Annexe I Plan d action Convention de subvention 12INI214

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1 Annexe I Plan d action Convention de subvention 12INI214 «Surveillance de l endémie palustre et évaluation de l efficacité des médicaments pour une mise à jour de la stratégie de lutte contre le paludisme en République Démocratique du Congo» Référence : 12INI214. Porteur du projet : CECFOR / CEFA-Centre Hospitalier Monkole 4804, Avenue Ngafani. C/ Mont Ngafula - BP 817 Kinshasa XI - République Démocratique du Congo Membres du consortium Partenaires de mise en œuvre : Institut National de Recherche Biomédicale (INRB) Avenue de la démocratie - BP 1197 Kinshasa / Gombe - République Démocratique du Congo UMR-MD3 - Infections Parasitaires (Transmission, Physiopathologie et Thérapeutique) Aix-Marseille Université - 27 Bd Jean Moulin Marseille Cedex 5 - France Lieu(x) de réalisation du projet : République Démocratique du Congo Province de Kinshasa et du Bas Congo. Date de démarrage du projet : 1e novembre Durée du projet : 24 mois. Montant total du projet : EUR. Montant du financement maximum de l Initiative 5% : EUR. Référence de l appel à projets : 5PC , Recherche Opérationnelle

2 Liste des sigles et abréviations CECFOR Centre Congolais de Culture, de Formation et de Développement ISSI Institut Supérieur en Sciences Infirmières CH Monkole Centre Hospitalier Monkole CTA Centre de traitement ambulatoire DHA Dihydroartémisinine INRB Institut National de Recherche Biomédicale LNRP Laboratoire National de Référence du Paludisme PNLP Programme National de Lutte contre le Paludisme SP Sulfadoxine-Pyriméthamine AS Artésunate AQ Amodiaquine ACTS Artemisinin-based combination therapies, médicaments à base de dérivés d'artémisinine ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, dosage immunoenzymatique sur support solide K-LMP Laboratoire de microbiologie projetable TDR Test de diagnostic rapide UMR-MD3 Infections Parasitaire Transmission, Physiopathologie et Thérapeutique (Aix- Marseille Université) 2

3 PARTIE I PRESENTATION DE L ORGANISME SOUMISSIONNAIRE I. L organisme soumissionnaire principal Nom de l organisme : CECFOR / CEFA-Centre Hospitalier Monkole Adresse complète : 4804, Avenue Ngafani. C/ mont Ngafula. BP 817. Kinshasa XI. RD Congo Téléphone et adresse mail de l organisme : Statut juridique de l organisme : ASBL de droit congolais Date de fondation de l organisme : 1991 Nom et fonction des principaux dirigeants : Mr Louis IMWA, Président Directeur Général Dr Adolphe NDARABU, Directeur Administratif Pr Léon, TSHILOLO Médecin Directeur et Directeur de Recherche Dr Alphonse MOSOLO, Médecin Directeur Adjoint Dr Marie Dolores MAZUECOS, Coordinatrice des Services Nom de la personne contact sur le projet : Léon TSHILOLO Téléphone et adresse mail de la personne contact : leon.tshilolo2012@gmail.com Organigramme de l organisme : Nombre de personnels permanents en 2011 : 276 Nombre de personnels permanents prévus en 2013 : 350 3

4 Historique et principaux secteurs d intervention de l organisme : Le Centre Congolais de Culture, de Formation et de Développement (CECFOR) a été constituée officiellement en 1986 avec le statut d association sans but lucratif et a obtenu sa personnalité civile par l ordonnance n du 5 novembre L ASBL CECFOR a développé, depuis 1990, le Centre Hospitalier Monkole ( Par la suite, l'institut Supérieur en Sciences Infirmières (ISSI) a été créé en 1997 et forme des infirmières capables de dispenser des soins de qualité et d offrir un accueil personnalisé aux malades et à leurs familles. Enfin, le Centre de Formation et d Appui Sanitaire «CEFA» ( inauguré officiellement en 2001, est un cadre professionnel et technique pour les acteurs du monde médical où se tiennent des conférences, des séminaires, des tables rondes et des enseignements post-universitaires en vue de la formation continue. Le Centre Hospitalier Monkole (CH Monkole) est l Hôpital de référence de la zone de santé de Mont- Ngafula ( habitants) et intégré dans la politique édictée par le Ministère de la Santé. Il s engage à fournir des soins de qualité à une population en générale très démunie. Depuis mars 2011, le CH Monkole a conclu un contrat avec le Ministère de la Santé Publique qui porte sur l application de la convention de partenariat et l'intégration à la politique nationale de santé des formations sanitaires de l'asbl CECFOR. En 2012, dans le cadre de la promotion de la politique de Partenariat Public-Privé (PPP), le CH Monkole a bénéficié d un appui financier de l AFD pour son extension CHME, le renforcement des capacités dans la gestion et la construction d un centre de chirurgie pédiatrique dans un hôpital public. Depuis 2005, le CH Monkole a créé un CTA (Centre de traitement ambulatoire) grâce au financement du PNUD/Fonds mondial (FM) qui lui a permis d assurer le suivi régulier de près de 1200 sujets atteints de VIH, dont environ 800 sous ARV. Un travail réalisé dans un quartier défavorisé de Kinshasa, a permis de montrer l impact réel de l utilisation de la moustiquaire imprégnée sur la santé des enfants ; ceci a servi au PNLP pour faire du plaidoyer en faveur de l introduction systématique des moustiquaires imprégnées d'insecticides (MII) en RDC pour les populations à risque. Le CH Monkole est reconnu comme un centre de référence pour la drépanocytose, pour la qualité du suivi des malades et du dépistage néonatal. Depuis 2008, le CEFA assure un programme de formation continue en techniques de laboratoire destiné aux techniciens de laboratoires, étudiants, infirmières, médecins et biologistes. Le partenariat avec l INRB est habituel et de longue date en tant que poste sentinelle de surveillance de certaines pathologies, mais également dans le domaine de la formation en techniques de laboratoire par le truchement du CEFA. Par ailleurs, grâce au financement de la coopération belge, le CH Monkole va jouir, dans son extension CHME, d un nouveau laboratoire de plus de 300 m 2, laboratoire de compétence et de recherche médicale qui va servir aussi de lieu de stage et d apprentissage pour des professionnels de la santé. Le CH Monkole collabore avec l UMR-MD3 (Aix-Marseille Université) depuis plus de 5 ans. Dans ce cadre, des projets ont été développés (infection palustre et poumon, efficacité thérapeutique de molécules antipaludiques) et des médecins, scientifiques et étudiants congolais ont bénéficié de formation soit dans l unité soit à l Hôpital d'instruction des Armées Laveran. 4

5 II. Les autres membres du consortium Dans le cas d un consortium, remplir les données suivantes : 1. Institut National de Recherche Biomédicale Nom de l organisme : Institut National de Recherche Biomédicale (INRB) Adresse complète : Avenue de la démocratie BP 1197 Kinshasa/Gombe RD Congo Téléphone et adresse mail de l organisme : jjmuyembe@yahoo.fr Statut juridique de l organisme : Institution publique Date de fondation de l organisme : 1984 Nom et fonction des principaux dirigeants : Prof Jean-Jacques MUYEMBE TAMFUM, Directeur Nom de la personne contact sur le projet : Stomy KARHEMERE BI SHAMAMBA Téléphone et adresse mail de la personne contact : stomy_karhem@yahoo.fr Organigramme de l organisme : Nombre de personnels permanents en 2011 : 150 Nombre de personnels permanents prévus en 2012 : 153 Historique et principaux secteurs d intervention de l organisme : L INRB, inauguré en 1984, fonctionne sur base de l arrêté ministériel n 1250/CAB/MIN/S/CJ/11/2003 du 03/05/2003. Ses missions sont : Mettre en place un système de surveillance épidémiologique des maladies infectieuses en RD Congo ; Exécuter des recherches biomédicales dans le domaine de la prévention, du diagnostic de routine et du traitement de ces maladies ; Etre centre national de référence pour les maladies infectieuses en appui aux programmes de lutte contre les maladies ; Former ou recycler les chercheurs et techniciens de laboratoires. L INRB est géré par un conseil d administration composé d un représentant du Ministre de la Santé, du Médecin Directeur (Président du conseil), du Médecin Directeur adjoint, du chef du département scientifique, du chef du département technico-administratif et d un représentant du syndicat de l INRB. Le département scientifique comporte plusieurs services et unités dans lequel on retrouve le service d entomologie et de parasitologie. Ce dernier contient l unité de paludisme qui est Laboratoire National de Référence du Paludisme (LNRP). Ces deux services travaillent en étroite collaboration avec le Programme National de Lutte contre le Paludisme (PNLP). Dans le cadre de la subvention Fonds Mondial (Rounds 3 et 8), l INRB a organisé en collaboration avec l Ecole de Santé Publique de Kinshasa plusieurs formations de techniciens de laboratoire des Zones de Santé bénéficiant de cet appui. L INRB organise en collaboration avec l Institut de Médecine 5

6 Tropicale Prince Léopold d Anvers en Belgique un contrôle de qualité des laboratoires des hôpitaux publics. Il est membre d un réseau d évaluation externe de la qualité de «National Institute of Communicable Diseases (NICD)/WHO» depuis L INRB est un partenaire important du PNLP dans plusieurs recherches opérationnelles telles que le contrôle de l efficacité des antipaludiques, des insecticides et la surveillance entomologique. A ce titre, l INRB a piloté des études sur l efficacité thérapeutique des antipaludiques (artésunate + amodiaquine et artémether + luméfantrine) à Kisangani et Bolenge en (rapports des évaluations disponibles au PNLP). Cette année, l INRB va piloter les mêmes évaluations dans 6 sites sentinelles de surveillance du paludisme du PNLP (Kingasani, Kisangani, Rutshuru, Kapolowe, Mikalayi et Boende). 2. UMR - MD3 Nom de l organisme : UMR-MD3 - Infections Parasitaires (Transmission, Physiopathologie et Thérapeutique) Adresse complète : Aix-Marseille Université - 27 Bd Jean Moulin, Marseille Cedex 5 - France Téléphone et adresse mail de l organisme : Statut juridique de l organisme : EPSCP Date de fondation de l organisme : 1980 Nom et fonction des principaux dirigeants : Berland Y. - Président Nom de la personne contact sur le projet : Parzy D. Téléphone et adresse mail de la personne contact : d.parzy@free.fr / daniel.parzy@univ-amu.fr Organigramme de l organisme : Comité directeur N. Azas, E. Ollivier, F. Fumoux, D. Parzy, A. Iliadis, R. Piarroux, S. Manguin, F. Veas, E. Peytel Direction Directeur : D. Parzy Directeurs Adjoints : R. Piarroux, F. Veas Axes de recherche Conseil de laboratoire Ensemble des chercheurs seniors et des représentants des étudiants et personnels IATOS Thérapeutique N. Azas / E. Ollivier Physiopathologie F. Veas / D. Parzy Transmission R. Piarroux / S. Manguin B. Baghdikian D. Barbolosi S. Bun M. Casanova A. Dumetre R. Elias C. Faivre M. Laget V. Mahiou-Leddet H. Bun C. Chapus J. Ciccolini R. Fanciolino F. Fumoux A. Iliadis A. Nau E. Peytel J. Desplans P. Gazin S. Ranque C. Mary A. Iliadis* V. Sinou* D. Parzy* SSA EC Pharma IRD EC MED * Répartition équitemporelle C. Mercier N. Taudon* V. Sinou* Nombre de personnels permanents en 2011 : 45 Nombre de personnels permanents prévus en 2012 : 47 6

7 Historique et principaux secteurs d intervention de l organisme : Créée en 2008, l UMR-MD3 est une unité mixte de recherche soutenue par le Ministère de la recherche et le Ministère de la défense, spécialisée en maladies infectieuses. Son objectif principal est l établissement d un socle de connaissances nécessaires à la mise en œuvre de programmes de contrôle de pathologies mycologiques et parasitaires, prioritairement le paludisme et la leishmaniose. Pour ce faire, l UMR-MD3 associe des équipes issues de différentes disciplines scientifiques et médicales allant de l épidémiologie à la pharmacologie, et utilisant des approches conceptuelles et méthodologiques complémentaires telles que la pharmacognosie, l immunologie, l entomologie, l épidémiologie moléculaire et la modélisation mathématique. Elle possède un réseau de collaborations établi de longue date avec des équipes des pays du sud (RD Congo, Burkina Faso, Asie du Sud - Est, bassin méditerranéen) avec lesquelles elle a acquis une expertise solide des questions de terrain à la base de ses problématiques. Elle collabore depuis 5 ans avec le CH Monkole (Infection palustre et poumon, efficacité et pharmacocinétique d une nouvelle formulation artésunate amodiaquine 1 ). Activités/Champ d application : Du fait de sa double compétence, scientifique et médicale, l UMR-MD3 développe des activités de recherche et d expertise. Elle participe au Centre national de référence du paludisme pour la France métropolitaine, et à ce titre apporte une aide diagnostique aux praticiens par la caractérisation des profils phénotypiques et génotypiques des isolats et le dosage (plasma/sang/urine) des antipaludiques chez les patients. Elle gère également des projets de recherche amont sur la biologie des pathogènes et les interactions hôte-pathogène. Dans ce cadre, elle a développé des puces à ADN pour l étude du transcriptome des plasmodies et s est spécialisée dans l utilisation des outils de la biologie systémique (méthodes «omiques», immunoessais, spectrométrie de masse...) permettant l identification et la validation de biomarqueurs pour des applications diagnostiques et pronostiques 2. Elle conduit également des projets de recherche exploratoire en terrain d endémie et de ce fait possède une grande expertise dans la collecte et l'analyse d échantillons de terrain. En particulier, dans le cadre d une collaboration entre les Services de santé français et vietnamien débutée en 2005, elle réalise des missions de surveillance annuelles de l endémie palustre basées sur le recueil d informations sur le niveau de sensibilité des populations parasitaires et le comportement des 1 Sinou V, et al Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new ACT formulation: Artesunate/Amodiaquine (TRIMALACTÒ) following oral administration in African malaria patients. 3 & 4: Torrentino-Madamet M, et al Proteomic analysis revealed alterations of the Plasmodium falciparum metabolism following salicylhydroxamic acid exposure. Res.Rep.Trop.Med., 2: 109. Wurtz N, Desplans J, Parzy D. Phenotypic and transcriptomic analyses of Plasmodium falciparum protein kinase A catalytic subunit inhibition. Parasitol Res Sep 25. Torrentino-Madamet M, Desplans J, Travaillé C, James Y, Parzy D. Microaerophilic Respiratory Metabolism of Plasmodium falciparum Mitochondrion as a Drug Target. Curr Mol Med Sep 13. Wurtz N, Pastorino B, Almeras L, Briolant S, Villard C, Parzy D. Expression and biochemical characterization of the Plasmodium falciparum protein kinase A catalytic subunit. Parasitol Res Jun;104(6): Sinou V, Taudon N, Mosnier J, Aglioni C, Bressolle FM, Parzy D. Pharmacokinetics of artesunate in the domestic pig. J Antimicrob Chemother Sep; 62(3):

8 vecteurs responsables de la transmission palustre (collecte, tri morphologique, identification moléculaire des espèces d Anopheles). Réalisées dans des régions difficiles d accès et peu équipées en infrastructures hospitalières, ces missions ont nécessité le développement d un laboratoire de microbiologie projetable permettant d amener des outils diagnostiques et biologiques (culture plasmodiale, tests in vitro, méthode ELISA, PCR temps réel) nécessaires à notre mission surveillance 3 La conception de ce laboratoire projetable permet la mise en œuvre de différentes techniques biologiques auprès des patients, sans négliger la qualité et en obtenant une reproductibilité quelque soit les conditions environnementales. Cette étude in vitro ici proposée est complémentaire d autres projets pilotés par l INRB portant sur l efficacité in vivo des traitements antipaludiques sous l égide du PNLP. Ce projet propose donc un multipartenariat entre des acteurs publics et privés congolais (Etat congolais représenté par l INRB et le PNLP-Monkole) et entre des institutions Nord-Sud. 3 Sinou V, et al Polymorphism of Plasmodium falciparum Na+/H+ exchanger is indicative of a low in vitro quinine susceptibility in isolates from Viet Nam. Malar. J., 10: 164. Bertaux L, et al New PfATP6 mutations found in Plasmodium falciparum isolates from Vietnam. Antimicrob.Agents Chemother. 53:

9 PARTIE II - PRESENTATION DU PROJET I. Description du projet 1. Présentation du contexte et justification du projet 1.1. Situation du paludisme dans le pays En dépit d avancées majeures dans la lutte contre le paludisme dues à l amélioration des connaissances et à des investissements importants mis en place par des organismes institutionnels (Banque Mondiale) ou des Organisations Non Gouvernementales (ONG), le paludisme représente encore un problème majeur de santé publique. L incidence de la maladie sur le plan mondial se situe entre 300 et 500 millions de cas cliniques chaque année avec un nombre de décès estimé à pour l année 2010 (World malaria report 2011, WHO) 4. Environ 90% de ces cas surviennent en Afrique Sub-saharienne. Deux pays, le Nigéria et la République Démocratique du Congo (RDC), en supportent 50% des accès et des décès. En termes de croissance économique, le déficit annuel de croissance imputable au paludisme est estimé à plus de 1,3% dans les pays endémiques en Afrique. La RDC fait partie de ces Etats africains. Immense pays de 2,3 millions de km 2, soit l équivalent des 2/3 de l Union européenne, avec une population de près de 66 millions d habitants, la RDC est située au centre du continent africain et partage ses frontières avec neuf pays : au nord, la République Centrafricaine et le Soudan; à l'ouest, le Congo; au sud, la Zambie et l'angola et à l'est, l'ouganda, le Rwanda, le Burundi et la Tanzanie. Le paludisme serait responsable de 0,05% de mortalité et 11,5% de morbidité dans la population générale. Mais ces chiffres sont sujets à caution en raison, entre autre, du système de recueil de données et des moyens techniques de diagnostic qui ne sont pas toujours performants. La maladie sévit de manière endémique sur presque tout le territoire congolais. Ainsi, 97% de la population vit dans des zones à paludisme stable avec un faciès épidémiologique équatorial (transmission anophélienne intense et permanente) et tropical (transmission anophélienne à recrudescence saisonnière longue correspondant à une saison des pluies de 5 à 8 mois). Ce sont des zones d hyperendémie (50 à 75% des personnes infectées) et d holoendémie palustre (plus de 75% des personnes infectées). Il s agit des provinces du Bas-Congo, Bandundu, Equateur, Kinshasa, Maniema, Kasaï occidental, Kasaï oriental et une partie du Katanga. Les 3% de la population restant vivent dans les régions montagneuses de l Est du pays (les deux Kivu et l est du Katanga) où le paludisme est instable avec une probabilité de survenue d épidémies. Les enfants et les femmes enceintes sont les principales cibles du paludisme. L évaluation pré-intervention du Fonds mondial menée en 2007 dans 71 zones de santé du pays par l Ecole de Santé Publique de l Université de Kinshasa (Plan stratégique FRP PNLP ) a montré que le paludisme était responsable de : 39,3% de motif de consultations externes chez les enfants de moins de 5 ans et 39% pour tous les âges confondus ; 4 WHO. World malaria report. 9

10 39,1% des décès survenus chez les enfants de moins de 5 ans en hospitalisations et 27,2% pour tous les âges confondus ; 36,6% des hospitalisations chez les enfants de moins de 5 ans ; 6% de létalité hospitalière du paludisme chez les enfants de moins de 5 ans Stratégie de lutte contre le paludisme De façon globale, la stratégie de lutte contre le paludisme repose sur la protection des femmes enceintes par la chimioprophylaxie, l utilisation des moyens de lutte antivectorielle, le diagnostic précoce et le traitement rapide et efficace de l accès palustre. En effet, l utilisation d antipaludiques efficaces est un facteur essentiel dans le contrôle de la mortalité et de la morbidité associées au paludisme, les parasites ayant la capacité à développer des résistances aux traitements avec pour conséquence un effet délétère sur la santé humaine. En 2005, en réponse au développement de la résistance à la Chloroquine et à la Sulfadoxine- Pyriméthamine (SP), la RDC a décidé d utiliser la combinaison Artésunate + Amodiaquine (AQ+AS) comme médicament de première ligne dans le traitement du paludisme simple. La quinine demeure la molécule recommandée en cas d échecs thérapeutiques et la SP est réservée au traitement préventif et intermittent chez la femme enceinte Etat des études sur l efficacité des traitements en RDC Il existe peu d études sur l efficacité des traitements antipaludiques en RDC. Cependant, les données in vivo dont nous disposons montrent que les mêmes combinaisons thérapeutiques n'ont pas la même efficacité selon le site d'étude considéré. Ainsi, Swarthout et coll 5. (2006) reportent un taux d échec thérapeutique de 19,7% pour l association Artésunate + SP (AS+SP) dans la province du Sud- Kivu alors qu un taux d échec thérapeutique de 76% est observé dans le district de Rutshuru près de la frontière Rwandaise (Alker et al., 2008) 6. De même, en 2005, le PNLP estimait à 1,4%, 6,8% et 6,9% le taux d échec thérapeutique de P. falciparum vis-à-vis de l association AS + AQ à Mbandaka (province de l Equateur), Kimpese (province du Bas Congo) et à Kingasani (Kinshasa), respectivement (Figure 1). Une étude plus récente réalisée à Boende dans la province Equatoriale (nord-ouest de la RDC) et à Kabalo dans la province du Katanga (sud-est de la RDC) sur l efficacité des associations AS + SP et AS + AQ et de la monothérapie SP a montré des taux d'échec thérapeutique respectifs de 24,6%, 15,1% et 35,6% à Boende contre 0%, 0% et 19,6% à Kabalo (Bonnet et al., 2009) 7. Cette même étude a montré que le taux d échec thérapeutique à l AQ à Boende était de 18,3% (Bonnet et al., 2009). 5 Swarthout TB, Broek IV van den, Kayembe G, Pota H, Roper C. Artesunate + amodiaquine and artesunate + sulphadoxinepyrimethamine for treatment of uncomplicated malaria in Democratic Republic of Congo: a clinical trial with determination of sulphadoxine and pyrimethamine - resistant haplotypes. Tropical Medicine and International Health 2006, 11: Alker AP, Kazadi WM, Kutelemeni AK, Bloland PB, Tshefu AK, Meshnick SR. dhfr and dhps genotype and sulfadoxinepyrimethamine treatment failure in children with falciparum malaria in the Democratic Republic of Congo. Tropical Medicine and International Health 2008, 13: Bonnet M., van den Broek I, van Herp M, Palma Urrutia PP, van Overmeir C, Kyomuhendo J, Nsibu Ndosimao C, Ashley E, Guthmann JP. Varying efficacy of artesunate+amodiaquine and artesunate+sulphadoxine-pyrimethamine for the treatment 10

11 Figure 1 Echecs Thérapeutiques l Artésunate-amodiaquine (ASAQ) et l Artémether-Luméfantrine (Coartem), enfants de moins de 5 ans avec Paludisme à P. falc, Février à octobre 2005, RDC Kisangani 3,7%; 9,2% Bolenge: 1,4%; 1,6% Rutshuru 5,5%;2,7% Kimpese: 6,8%; 6,7% Kingasani: 6,9%; 0% %: échecs ASAQ (1,4 6,9%); %: échecs Coartem (0 9,2%) Ces résultats suggèrent que des populations parasitaires présentant différents niveaux de résistance aux antipaludiques circulent en RDC. Ils mettent également en évidence la difficulté à implémenter un traitement uniforme dans un grand pays caractérisé par des faciès épidémiologiques différents. Enfin, l efficacité des ACTs (Artemisinin-based combination therapies) incluant un partenaire pour lequel il existe déjà une résistance avérée telle que la SP ou l AQ doit être régulièrement évaluée. Le recueil d informations sur le niveau de sensibilité des Plasmodies aux antipaludiques constitue d ailleurs un objectif clef de la phase II du Programme renforcé pour la lutte contre le paludisme en Afrique (Banque mondiale) dont un des piliers est le renforcement de la capacité sous régionale de la surveillance, du diagnostic différentiel et l uniformisation de la définition des cas de paludisme avec la création de réseaux d équipes nationales de Suivi et d Evaluation, avec le support de réseaux multinationaux pour surveiller l efficacité des médicaments et des insecticides. Dans le cadre de ce programme la RDC avec le Nigéria est une des priorités de la Banque mondiale. En effet, il existe peu de données sur le niveau de résistance des populations parasitaires qui circulent en Afrique Centrale aux antipaludiques Faisabilité et origine du projet La faisabilité du projet est supportée par une étude préliminaire d évaluation de la chimiosensibilité réalisée en 2012 dans la ville/province de Kinshasa dont une première phase s'est déroulée en juin juillet (6 semaines) et une seconde en octobre et novembre (4 semaines). Les structures impliquées of uncomplicated falciparum malaria in the Democratic Republic of Congo: a report of two in-vivo studies. Malaria Journal 2009, 8:

12 dans cette étude étaient : l UMR-MD3 (Marseille), l INRB (PNLP) et le CH Monkole (RD Congo). Cette mission a été conduite pour l UMR-MD3 par le Pr D. Parzy et le Dr V. Sinou qui ont assuré sur le terrain une présence de 35 jours chacun sur les deux phases. L'équipe UMR-MD3 était accompagné d'un laboratoire de microbiologie projetable (appelé K-LMP) constitué de 4 malles compartimentées intégrant l'ensemble des éléments nécessaires pour établir un diagnostic (microscope), traiter les prélèvements (centrifugeuse) et réaliser des tests in vitro de chimiosensibilité (poste de sécurité microbiologique, enceinte d'incubation tri-gaz et chaine ELISA). Le K-LMP a été déployé sur trois sites : l INRB et le CH Monkole (commune de Kinshasa) et le dispensaire de Moluka (commune de Selembao qui fait référence à la zone de santé de Monkole). Au final, le nombre d échantillons traités a été de 398 pour un nombre de tests in vitro réalisés de 155. La révélation de l ensemble des tests in vitro par ELISA ainsi que l étude moléculaire des gènes de résistance ont été réalisées au sein de l UMR-MD3, et nous avons retenu 102 isolats pour l'interprétation des tests d'évaluation de la résistance. L'analyse des résultats montre que dans la zone étudiée : 77% des isolats sont résistants à la chloroquine ; 48,4% des isolats présentent une sensibilité diminuée à la méfloquine ; 17,3% des isolats présentent une sensibilité diminuée à la doxycycline ; 22,1% des isolats présentent une sensibilité diminuée à la quinine ; 42,6% des isolats présentent une sensibilité diminuée au monodéséthylamodiaquine; Aucun isolat ne présente de sensibilité diminuée à la dihydroartémisinine, à la luméfantrine et à la pipéraquine. En outre, cette étude a permis d évaluer les contraintes du présent projet (recueil correct des données du patient sur la fiche d interrogatoire, acheminement des prélèvements à partir des différentes structures de santé impliquées, gestion des prélèvements à leur arrivée au laboratoire, gestion des gaz permettant d assurer des conditions de culture) et d estimer le temps nécessaire au dédouanement du K-LMP (1 semaine). La formation de médecins et techniciens de l INRB et du CH Monkole à la culture in vitro du parasite a pu être initiée. 2. Objectif général Mise à jour de la stratégie de lutte contre le paludisme sur 4 sites en RDC à travers le renforcement de la surveillance de l endémie palustre et de l efficacité des médicaments. 3. Objectifs spécifiques OS1. Renforcer la capacité technique des structures centrales (CH Monkole/INRB) et des centres de santé Acquisition du K-LMP ; Formation de l'equipe Labo Mobile (et de l'équipe réserve), Information des responsables des centres de santé et de leur personnel, Formation technique (frottis sanguin et test de diagnostic rapide, culture in-vitro). 12

13 OS2. Réaliser les études du niveau de sensibilité des parasites aux antipaludiques Effectuer les tests in-vitro de chimiosensibilité sur les isolats cliniques collectés auprès des patients impaludés au niveau des différents sites ; Effectuer les études de certains marqueurs génotypiques de résistance aux antipaludiques. OS3. Etablir la cartographie de la résistance de P. falciparum aux antipaludiques des sites choisis Synthèse des résultats produits lors de l OS2, qualification des résultats. Rapport sur l'activité des antipaludiques et recommandations dans les provinces du Bas- Congo et de Kinshasa. II. Bénéficiaires 1. Bénéficiaires directs Le PNLP par l'information de son personnel aux tests in-vitro la contribution de la surveillance de l'endémie palustre et du contrôle de l'efficacité des médicaments ; L INRB par la formation de son personnel aux tests in-vitro (5 personnes) ; Les 4 Centres de santé qui vont voir leurs performances accrues (diagnostics corrects et meilleure prise en charge du paludisme) et avoir un renforcement des connaissances. Cela concerne les médecins, infirmiers et techniciens de labo impliqués directement dans le projet (50 personnes) ; CH Monkole : formation du personnel aux tests in vitro, acquisition d un outil de surveillance de la résistance des plasmodies aux antipaludiques (K-LMP) (5 personnes) ; Le Ministère de la Santé va pouvoir bénéficier de données de terrain fiables et qualifiées sur l état de la résistance des plasmodies aux antipaludiques et ainsi ajuster sa politique de santé. 2. Bénéficiaires indirects Les autorités sanitaires qui disposeront des outils de décision actualisés dans la lutte contre le paludisme. Les malades, grâce à une amélioration du diagnostic, une prise en charge plus rapide et mieux adaptée, et la population en général grâce à une amélioration de la santé publique. L UMR-MD3 à qui le projet permettra une valorisation des études amont menées au sein de l unité et en zones d endémie. III. Méthodologie et résultats attendus 1. Hypothèses de travail Il existe des isolats parasitaires avec des sensibilités aux antipaludiques différentes selon le faciès épidémiologique de la région considérée ; Les tests in vitro sont complémentaires aux tests in vivo pour obtenir une information dans les délais qui permettent un meilleur suivi de la chimiosensibilité ; 13

14 Les chiffres concernant le nombre d accès palustres qui surviennent en RDC ne reflètent pas une réalité de terrain. 2. Programme de recherche et méthodologies utilisées A. Sites d étude Les 4 sites d étude choisis sont des sites sentinelles du PNLP et de l'inrb, issus de deux provinces : Province de Kinshasa : Kimbondo et Eliba. Province du Bas Congo : Kisantu (environ 150 km de Kinshasa) et Kimpese (environ 250 km de Kinshasa). Les sites ont été choisis en fonction de leur facilité d'accès par voie routière depuis Kinshasa, qui sera la «plaque tournante» du système logistique mis en place. Par ailleurs, ces sites ont déjà des collaborations avec le CEFA/Monkole ou l'inrb dans le cadre d'autres projets ce qui facilitera l'appropriation du projet. Ces sites reçoivent essentiellement des populations de niveau social bas en majorité des enfants et des femmes enceintes qui constituent le public cible dans la lutte contre le paludisme. Enfin, la province du Bas Congo constitue un terrain essentiellement rural qui offre un biotype différent de Kinshasa, milieu urbain. B. Laboratoire de microbiologie projetable (K-LMP) La reproductibilité des tests sera assurée par le déploiement d un laboratoire mobile autonome (K- LMP), facilement transportable d un site à un autre par voie terrestre et aérienne. Le matériel conçu, réuni dans ces malles et la mise en place de procédures standardisées permettent des techniques reproductibles quelque soit le lieu, assurant ainsi une production de données qui pourront être comparées entre les différents sites. Ces résultats compléteront utilement les données des tests in vivo réalisés par le PNLP. Composé de quatre caisses (environ 350 kg, 2 m 3 ) (Figure 2), il comportera l ensemble du matériel et des réactifs nécessaires à la culture in vitro du parasite et à la révélation de la croissance parasitaire : microscope, centrifugeuse, poste de sécurité microbiologique (PSM), enceinte d incubation trigaz équipée de bouteilles de N2 et de CO2, une chaîne ELISA [laveur (Hydroflex Plateform Tecan, Autriche) et lecteur de plaque ELISA (Sunrise absorbance reader Tecan, Autriche)]. L autonomie énergétique est assurée par un groupe électrogène d une autonomie > 12 heures. Enfin, une glacière-compresseur d une capacité suffisante pour assurer une chaîne du froid des plaques de chimiosensibilité et des réactifs de culture/elisa à -20 C pendant le transport et sur site complétera le dispositif. Le laboratoire de microbiologie projetable (K-LMP) sera déployé sur les différents sites choisis au niveau de l institution qui fait référence pour le PNLP et l'inrb et transporté d un site à l autre par voie routière (pick-up). 14

15 C. Patients et isolats cliniques Les isolats cliniques seront obtenus à partir de prélèvements sanguins (2x4 ml, Vacutainer) réalisés chez tout patient avec des symptômes évocateur d'accès palustre (fièvre) et se présentant dans un centre de santé au sein du site sentinelle. Le premier tube sert au diagnostic dans les centres de santé et aux éventuels examens complémentaires. Le deuxième tube est prélevé pour éviter sa contamination avant la mise en culture. Un prélèvement sanguin permettra dans un premier temps de faire le diagnostic de paludisme qui sera réalisé à partir d un test de diagnostic rapide (TDR) et/ou d'une goutte épaisse. Les objectifs de l étude seront expliqués à chaque patient afin qu il puisse donner son consentement en toute connaissance de cause et une fiche d interrogatoire sera renseignée (données sociodémographiques, cliniques, biologiques, prise de médicaments...). Les patients positifs seront traités par les ACTs selon les recommandations du PNLP. La quinine sera utilisée en traitement de deuxième intention. Dans un second temps, à partir du 2ème tube, prélevé lors du même acte, sera réalisé le test in vitro de chimiosensibilité et l étude génomique. Pour garantir la viabilité des parasites, les prélèvements cliniques seront transportés jusqu au laboratoire mobile (le K-LMP) à +4 C et dans un délai inférieur à 24 heures. A leur arrivée, un frottis couche mince sera réalisé pour confirmer la présence de parasite, l espèce plasmodiale, et déterminer la parasitémie (en pourcentage d'hématie parasitée sur frottis mince). Un test de biologie moléculaire complétera le diagnostic à la recherche de la présence de différentes espèces plasmodiales. Les prélèvements de sang réalisés pour les tests in vitro de chimiosensibilité seront intégrés dans la chaîne diagnostic par la réalisation d'examens complémentaires (exemple: Numération formule sanguine) qui permettront notamment en cas de diagnostic de paludisme négatif d'orienter l'acte thérapeutique. Ils offrent ainsi des bénéfices pour le patient tant pour le diagnostic direct que pour l adaptation thérapeutique en cas de résistance. D. Tests in vitro de chimiosensibilité Le test in-vitro sera réalisé uniquement pour l espèce P. falciparum et pour des parasitémies 0,01%. La mise en culture en plaque 96 puits sera réalisée comme décrit précédemment (Sinou et al., 2011). Après une incubation de 72 heures à 37 C en atmosphère trigaz contenant 10% O2, 5% CO2 et 85% N2, les plaques seront congelées à -20 C. La croissance des parasites sera quantifiée à l aide d un test ELISA basé sur la détection de la protéine parasitaire HRP2 développé et validé par l UMR- MD3. Nous estimons à 1200 le nombre de tests in vitro qui seront réalisés à l issue des 24 mois du projet. Les molécules antipaludiques testées seront parmi les suivantes : La chloroquine, considérée comme antipaludique de référence ; La quinine, du fait de son utilisation en RD Congo dans le traitement des accès sévères ; La dihydroartémisinine (DHA), la méfloquine, l amodiaquine, la luméfantrine et la pipéraquine, du fait de leur utilisation en tant que molécule majeure (DHA) ou associée dans 15

16 les combinaisons thérapeutiques (ACT) actuellement recommandées par l OMS. L association sulfadoxine - pyriméthamine sera également étudiée en raison de son utilisation chez les femmes enceintes ainsi que la doxycycline dont l utilisation est recommandée en chimioprophylaxie dans de nombreux pays. E. Etude génomique du parasite L étude génotypique sera réalisée pour tout prélèvement sanguin à partir d un aliquot congelé à 20 C. Elle concerna les gènes suivants : pfcytb : pour la résistance à l atovaquone ; pfmdr1 : potentiellement impliqué dans la résistance à la méfloquine, l halofantrine, la quinine et la luméfantrine ; pftcr : pour la résistance à la chloroquine ; pfdhps - pfdhfr : pour la résistance à la sulfadoxine-pyrimethamine ; nhe-1 : pour la résistance à la quinine. L analyse moléculaire sera réalisée par l UMR-MD3 selon les méthodes classiques (Sinou et al., 2011) et couramment utilisées dans le cadre de ses activités pour le CNR Paludisme. Cette étude n'est pas prise en charge financièrement par le présent projet. 3. Considérations éthiques et réglementaires Ce projet est en conformité avec «la Déclaration d Helsinki» adoptée par l Assemble Médicale Mondiale (juin 1964, dernière mise jour 2004) et a reçu l accord du Comité d Ethique local du CEFA/CH Monkole : approbation donnée depuis 2008 et renouvelée pour ce projet en cours. Il en est de même au niveau des structures des autres partenaires impliqués. Les sujets pressentis seront informés, dans la langue qu ils maîtrisent le mieux, du protocole d'étude qui consiste en un interrogatoire et un prélèvement sanguin. Leur consentement éclairé leur sera demandé. Ils seront ensuite invités à signer un document de «Consentement éclairé» pour accord. La signature de ce document est considérée comme une obligation pour leur participation à cette étude. Les sujets pourront interrompre leur participation selon leur volonté et ces conditions seront édictées dans le document de consentement. Les prélèvements de sang réalisés pour les tests in vitro de chimiosensibilité offrent des bénéfices pour le patient tant pour le diagnostic direct que pour l adaptation thérapeutique en cas de résistance. En effet, en cas de paludisme négatif, la réalisation d'examens complémentaires (ex. formulation sanguine) permettra d'orienter le diagnostic et de proposer un traitement adapté. En cas d'échec thérapeutique constaté après 72 heures de traitement de première intention, l'analyse des plaques de chimiosensibilité obtenues dans le même délai permettra de proposer un traitement de deuxième ligne adéquat. 16

17 La quantité de sang prélevée est de moins de 10 ml en une seule fois et ne comporte aucun risque supplémentaire par rapport aux prélèvements réalisés en routine. Le traitement anti-paludique sera donné gratuitement aux patients qui prennent part à l'étude. 4. Activités L'organisation du projet sur 2 ans est synthétisée dans l'organigramme 1 ci-dessous. 17

18 Le K-LMP sera mis en place successivement dans les 2 sites choisis pour les provinces de Kinshasa (Kimbondo & Eliba) et du Bas Congo (Kimpese & Kisantu) (4 sites au total). Au niveau de chaque site, le recueil d'échantillons s'effectuera à partir du centre d'accueil où sera stationné le K-LMP et de 5 centres partenaires. Les 2 sites par Province seront visités chaque année (évaluation de l'évolution de la résistance d'une année sur l'autre). Une période effective de 6 semaines de travaux est prévue sur chaque site, avec des intervalles de 5-6 semaines pour le reconditionnement, le transfert et la mise en place du laboratoire sur le site suivant. Le transfert du K-LMP entre chaque site sera assuré par voie routière. Pour satisfaire aux contraintes du projet, 3 personnes (1 médecin et 2 techniciens) seront recrutées à temps plein pendant les 2 années (équipe appelée Equipe Labo Mobile / 1 équipe de réserve sera constituée). Lors de ses missions sur le terrain, elle sera accompagnée par un acteur de l'umr-md3 dont la durée de présence sur site sera variable (14-21 jours) en fonction de la province et de l'avancement dans le temps du projet. Objectif spécifique 1. Renforcer la capacité technique des structures centrales (CH Monkole/INRB) et des centres de santé A0- Acquisition du K-LMP L'acquisition du K-LMP (cf 2B; Fig. 2) sera réalisée auprès de la société K-PLAN qui est un des concepteurs et développeurs du laboratoire aux côtés de l UMR-MD3. Outre la conception modulaire du laboratoire en malle, la société K-Plan a conçu «à façon» un PSM transportable, miniaturisé avec un auto-diagnostic et l incubateur trigaz, qui permet de reproduire des conditions de culture identiques quelque soit le lieu et les conditions environnementales. La société K-Plan fournira une trousse contenant des pièces de remplacement et mettra également en place une hotline permettant de joindre les techniciens/ingénieurs en cas de panne. En dernier recours, le déplacement d un technicien K-Plan sur place sera envisagé. L'équipement du K-LMP sera complété par l'achat de petit matériel de laboratoire comprenant des pipettes permettant la prise de différents volumes, compteurs de cellules, contrôleurs de température, portoirs pour tubes... Des bouteilles d'azote et de CO2 nécessaire à la culture in vitro de P. falciparum seront achetées auprès d'un fournisseur local (Chanimétal, Kinshasa, RD Congo). A1 - Phase de lancement Une phase de lancement (14 jours) est prévue en début de projet sur Kinshasa et au Bas Congo. Les objectifs sont: Réunion de l'équipe de pilotage (CEFA/Monkole - L. Tshilolo, INRB - S. Karhemere, PNLP - J. Losimba, UMR-MD3 - D. Parzy) et recrutement du personnel (Equipe Labo Mobile : 1 Médecin biologiste, 2 techniciens, Equipe Labo Mobile de réserve et personnel d'appoint) ; Réunions d'échanges et de formation des différentes parties impliquées dans le projet (autorités de santé de la RD Congo, PNLP, CH Monkole, CEFA, INRB, acteurs UMR-MD3, acteurs sur le terrain...) ; Mise en place de la logistique ; 18

19 Visite des sites d'étude ; Formation initiale des différents acteurs. En ce qui concerne la province du Bas Congo (5 jours), la phase de lancement sera organisée par le Médecin Biologiste et un technicien de l'equipe Labo Mobile qui seront rejoints dans un deuxième temps par les deux acteurs de l'umr-md3. Objectif spécifique 2 : Réaliser les études du niveau de sensibilité des parasites aux antipaludiques A2- A4- A6-A8. - Organiser et récolter les échantillons dans la province de Kinshasa 1. Phase de préparation Les milieux de culture, les plaques de chimiosensibilité ainsi que les réactifs et les consommables ELISA seront préparés par 1 technicien de l UMR-MD3, Marseille, et envoyées sur le CH Monkole, Kinshasa, avant la mission sur site. Avant envoi vers la RDC et au retour de chaque mission, un contrôle qualité sera réalisé par l'umr- MD3. Ceci permettra, en particulier, de vérifier une non-dégradation des molécules antipaludiques déposées sur les plaques de chimiosensibilité et de valider les résultats de CI 50 obtenues. Sur Kinshasa, cette phase sera gérée par l'equipe Labo Mobile et consistera à : Informer les différents acteurs (Médecin Chef de zone/responsables des structures de santé...) du lancement de la mission (date, logisitique...) ; Préparer les documents (fiche de prélèvements & interrogatoires/consentement éclairé) ; Charger le K-LMP (consommables, carburant, gaz...) ; Réceptionner les consommables et réactifs en provenance de Marseille et les intégrer au K- LMP. 2. Equipe L'équipe terrain sera composée de l'equipe Labo Mobile et de 2 acteurs de l'umr-md3. Lors de la première mission (tâche A2 - année 1, Kimbondo) chaque acteur de l'umr-md3 assura une présence successive sur site de 21 jours (soit 42 jours en continu). Lors des missions suivantes (tâche A4 - année 1, Eliba; Tâche A6- année 2, Kimbondo & tâche A8- année 2, Eliba), 1 acteur de l'umr-md3 sera présent sur site pendant 15 jours. Cette équipe sera complétée d'un chauffeur qui aura pour mission le rapatriement des échantillons depuis les 5 centres partenaires vers le centre accueil où sera déployé le K-LMP. 3. Etude de chimiosensibilité sur site Les tests in vitro de chimiosensibilité seront réalisés comme décrit au 2D. Les prélèvements seront réalisés sur tout patient se présentant dans un centre impliqué dans l'étude avec une fièvre. La procédure de traitement des échantillons sera la suivante : i) Diagnostic (TDR et goutte épaisse) : si négatif: examens complémentaires pour aide au diagnostic (NFS, Examen d'urine...) si positif: Accès simple = traitement antipaludique ; Accès sévère = hospitalisation 19

20 ii) Conservation et transport du prélèvement sanguin à +4 C jusqu'au Centre d'accueil ; iii) Annotation du prélèvement selon un code prédéfini et vérification des renseignements corrects des différentes fiches associées au patient ; iv) Identification espèce parasitaire et détermination de la parasitémie sur frottis sanguin ; v) Récupération d'échantillons érythrocytaires et plasmatiques. Congélation et conservation à - 20 C ; vi) Incubation in vitro de l'isolat en présence des molécules antipaludiques (72 heures, 37 C, 10%O2, 5% CO2, 85% N2). Congélation (-20 C) des plaques de chimiosensibilité ; vii) Révélation de la croissance parasitaire par la méthode ELISA ; viii) Report des résultats sur la fiche de résultat associée à chaque isolat. En complément, un diagnostic moléculaire sera réalisé sur tous les échantillons sanguins qui permettront de détecter les co-infections (P. falciparum/p. ovale ou P. falciparum/p. malariae) et de confirmer le diagnostic. Les résultats seront transmis systématiquement aux responsables des centres concernés. 4. Retour de mission A l issue de la session d étude, le K-LMP, les échantillons conservés à -20 C et les plaques de chimiosensibilité seront rapatriés sur le CH Monkole. En raison du temps nécessaire pour la réalisation de l'elisa (environ 4 heures pour 8 plaques soit 2 isolats) et du nombre d'échantillons que nous comptons mettre en culture in vitro (environ 150), l'étape (vii) décrite ci-dessus ne pourra être complètement réalisée lors des 42 jours de mission terrain. Le traitement des plaques de chimiosensibilité par ELISA sera réalisé au CH Monkole. L'Equipe Labo Mobile assurera la vérification des données patients afin de permettre un traitement des données épidémiologiques par l'informaticien/statisticien. Elle enverra également les échantillons érythrocytaires et plasmatiques et les plaques de chimiosensibilité sur Marseille pour des études complémentaires (études génotypiques, dosages de molécules antipaludiques dans le plasma) (financements annexes). Le transport sera assuré par une société spécialisée dans le transport sécurisé des échantillons biologiques tel que la société Areatime. Nous avons déjà fait appel à cette société lors des missions préparatoires réalisées en 2012 (cf. 1.4.). Une réunion sera organisée entre tous les acteurs et un bilan sera réalisé pour étudier les dysfonctionnements éventuels et y remédier. A l'issue, un rapport sera transmis aux coordinateurs du projet. Une synthèse des résultats (importance de l endémie palustre, test in vitro) sera également transmise au responsable du PNLP. A3- A5- A7- A9- Organiser et récolter les échantillons dans la province du Bas Congo 1. Phase de préparation Les milieux de culture, les plaques de chimiosensibilité ainsi que les réactifs et les consommables ELISA seront préparés par 1 technicien de l UMR-MD3, Marseille, et envoyées sur le CH Monkole, Kinshasa, avant la mission sur site. 20

21 Avant envoi vers la RDC et au retour de chaque mission, un contrôle qualité sera réalisé par l'umr- MD3. Ceci permettra, en particulier de vérifier une non-dégradation des molécules antipaludiques déposées sur les plaques de chimiosensibilité et de valider les résultats de CI 50 obtenues. En RDC, cette phase sera gérée par l'equipe Labo Mobile sur Kinshasa et au Bas Congo. Sur Kinshasa : i) Préparation des documents (fiche de prélèvements & interrogatoires/consentement éclairé), ii) Chargement du K-LMP (consommables, carburant, gaz...), iii) Réception des consommables et réactifs en provenance de Marseille et intégration au K-LMP. Au Bas Congo : i) Informations aux différents acteurs (Médecin Chef de zone/responsables des structures de santé...) du lancement de la mission (date, logisitique...), Pour ce faire, nous avons programmé une pré-visite (4 jours) des sites (1 centre accueil + 5 centres partenaires) assurée par le médecin et 1 technicien (Equipe Labo Mobile) et un chauffeur. 2. Equipe L'équipe terrain sera composée de l'equipe Labo Mobile et de 2 acteurs de l'umr-md3. Lors de la première mission (tâche A3 - année 1, Kimpese), chaque acteur de l'umr-md3 assura une présence successive sur site de 21 jours (soit 42 jours en continu). Lors des missions suivantes (tâche A5 - année 1, Kisantu; Tâche A7- année 2, Kimpese & tâche A9- année 2, Kisantu), 1 acteur de l'umr-md3 sera présent sur site pendant 21 jours. Le transport du K-LMP et de l'équipe sur site sera réalisé par véhicule (2 véhicules/2chauffeurs). Le rapatriement des échantillons depuis les 5 centres partenaires vers le centre accueil sera assuré par 1 des membres de l'equipe Labo Mobile. 3. Etude de chimiosensibilité sur site Les tests in vitro de chimiosensibilité seront réalisés comme décrit au 2D. Les prélèvements seront réalisés sur tout patient se présentant dans un centre impliqué dans l'étude avec une fièvre. La procédure de traitement des échantillons sera la suivante : i) Diagnostic (TDR et goutte épaisse) : si négatif: examens complémentaires pour aide au diagnostic si positif: Accès simple = traitement antipaludique ; Accès sévère = hospitalisation ii) Conservation et transport du prélèvement sanguin à +4 C jusqu'au centre d'accueil ; iii) Annotation du prélèvement selon un code prédéfini et vérification du renseignement correct des différentes fiches associées au patient ; iv) Identification espèce parasitaire et détermination de la parasitémie par frottis sanguin ; v) Récupération d'échantillons érythrocytaires et plasmatiques. Congélation et conservation à - 20 C ; vi) Incubation in vitro de l'isolat en présence des molécules antipaludiques (72 heures, 37 C, 10% O2, 5% CO2, 85% N2). Congélation (-20 C) des plaques de chimiosensibilité ; vii) Révélation de la croissance parasitaire par la méthode ELISA ; viii) Report des résultats sur la fiche de résultat associée à chaque isolat. 21