terminaux des intégrases de SIV, HIV et de RSV par rapport au domaine central montre une liaison entre les domaines qui diffèrent entre ces trois virus. Cette différence prouve la flexibilité de la liaison entre les domaines central et C-terminal. 2. Structure oligomérique de l intégrase En solution l intégrase des ALSV existe sous forme de monomères, dimères et tétramères (Coleman et al., 1999). Les formes multimériques de l IN VIH-1 ont, elles aussi, été déterminées (Lee et al., 1997). L état d oligomérisation de l IN en solution dépend de plusieurs facteurs tels que la présence de ses substrats ADN, la concentration en protéine, l interaction avec des cations et la présence de détergents. Les tests de complémentation mettant en jeu des mutants de l intégrase ont permis de montrer que l IN fonctionne au minimum sous forme de dimères (Engelman et al.,1993; van Gent et al., 1993). Les mutants, individuellement inactifs, doivent être combinés, afin de restaurer l activité catalytique de l enzyme. Par ailleurs, ces mêmes expériences utilisant des mutants ponctuels au niveau du site catalytique de la protéine ont mis en évidence que la complémentation du domaine N terminal par rapport au site actif n avait lieu qu en trans, c'est-à-dire que les domaines N-terminal et central sont situés sur deux molécules d intégrase différentes. Par contre, la complémentation du domaine C terminal peut se faire soit en trans soit en cis, c est à dire que les deux domaines peuvent être, soit portés par la même molécule d IN (cis), soit par deux molécules différentes (trans) (Engelman et al., 1993). Les données actuelles issues de tests biochimiques et de tests de EPHE Banque de Monographies SVT 17

18 complémentation laissent penser à un niveau élevé de multimérisation de l intégrase, de l ordre du dimère, plus probablement du tétramère ou de l octamère. 3. Les formes actives de l intégrase Pour les deux enzymes IN VIH et IN ALSV, l espace compris entre les deux sites actifs de la structure dimérique ne correspond pas à l espace existant entre les deux sites de clivage au niveau de l ADN cible. En effet, les deux sites actifs de la forme dimérique sont séparés de 45 Å, alors que des études portant sur les distances des sites d intégration sur l ADN cellulaire ont montré que ces sites sont séparés par Å. La forme tétramérique de l intégrase est quant à elle compatible avec ces contraintes structurales nécessaires à l intégration simultanée des 2 extrémités de l ADN viral (Yang et al., 2000). De plus, le tétramère d intégrase a été mis en évidence dans la cellule (Cherepanov et al., 2003; Karki et al., 2004). Enfin, une dernière étude vient confirmer le modèle tétramérique, après fixation par un agent chimique des différentes formes oligomériques de l intégrase, ces dernières ont été testées en intégration in vitro. Seule la forme tétramérique de l intégrase est capable de réaliser l intégration concertée (Faure et al., 2005). Ces résultats, ont permis de proposer un modèle d action de l intégrase : un dimère d intégrase viendrait se fixer à chaque extrémité virale. Ces dimères catalyseraient la coupure en 3 et s associeraient par la suite en tétramère pour réaliser le transfert de brin. Au cours de l intégration l IN formerait donc un complexe stable dans lequel un tétramère serait associé avec une paire d extrémités virales (Guiot et al., 2006; Hayouka et al., 2007; Li et al., 2006b). Enfin, certains auteurs suggèrent que l intégrase pourrait être sous forme d octamères dans sa structure active (Heuer and Brown, 1997). 4. Influence de l ADN sur la structure Certains auteurs ont cherché à déterminer la structure du complexe actif en mettant en solution l ADN viral et la protéine IN. Ainsi, en figeant la structure par formation de pont disulfure entre l ADN viral et l intégrase, l équipe de Gao a pu révéler des contacts spécifiques entre l ADN et les protéines. Ces contacts ont permis de développer un modèle de tétramérisation (Gao et al., 2001). Les auteurs montrent également que la conformation du complexe se modifie une fois l ADN viral clivé. D autres auteurs ont montré l influence de la fixation de l ADN sur le complexe actif (Deprez et al., 2001; Vercammen et al., 2002). Une étude montre notamment que lorsque l ADN se fixe au niveau du complexe, les formes tétramériques présentes dans le milieu sont converties en forme dimérique et monomérique à 37 C (Deprez et al., 2001). A l inverse, une autre étude montre que lorsque la protéine intégrase est en interaction avec un ADN, elle se présente majoritairement sous forme de tétramères (Vercammen et al., 2002). Ces deux études contradictoires, ont été réalisées dans des EPHE Banque de Monographies SVT 18

19 tampons différents et utilisaient des intégrases purifiées selon des protocoles différents, la comparaison reste donc difficile. On peut néanmoins conclure que la fixation à l ADN influence la formation du complexe oligomérique bien que la nature de cette influence reste indéterminée. Une dernière étude vient confirmer cette hypothèse, un peptide dérivé de la protéine LEDGF/p75 a été produit. Ce peptide se lie spécifiquement aux tétramères d intégrase modifiant ainsi l état d oligomérisation de l intégrase dans le milieu et inhibe toute activité enzymatique ou de liaison à l ADN de cette dernière. Les auteurs suggèrent que l intégrase se lie à l ADN sous forme de dimère et tétramérise par la suite pour effectuer l intégration (Hayouka et al., 2007). 5. Modèle de structure de l intégrase Les seules représentations de l interaction IN/ADN disponibles sont des modèles qui proposent : - des assemblages des trois domaines de l IN pour former une protéine entière - des arrangements de plusieurs monomères entre eux pour former un dimère ou un tétramère - des modes de liaison de l ADN viral et de l ADN cible Les différentes méthodes utilisées pour construire ces modèles se basent principalement sur : - les structures cristallographiques et RMN des différents domaines de l intégrase - les différentes données biochimiques disponibles (données de pontage, d empreinte protéique, de mutagénèse ) Récemment un modèle composé de 2 dimères d IN associés avec les 2 extrémités de l ADN viral et avec l ADN cellulaire a été proposé (Wielens et al., 2005). Ce modèle est basé sur les données obtenues par la structure cristalline de la transposase Tn5. Les auteurs se sont également basés sur les données et les contraintes structurales connues de l intégrase, obtenues par des expériences de «photo-crosslink» ou de mutagénèse (Esposito and Craigie, 1998; Gao et al., 2001; Goldgur et al., 1998; Heuer and Brown, 1997; Jenhins et al.,1997). Cependant, sur ce modèle, on ne retrouve pas le positionnement des domains N et C-terminaux par rapport aux domaines centraux qui ont été observés sur les structures cristallographiques de Wang et al (2001) et Chen et al (2000). Ce modèle reprend l hypothèse que l intégrase agirait sous forme de dimère sur chacune des extrémités virales. De plus, il a permis de montrer que les résidus, E152, Q148, K156 sont impliqués dans la reconnaissance spécifique du dinucléotide CA de l extrémité de l ADN viral. Il confirme également la présence d une boucle flexible stabilisant le complexe entre les résidus (voir paragraphe 1.2. Le domaine central). Ce modèle parait le plus pertinent au vu des nombreuses contraintes prises en compte pour sa réalisation. Néanmoins, les différents modèles de structure de l intégrase ne pourront être validés qu avec la cristallisation entière de la protéine. La résolution de cette structure pourrait permettre de mieux comprendre son fonctionnement mais également de définir et développer de nouvelles drogues. EPHE Banque de Monographies SVT 19

20 Chapitre IV : Sida et thérapie Les rétrovirus sont des virus pathogènes, responsables de nombreuses maladies, que ce soit chez l homme (VIH) ou chez les animaux domestiques et d élevage (FIV, ALSV ). Chez l homme le syndrome de l ImmunoDéficience Acquise (SIDA), provoqué par le VIH touche actuellement 40 millions de personnes dans le monde (Who.int). On compte 4,3 millions de nouveaux cas d infection par le VIH et 2,9 millions de décès dus au SIDA en Depuis 1981, le sida aurait causé plus de 28 millions de mort. Aucun vaccin n est actuellement disponible contre le VIH, mais il existe de nombreux antirétroviraux dirigés contre ce dernier, utilisés dans le cadre des trithérapies : environ une vingtaine de composés sont disponibles à ce jour (De Clercq, 2004). Ces molécules agissent à des étapes clés du cycle viral, notamment contre deux enzymes, la transcriptase inverse (RT) et la protéase. Une dernière molécule, agissant au niveau de l entrée du virus dans la cellule, a récemment été mise sur le marché EPHE Banque de Monographies SVT 20

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