Photométrie d'émission atomique de flamme
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- Constance Baril
- il y a 7 ans
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1 Photométrie d'émission atomique de flamme (FEP : flame émission photometry, ou FES : flame émission spectroscopy, en anglais) 1. Présentation du phénomène physique d'émission atomique 1.1. Définition de l'émission atomique L'émission d'un rayonnement électromagnétique du à la désexcitation d'atomes ou de molécules qui ont été excités par un apport suffisant d'énergie est un phénomène physique bien connu (si on projette du sel de cuisine dans une flamme au gaz de ville, une émission jaune caractéristique due au sodium apparaît). La photométrie d'émission atomique mesure l'émission d'un rayonnement électromagnétique UV ou visible due à la désexcitation d'atomes qui ont été excités par l'énergie apportée par une flamme. Les flammes utilisées en pratique permettent l'émission par les atomes des séries des alcalins, de quelques alcalino-terreux et de quelques autres métaux (Na, K, Li, Ba...). La mesure quantitative de l'émission permet des dosages L'excitation des atomes d'un échantillon à doser par une flamme Par la flamme, dont la température est élevée, l'objectif est de réaliser la combustion des molécules, organiques et la vaporisation de la matrice de l'échantillon à analyser ainsi que la dissociation des composés dans lequel l'élément à doser est engagé. L'élément à doser passe sous forme de vapeur atomique. Sous I'effet des températures élevées, certains atomes sont excités et voient leurs électrons passera des niveaux d'énergie supérieurs. Les niveaux excités sont instables et le retour au niveau fondamental d'énergie minimale conduit à une libération d'énergie sous forme d'un rayonnement électromagnétique de longueur d'onde caractéristique de l'atome qui se désexcite. C'est la mesure de l'émission à une longueur d'onde caractéristique de l'atome à mesurer qui fonde la photométrie d'émission atomique de flamme (FEP). Soit l'exemple du chlorure de sodium dans une flamme air (dioxygène) - propane. Le sodium (présent à l'état Na + dans l'échantillon de départ) est atomisé par la flamme; une fraction du sodium atomique passe à l'état excité et le retour à l'état fondamental s'accompagne d'une émission notamment à 589,0 et 589,6 nm. v = ΔE / h, donc λ = hc / ΔE avec h constante de Planck, c célérité de la lumière, v fréquence, λ longueur d'onde, ΔE saut d'énergie. Le spectre présenté ci-dessus présente une partie seulement des transitions permises chez l'atome de sodium. Les 2 raies très proches à 589,0 et 589,6 nm correspondent à un effet de changement ou pas de spin. Déterminer a priori quelles sont les transitions énergétiques permises et leurs intensités chez un atome est du ressort de la physicochimie quantique et est ici hors sujet. Il suffit de savoir qu'un atome donné possède un spectre de raies d'émission caractéristique, ce qui permet des identifications. En FEP, Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 1/6
2 on mesure l'émission pour une longueur d'onde caractéristique de l'atome à doser pour laquelle l'émission est intense : c'est l'aspect sélectif des mesuraqes réalisés en FEP. 2. Instrumentation : schéma d'un photomètre de flamme Un spectrophotomètre de flamme va permettre de réaliser des dosages (aspect quantitatif) sélectifs de métaux alcalins et alcalinoterreux. 6 points à retenir : arrivées à débits contrôlés (par contrôle de pression) des gaz comburant et combustible nébuliseur nébulisant l'échantillon à débit constant dans la flamme fente de sortie mesurant le flux émis dans une zone de flamme de température constante sélection d'une longueur d'onde caractéristique du spectre de raies de l'atome à mesurer brûleur photoréception de l'émission ; traitement du signal Le schéma présente la structure d'un photomètre de flamme. La partie nébuliseur a été détaillée. La nébulisation utilise généralement l'effet Venturi : le comburant en provenance d'un réservoir de gaz sous pression traverse un conduit qui se termine par un orifice étroit qui entraîne une vitesse de sortie élevée et une dépression alentour. C'est là qu'est placée l'extrémité d'un tube plongeant dans l'échantillon à analyser. L'échantillon est aspiré à débit continu constant et est <> géb a u i é A. Les grosses gouttelettes qui perturberaient la flamme sont éliminées lors de la traversée d'un bol où elles se déposent sur les parois. Le.nébuliseur doit absolument fournir un débit constant d'échantillon dans la flamme. Il existe des systèmes de nébulisation à ultrasons. 3. Justification de l'aspect quantitatif de l'émission atomique Soit un système permettant d'introduire un échantillon par nébulisation dans une flamme (cela signifie qu'il est introduit sous forme d'un fin brouillard de gouttelettes de quelques dizaines de µm de diamètre). Soit ce même système permettant d'introduire l'échantillon nébulisé à débit continu et constant dans une flamme obtenue par combustion à débit continu et constant de 2 gaz: le combustible et le comburant (dans chaque zone de la flamme, la température sera constante). Soit une température de flamme parfaitement constante. Soit cette même flamme convenable (assez chaude) pour l'atomisation de l'élément à doser et l'excitation d'une fraction des atomes. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 2/6
3 On montre que : Seule une fraction très faible des atomes obtenus (alcalins ou alcalino-terreux à doser) est excitée. Cette fraction est en équilibre dynamique, elle émet un flux de photons d'intensité constante aux longueurs d'onde correspondant au spectre de raies des atomes excités. On peut revoir à ce propos un cours de physique sur la statistique de Boltzman (à 2000 K la fraction d'atomes de sodium excités pour l'émission à 589,0 nm est de 9, ; à 4000 K cette fraction est de 4,4.10-3,...) Si on choisit de mesurer le rayonnement émis à une longueur d'onde caractéristique de l'élément à doser, l'intensité est proportionnelle à sa concentration dans l'échantillon. A la stricte condition que le débit et la température de flamme soient constant). Soit C la concentration en élément à doser de l'échantillon. Si le débit d'introduction de l'échantillon nébulisé dans la flamme est constant, alors : D att = k C (a) (avec k coefficient constant pour l'analyse et D att le débit total en atomes à doser dans la zone mesurée de la flamme) Si la température de flamme est constante, le rapport entre les atomes à l'état fondamental et à l'état excité est un coefficient donné constant (k'), donc : D at* / D at0 = k' (b) (avec D at* pour les atomes excités et D at0 pour les atomes à l'état fondamental et D at* + D at0 = D att ). Or, l'émission à un instant t est proportionnelle au nombre d'atomes excités. On a ainsi : Φ e = coef D at* (c) (avec Φ e flux lumineux émis) La combinaison de (a), (b) et (c) montre ainsi que (à débit nébulisé et à température de flamme constants) Φ e est proportionnel à C. Remarque: en fait, une partie de l'énergie émise sous forme de photons peut être absorbée par un élément (de même espèce) non excité (excitation par photon de λ convenable). La linéarité est une pseudo-linéarité... Remarque: la relation de Boltzmann qui donne la fraction d'atomes excités à une température donnée est : N e / N 0 = e -ΔE/kT avec N e nombre d'atomes excités, N 0 nombre d'atomes à l'état fondamental, ΔE écart d'énergie entre niveau excité et fondamental, T température absolue, k constante de Boltzmann. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 3/6
4 4. Bilan concernant les fonctions de la flamme La flamme d'un appareillage FEP remplit plusieurs fonctions : chaleur suffisante pour la création de la vapeur atomique de l'élément à doser ; excitation thermique de l'élément à doser. Selon sa température, telle ou telle flamme est plus ou moins apte à atomiser et exciter tel ou tel élément à doser. Il convient de se référer aux données de la littérature. Les flammes utilisées en pratique sont décrites dans le tableau ci-dessous : comburant utilisé pour le combustible correspondant température dioxygène propane 2000 C, adaptée pour doser Na +, K +, Ca 2+. dioxygène butane dioxygène acétylène protoxyde d'azote acétylène 3200 C, adaptée pour doser Na +, K +, Ca Applications de la FEP et réalisation des mesures Appareillages entièrement automatisables utilisés pour l'analyse des éléments alcalins et alcalinoterreux de solutions aqueuses ou organiques Applications Dosages d'éléments alcalins ou alcalino-terreux Na, K, Ça, Li, Fe, Ba...(qui sont en fait sous forme ionisée Na +, K +, Ca 2+, Li 2+, Fe 2+ avec Fe 3+, Ba dans la plupart des échantillons biologiques) dans : liquides biologiques comme le plasma sanguin ; produits pharmaceutiques ; produits alimentaires, boissons ; rejets industriels, eaux usées ; produits minéraux utilisés en métallurgie Exécution des mesures On règle le monochromateur à une longueur d'onde caractéristique et si possible spécifique de l'élément à doser. Les dosages sont réalisés par comparaison avec les résultats d'émission obtenus pour des solutions étalons de l'élément à doser. On établit une fonction d'étalonnage dans la zone pseudo-linéaire de la fonction émission = f(concentration), là où la sensibilité sera la meilleure. Les particularités techniques sont multiples, quelques unes sont exposées ci-dessous Effet émission par le fond de flamme et la matrice de l'échantillon à doser. Dans la flamme, la flamme elle-même, la matrice de l'échantillon à mesurer et le solvant de dilution émettent un spectre lumineux (c'est la somme du fond spectral de la flamme et du fond spectral de matrice et de solvant de dilution). Il convient donc de régler le "zéro" d'émission de l'appareil en nébulisant une matrice et un solvant judicieusement choisis. Il faudra aussi en tenir compte pour réaliser les solutions étalons. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 4/6
5 Formations chimiques stables de l'élément à doser dans la flamme L'éléments à doser peut exister sous forme de formations chimiques stables dans certaines flammes. Le dosage est donc faussé par défaut puisqu'on mesure les atomes excités et donc on ne mesure pas l'élément à doser demeuré dans les formations chimiques stables. C'est par exemple le cas de l'oxyde de calcium, de certains phosphates et silicates de calcium dans les flammes air/propane ou air/butane. La présence dans l'échantillon à mesurer d'autres anions ou cations que ceux de l'élément à doser peut modifier le rendement d'atomisation de la flamme. Le dosage est ainsi perturbé par de tels interférents. Plusieurs solutions permettent de remédier à ces phénomènes. Changer de flamme pour une flamme plus chaude, déstabiliser les formations stables par ajouts de réactifs. Les solvants pour réaliser les dilutions, les étalons prennent en considération les phénomènes cités cidessus. Il convient de préparer les échantillons et les étalons à l'aide de solvants amenant les «perturbateurs» selon leurs proportions connues dans l'échantillon à doser. Il convient donc de connaître l'origine de l'échantillon à doser. Étalonner par la technique des additions d'étalons à l'essai (méthode dite des ajouts dosés) Appareillages avec mesure d'un étalon interne Les meilleurs appareils permettent des mesures mettant en œuvre l'étalonnage avec étalon interne (introduction d'un élément étranger mesurable à une 2 longueur d'onde caractéristique différente de celle de l'élément à mesurer ; voir chapitre spécialisé sur les étalonnages avec étalon interne). Ceci permet d'éliminer les inconnus liés aux traitements préalables aux mesures des échantillons à doser et d'éliminer les erreurs dues aux variations éventuelles du débit de nébulisation dans la flamme Sensibilité et détectabilité usuelles Les dosages sont très précis. La sensibilité et la détectabilité sont excellentes même si elles sont un peu inférieures à ce qu'on obtient en absorption atomique (voir pourquoi dans le chapitre absorption atomique). On peut réaliser des dosages de traces de l'ordre de 0,1µg/mL. La verrerie en verre est donc non convenable pour les dosages de traces puisque le verre peut adsorber et libérer les ions à doser de façon mesurable! Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 5/6
6 Initiation aux dosages par photométrie d'émission atomique (FEP) : effets d'interférence, effets matrice, méthode des ajouts dosés : application au dosage du potassium. 1. Données En FES un certain nombre d'interférences et d'effet de matrice sont possibles. Dans le cas qui intéresse ici, on envisage de tenir compte de l'effet d'interférence des ions Na + pour le dosage des ions K + dans un milieu biologique où le rapport [Na + ]/[K + ] est voisin de 33. On pourrait aussi s'intéresser à un effet matrice lié aux protéines éventuelles d'un échantillon, surtout si elles sont concentrées ou autres... Note : l'énergie d'une flamme air/propane ou butane est suffisante pour ioniser en partie les éléments alcalins comme Na et K selon l'équilibre chimique atome cation + électron. Et on rappelle qu'en FES, on mesure ensuite l'émission des seuls atomes excités. Dans un échantillon, la présence d'un autre alcalin que celui à doser va libérer des électrons qui vont déplacer l'équilibre présenté ci-dessus vers la gauche. Ainsi, à concentration égale, l'émission d'un alcalin est plus forte dans un échantillon qui contient un autre alcalin suffisamment concentré. On a un effet interfèrent avec une perturbation de type «mesure en excès». 2. Travail pratique proposé Utiliser de l'eau bidistillée et de la «verrerie» plastique correctement conditionnée! En effet, le verre à tendance à piéger les cations sodium et potassium puis à les re-larguer... On dispose de la verrerie nécessaire, d'eau bidistillée et de deux solutions : - S1: NaCI à 25mmol/L environ (NaCI Ar = 58,5) ; - K1: KCI à 12,5mmol/L exactement (KCI Ar = 74,6). Réaliser une gamme potassium seul en eau bidistillée (donc sans sodium) : K1 K2 K3 K4 [KCI] en mmol/l 0,0125 0,050 0,125 0,250 Réaliser une gamme potassium en présence de sodium 33 fois plus concentré : KN1 KN2 KN3 KN4 [KCI] en mmol/l 0,0125 0,050 0,125 0,250 Interfèrent Na + Présent environ 33 fois plus concentré que K + Préparer aussi un essai potassium par dilution exacte convenable de l'échantillon à mesurer (attendu vers 4mmol/L en potassium et 33 fois plus en sodium). Étalonner le photomètre de flamme en mettant en œuvre la gamme potassium sans sodium. Le zéro est réalisé avec de l'eau bidistillée. Attention aux particularités techniques de l'appareil pour son réglage de zéro, de sensibilité et d'amplitude de l'échelle relative des signaux d'émission. Puis étalonner avec la gamme potassium avec sodium avec le même réglage de l'appareil. Puis mesurer l'essai dilué. Réaliser aussi un dosage par la méthode des ajouts : AD0 AD1 AD2 AD3 AD4 échantillon 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL Etalon KCI 0mL 0,100mL 0,200mL 0,400mL 0,600mL Eau bidistillée Qsp 100mL en fiole jaugée [K + ] en mmol/l X X + 0,0125 X + 0,0250 X + 0,050 X + 0,0750 Signal FEP 3. Compte rendu Tableaux de réalisation des gammes et des essais exposant le matériel utilisé, le protocole suivi et les résultats obtenus ; graphes d'étalonnages, commentaires. Résultats des essais et commentaire. Bibliographie : J-P. Père, Techniques spectroscopiques en biochimie analytique, CRDP Aquitaine, Max Feinberg, La validation des méthodes d'analyse, Masson, 1996 F. Lafont, C. Plas, P. Cazaubon, Exercices de biochimie, 2" édition, Doin, 2000 Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 6/6
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