Biopuces en pathologie Cardio-vasculaire

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1 Biopuces en pathologie Cardio-vasculaire Pr M.Doco-Fenzy Service de Génétique UE10 1 Définition des outils 2 Applications

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4 Waka Lin 2004 Support membrane de nylon Lame de verre, revêtement chimique Lame de verre, revêtement chimique Taille des spots 0,5-1mm 100-2um 20um Densité : spots/cm2 qq centaines jusque Sondes produits de PCR produits de PCR oligonucléotides courts (20-25 mers) oligonucléotides longs (30-70 mers) Cibles ADNc ADNc - ADN ARNc Produit de PCR Produit de PCR marquage chaud marquage froid marquage froid Indications analyse de l'expression analyse de l'expression analyse de l'expression ChIP-on-Chip détection de marqueurs moléculaires CGH-array

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10 Bacs Pacs Cosmides Fosmides

11 Taille des puces Puces clones Abbott Spectral Académiques : Sanger Puces clones Puces clones Puces clones Spectral Académiques : CIT Sanger Leuven Nijmegen Agilent Affimetrix Académiques : Sanger Leuven Nijmegen Nimblegen Agilent Affimetrix illumina

12 Types d analyses Analyse de l expression génique Analyse des déséquilibres quantitatifs du génome: délétion ou amplification, perte ou gain

13 Analyse de l expression génique différentes technologies High-density nylon membrane arrays Serial analysis of gene expression (SAGE) Short oligonucleotide arrays (Affymetrix) Long oligo arrays (Agilent) Fibre optic arrays (Illumina) cdna arrays (Brown/Botstein)*

14 Puces d expression : quantification d un signal de fluorescence

15 Analyse des déséquilibres quantitatifs du génome: délétion ou amplification, perte ou gain Array-CGH Hybridation Génomique Comparative

16 mitoses

17 Puce A-CGH Hybridation Génomique Comparative- array

18 CGH sur chromosome Normal Deletion Amplification Ratios vert/rouge Chromosome normal Contrôle FISH Enh (7) Insertion de 7q dans le 2p

19 BUT Rechercher des anomalies chromosomiques sur l ensemble du génome par la caractérisation des gains ou pertes de segments chromosomiques technique basée sur l'hybridation, sur des segments d ADN, de deux sondes (l ADN du patient et 1 ADN témoin) marquées par des fluorochromes différents. l hybridation du mélange des deux sondes est réalisée sur des spots d'adn issus de fragments de génome d'environ 150Kb chacun (BAC ou PAC) Exemple: PUCE 3500 clones BAC/PAC (VIB, Leuven) Résolution : 1 Mb (>> CGH sur chromosome : Mb)

20 BACS ou PACS ADN humain Lame

21 DNA

22 Lecture : Scanner et Logiciel

23 interprétation Délétion Scanner2 lasers Amplification

24 ADN du Patient en rouge / Témoin en vert Normal Deletion Amplification Ratios vert/rouge

25 LA CGH-ARRAY: TECHNIQUE DE CYTOGÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE MATÉRIEL : ADN ( cellules sanguines) METHODES : Marquage et amplification de l ADN (Random priming) Hybridation des ADN sondes sur une puce contenant pl milliers de séquences nucléotides choisies sur tout le génome Lavages post-hybridation Scannage des puces Analyse et interprétation des résultats

26 RANDOM PRIMING = Marquage des ADN A C A G T T C C G A T C G T G T C A A G G C T A G C C G A T C G C Amorces Cy5-dCTP DENATURATION THERMIQUE Enzyme Kleenow G T A C A G T T C C G A T C G T G T C A A A C T C G C A C C G A T C G T G T C A A G G C T A G C A G A C A G T T C C G A T C G T G T C A AG G C T A G C 1 nuit à 37 C A C A G T T C C G A T C G T G T C A A G G C T A G C

27 HYBRIDATION SUR LAME (3500 clones x 2 ou x 4) Zones d hybridation 1 : CRETEIL 2 : LOUVAIN

28 HYBRIDATION SUR LAME (3500 clones) (2) Ex : LOUVAIN Expérience en triangle A + B B + C C + A 3500 clones

29 SCANNAGE DES LAMES (1) Cy5 (635 nm) Cy3 (532 nm) Intensité de fluorescence Cy3 (u.a.) Pourcentage d évènements (%) Intensité de fluorescence (u.a.) Intensité de fluorescence Cy5 (u.a.)

30 SCANNAGE DES LAMES (2) ROUGE FCy5 > FCy3 = «ADN patient-cy5» dupliqué VERT FCy5 < FCy3 =«ADN patient-cy5» délété Clone dupliqué (duplicate) Clone délété (duplicate)

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32 ANALYSE ET INTERPRETATION DES RESULTATS Ratio = Log 2 FCy5 FCy3 1 Med Ratio Cy5/Cy3 normalisé 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0-1,5-2,0 Clones dupliqués Clones délétés Y X Exemple : XY (Cy5) + XX (Cy3) Dr E.Landais et Dr M.Doco-Fenzy, Service de Génétique, CHU-REIMS, UFR de Médecine,

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34 APPLICATIONS (3) Mise en évidence d une délétion chromosomique en 1p35.1 non visualisée sur le caryotype C A R Y O T Y P E (chr1) Bandes G Bandes R C G H I A R R A Y Ratios Cy5/Cy3 normalisés 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0-1,5 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0-1,5 Arr cgh 1p35.1p35.1 x 1 Cy5 Cy3 Chromosome 1 Dr E.Landais et Dr M.Doco-Fenzy, Service de Génétique, CHU-REIMS, UFR de Médecine,

35 APPLICATIONS (2) Mise en évidence d un déséquilibre supplémentaire non visualisé sur le caryotype: délétion 2q37 connue Ratios Cy5/Cy3 normalisés 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0 Ex : 46,XY,del (2)(q37) Cy5 Cy3 Chromosome 2 Ratios Cy5/Cy3 normalisés 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0 Arr cgh 3qter x 3 Cy5 Duplication 3qter diagnostiquée Cy3 Chromosome 3 Dr E.Landais et Dr M.Doco-Fenzy, Service de Génétique, CHU-REIMS, UFR de Médecine,

36 Intérêts : -outil de choix pour rechercher et caractériser en une seule expérience des anomalies chromosomiques sur l ensemble du génome d un patient -Technique de cytogénétique moléculaire (tube = ADN stocké pendant plusieurs années et peut être envoyé facilement) Limites : - Résolution 1 Mb ( puces ~ 0,1 Mb) - Les résultats nécessitent d être confirmés par FISH (délétions) ou par Q-PCR (duplications < 1 Mb) - Coût ( 1 recherche = 1 patient > 300 )

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41 Problème biologique Genes différemment exprimés Protocole experimental Estimation Manip Microarray Analyse de l Image Normalisation 16-bit TIFF (Ris, Rbf), (Vis, Vbf) R, V Testing Clustering Discrimination Vérification biologique et interprétation

42 Quantification de l expression A chaque spot de la lame on calcul intensité du rouge = Ris - Rbf IS = intensité des spots, BF = bruit de fond intensité du vert = Vis - Vbf Et calcul log (base 2) du ratio Log 2 (intensité Rouge / intensité Vert )

43 Expression des gènes p gènes pour n lames: p est O(10,000), n est O(10-100), lames Genes lame 1 lame 2 lame 3 lame 4 lame Niveau d expression du gene 5 sur la lame 4 = Log2(intensité Rouge / intensité Vert ) échelle des valeurs rouge (>0) jaune (0) vert (<0) scale.

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