Diagnostic Microbiologique

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1 Diagnostic Microbiologique

2 1- Historique Existence des micro-organismes et rôle dans les maladies : Lucrèce (98-95 av. JC) Première observation de micro-organismes : Antonie Van Leeuwenhoek (1673)

3 2- Place des microorganismes dans la classification des êtres vivants

4 Principales différences entre cellules Procaryotes et Eucaryotes Caractéristiques Membrane nucléaire Nb de chromosomes par noyau Réplication Organites intracellulaires Mouvements cellulaires Cellules Procaryotes (Bactéries) Absente 1 Scissiparité Absentes Par organites externes Cellules Eucaryotes (protistes,végétaux,animaux) Présente > 1 Mitose Présentes Par organites externes, mouvements amaeboïdes ou pseudopodes

5 Nomenclature

6 3- Les bactéries êtres vivants unicellulaires (procaryotes) multiplication par scissiparité 0,1 à 2 µm diamètre/0,5 à 5 µm long Gram +, Gram -, Mycobactéries Spore bactérienne: forme de survie de certaines bactéries Gram positif

7 4- Structure bactérienne A. Les enveloppes : la capsule, le glycocalyx, la paroi,la membrane cytoplasmique, B Les constituants internes : le cytoplasme, l'appareil nucléaire C. Les appendices externes : les flagelles, les pili D. La spore bactérienne

8 A:Les enveloppes : la capsule, le glycocalyx, la paroi la membrane cytoplasmique B. Les constituants internes : le cytoplasme, l'appareil nucléaire C. Les appendices externes : les flagelles, les pili

9 A- Les enveloppes *La capsule : constituant inconstant et superficiel Mise en évidence: Etat frais encre de Chine ou Bleu de méthylène, réaction Ag/Ac Composition : Polysaccharides

10 Rôles de la capsule: - virulence - pouvoir pathogène - antigénicité, - typage, - préparation de vaccins - diagnostic

11 * Le glycocalyx:feutrage de fibres polysaccharidiques Rôles - Adhésion entre microorganismes à une surface solide - Concentration des sécrétions - Réservoir - Protection «biofilm», «slime»

12 * La paroi : enveloppe rigide assurant l'intégrité de la cellule bactérienne et responsable de sa forme Mise en évidence et structure - Partie commune : le peptidoglycane - Paroi des bactéries à Gram positif : + acides téchoïques - Paroi des bactéries à Gram négatif : + lipopolysaccharides - Paroi des Mycobactéries : + lipides

13 Propriétés et rôles de la paroi bactérienne 1 Coloration de Gram 2 Forme des bactéries 3 Antigénicité (Ag O des Gram-) 4 Toxicité (LPS) 5 Site d'action d'antibiotiques (bêtalactamines, glycopeptides, fosfomycine)

14 1 Coloration de Gram 1 ère étape : cristal violet + Lugol 2 ème étape : décoloration à l'alcool-acétone 3 ème étape : recoloration à la fushine ou à la safranine violet = Gram + Rose = Gram -

15 2 formes de bactéries

16 * La membrane cytoplasmique Structure : Structure trilamellaire, perméases Fonctions Echanges bactérie/milieu extérieur Enzymes respiratoires Division bactérienne, Fixation flagelles Site d action d antibiotiques

17 B- Les constituants du cytoplasme * L'appareil nucléaire Structure 80% ADN, 10% ARN, 10% protéines pas de membrane nucléaire ADN du chromosome bactérien bicaténaire et circulaire Fonctions Support caractères héréditaires Division bactérienne Site d action d antibiotiques Plasmides

18 * Ribosomes Rôles Synthèse et exportation des protéines Site d action d antibiotiques (aminosides, tétracyclines, chloramphénicol, macrolides)

19 C- Les appendices externes * Les flagelles Organe de locomotion Structure Flagelline Nombre (1 à 30) disposition (polaire, péritriche) variables Rôles Antigénicité (AgH), mobilité (+/- tactisme)

20 * Fimbriae ou pili Gram négatif Rôles Fixation des bactéries aux tissus (pili communs) Rôle dans la conjugaison (pili "sexuel") = transfert de matériel génétique entre les bactéries

21 D- La spore bactérienne Gram positif Mise en évidence : Coloration au vert Malachite Sporulation/Germination Déclenchée par des modifications environnementales (déshydratation, densification, paroi épaisse) Fonctions Forme de survie de certaines espèces (transmission) Résistance (température, temps, UV, ATS, ATB) Classification (position, déformation)

22 5- Croissance et nutrition bactérienne * Division bactérienne Les bactéries se multiplient par fission binaire : - la cellule grandit - l'adn se duplique - la cellule se divise en 2 cellules filles séparées par un septum de division formé par la paroi cellulaire

23 * Dynamique de la croissance En milieu non renouvelé, on ensemence des bactéries qui ont des "âges" différents (non synchrones) on mesure par une méthode quelconque la croissance croissance en fonction du temps = courbe de croissance 5 phases sont distincts

24 1.Phase de latence : taux de croissance nul Elle est fonction de l'état physiologique de la bactérie et de son adaptation au milieu. 2.Phase exponentielle : le taux de croissance augmente et atteint sa valeur maximale et reste constant 3.Phase de ralentissement : le taux de croissance diminue, épuisement des nutriments, début d autolyse des bactéries 4.Phase stationnaire : valeur maximale possible de l'inoculum bactérien et arrêt de la croissance, le taux de croissance redevient nul (épuisement des nutriments et accumulation des déchets) 5.Phase de décroissance : ressources nutritives épuisées et accumulation de métabolites toxiques, entraînant une lyse des bactéries

25 In vitro, croissance variable en fonction du substrat énergétique fourni, du milieu de culture, de la bactérie. On peut obtenir des croissances continues par apport de milieu neuf dans l'industrie In vivo, variable en fonction des substrats (milieux complexes) des produits antibactériens, de la réaction cellulaire

26 * Croissance in vitro Augmentation masse cellulaire et nombre de cellules Croissance en milieu liquide - mesure de la croissance bactérienne par - Comptage direct des bactéries par repiquage numération des individus viables (1 bactérie = 1 colonie) - méthodes physicochimiques (pesée d'un culot, dosage N, mesure activité enzymatique/atp) - méthode optiques (densité optique, seuil de sensibilité UFC/mL) - dosage du gaz carbonique libéré pendant la croissance (Bactec)

27 Croissance en milieu solide Dépôt d'une cellule bactérienne à la surface d'une gélose nutritive amas visible à l'œil nu (colonie) dès qu'elle contient 10 6 bactéries (# 20 générations)

28 * Croissance in vivo TG = Temps de génération = temps mis par une bactérie pour se diviser µ = taux de croissance = nombre de divisions par unité de temps Ex : temps de génération = 20 mn µ = 3 divisions/heure Temps de génération (TG) in vitro et in vivo de quelques bactéries BACTERIE Escherichia coli Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Vibrio cholerae Mycobacterium tuberculosis TG IN VITRO (minutes) TG IN VIVO (heures)

29 *Conditions physicochimiques de la croissance Température : minimales et maximales de croissance - mésophiles (20 à 40 C) - thermophiles (> 40 C) - psychrophiles (4 à 20 C) - cryophiles (4 C) ph : bactéries liées à l'écosystème humain se développant à ph neutre (entre 5,5 et 8, optimum 7) Neutrophiles (5,5 à 8,5), alcalophiles, acidophiles

30 Pression osmotique : bactéries tolérantes aux variations de concentration ionique certaines espèces halophiles (Vibrio, staphylocoques) Pression partielle en oxygène : bactéries classées en fonction de leur rapport avec O2: - aérobies stricts, air ou oxygène, oxydation des substrats - aéro-anaérobies facultatifs, oxydation ou fermentation - anaérobies stricts, absence d'oxygène, fermentation - microaérophiles, pp oxygène < air

31 Aérobie strict Aéro-anaérobie facultatif Anaérobie strict Microaérophile

32 * Besoins nutritifs Substances nécessaires à l énergie et à la synthèse cellulaire. - Aliments énergétiques Substrats utilisables par la bactérie pour produire de l'énergie au cours de réactions cataboliques Substrats organiques, acide aminé, protéine Le glucose est le substrat énergétique carboné le plus couramment utilisé par les bactéries d'intérêt médical

33 - Aliments constitutifs Substrats nécessaires à la synthèse des molécules devant constituer de nouvelles bactéries Ions minéraux (Cl-,K+, Na++, Mg++, HPO4-) oligoéléments (Fe++) Sources de carbone (CO2, substrats organiques, glucose) Sources d'azote (ammoniac, sels d'ammonium, nitrate, nitrite, dérivé azoté organique)

34 * Facteurs de croissance Molécules organiques nécessaires à leur croissance les bactéries auxotrophes ne savent pas faire la synthèses ( prototrophes) Métabolites de structure/acides aminés, peptides, bases puriques ou pyrimidiques, acides gras vitamines ou coenzymes

35 - Pénétration des éléments constitutifs et des nutriments *Paroi puis membrane cytoplasmique à traverser : - Diffusion libre /gaz (O 2, CO 2 ), acides gras, certains nutriments liposolubles - Protéines de transport porines dans la paroi, perméases dans la membrane cytoplasmique *Substrats métabolisés équipement enzymatique et voies métaboliques propres à chaque espèce bactérienne *Sortie des métabolites protéines de transport, diffusion, ou lors de la lyse bactérienne

36 * Applications au laboratoire - Culture et isolement des bactéries Utilisation des besoins nutritifs et des conditions de croissance pour fabriquer des milieux permettant la culture et l isolement des bactéries Composition : Milieux synthétiques, semi-synthétiques, complexes Utilisation: Milieux d enrichissement, d isolement, d identification

37 Isolement Aspiration bronchique sur GS (A), GC (B) et milieu avec substrats chromogéniques (C) Sélectif Staphylocoque doré sur Chapman E.coli et Proteus mirabilis sur Drigalski Identification

38 Conditions de culture - Température - Besoin en CO2 - Anaérobiose

39 - Identification des bactéries (en + morphologie) Milieux spécifiques (sucres, sels minéraux, indicateurs de ph, sélectif) Etude des rapports avec l'oxygène

40 Recherche de catalase H 2 O 2 H 2 O + O 2 d'oxydase de nitrate réductase Etude du métabolisme glucidique (fermentation des sucres, utilisation des acides organiques, ) Etude du métabolisme protéique (production d'h2s, d'indole, recherche d'uréase, gélatinase, )

41 Automatisation Mise en évidence d une activité enzymatique ou d une activité fermentaire en galerie d identification

42 Corps humain 1- Flore commensale (10 13 cellules et microorganismes) Implantation des microorganismes sur la peau et les muqueuses : - adhésion des bactéries aux cellules épithéliales - persistance des bactéries implantées - facteurs influençant la flore endogène Rôle de la flore commensale : - résistance à l'infection - contribution nutritionnelle

43 Flores commensales Flore de la peau Flore des voies digestives Flore buccale Plaque dentaire Estomac Duodéno-jéjunum Intestin grêle Abond ance /cm /ml /gr /ml /ml Espèces principales Flore résidente Staphylocoques, microcoques, corynébactéries Flore transitoire Streptocoques, Neisseria, anaérobies Streptocoques, Neisseria, actinomycètes Anaérobies (Bacteroïdes, Clostridium, BGP non sporulés) Entérobactéries, streptocoques, staphylocoques

44 Ex : Flore digestive

45 - Micro-organismes «portage/pathogènes» Tube digestif : - Salmonelles, Shigelles, ORL :- Bordetella pertussis (coqueluche), - Neisseria meningitidis - Corynebacterium diphteriae (diphtérie), Respiratoire : - Mycobacterium tuberculosis - Pneumocoque - Haemophilus influenzae, Génital : - Neisseria gonorrheae (gonococcie), - Treponema pallidum (syphillis),