NOTICE of CHANGE dated 22/02/16

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1 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: sito WEB: NOTICE of CHANGE dated 22/02/16 IMPORTANT COMMUNICATION FOR THE USERS OF PRODUCT: «HVS1 Q - PCR Alert AmpliMIX» code Due to new product packaging, the Instruction for Use Manual (IFU) of SCH mrts031m reported following changes: The product kit (code ) now includes the product «HSV1 Q - PCR Alert AmpliPROBE» (previously identified by code RTS031-P). The external aluminum envelope was removed from product packaging. For this reason the packaging of the product (code RTS031- M) is made by a rigid plastic box containing all reagents tubes. All changes are reported in detail in the enclosed Instructions for Use (IFU). The product changes do not affect in any way the formulation of its reagents, their protocol of use and performance analytics. For this reason, the present IFU may also be used in association with the previous version of the product. PLEASE NOTE LA REVISIONE DI QUESTO IFU E COMPATIBILE ANCHE CON LA VERSIONE PRECEDENTE DEL KIT THE REVIEW OF THIS IFU IS ALSO COMPATIBLE WITH THE PREVIOUS VERSION OF THE KIT CET IFU MIS A JOUR ANNULE ET REMPLACE ET EST PARFAITEMENT COMPATIBLE AVEC LA VERSION PRECEDENTE DU KIT LA REVISIÓN DE ESTE IFU ES COMPATIBLE TAMBIÉN CON LA VERSIÓN ANTERIOR DEL KIT A REVISÃO DO ESTE IFU ÉTAMBÉM COMPATÍVEL COM A VERSÃO ANTERIOR DO KIT DIE REVIEW VON DIESER IFU IST KOMPATIBLE MIT DER VORIGE VERSION VON DEM TEST-KIT Notice of Change nr. SCH mrts031m_en, 22/02/16 Page 1/1

2 TABLE DES MATIÈRES APPLICATION Page 1 PRINCIPE DU TEST Page 2 DESCRIPTION DU KIT Page 2 MATÉRIEL FOURNI Page 2 MATÉRIEL REQUIS MAIS NON FOURNI Page 3 AUTRES PRODUITS REQUIS Page 3 AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS Page 3 ÉCHANTILLONS ET CONTRÔLES Page 5 PROCÉDURE Page 6 LIMITES DE LA PROCÉDURE Page 13 CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES Page 14 BIBLIOGRAPHIE Page 16 PROBLÈMES ET SOLUTIONS Page 17 LÉGENDE DES SYMBOLES Page 18 APPLICATION ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Bureaux: Tel Fax emd.support@elitechgroup.com Site internet: C Le produit fait partie d'un test quantitatif d'amplification des acides nucléiques pour la détection et le dosage de l'adn du virus humain Herpès Simplex de type 1 (HSV1) à partir d échantillons d'adn extrait de tampons de lésions muco-cutanées et de plasma prélevé sur EDTA. Le produit est destiné à être utilisé, conjointement aux données cliniques et à d'autres examens de laboratoire, pour le diagnostic et le monitorage de l'infection à HSV1. PRINCIPE DU TEST Le test prévoit l'exécution d'une réaction d'amplification real time sur microplaque avec thermostat programmable doté d'un système optique de détection de la fluorescence (thermocycleur pour real time). Dans chaque puits est réalisée une réaction d'amplification spécifique pour une région du gène codant la glycoprotéine D (gpd) d'hsv1 et pour une région du gène humain codant la ß-globine (contrôle interne de conformité de l'échantillon) à partir de l'adn extrait des échantillons étudiés. Une sonde spécifique pour HSV1 marquée avec le fluorophore FAM est activée lorsqu'elle s'hybride avec le produit spécifique de la réaction d'amplification pour HSV1. Une autre sonde spécifique pour le contrôle interne, marquée avec le fluorophore VIC, est activée lorsqu'elle s'hybride avec le produit de la réaction d'amplification du contrôle interne. L'émission de la fluorescence augmente au fur et à mesure qu'augmentent les produits spécifiques de la réaction d'amplification et elle est mesurée et enregistrée par l'instrument. Le traitement des données permet de déterminer la présence et le titre de l'adn de HSV1 dans l'échantillon initial. La standardisation du système a été réalisée sur instruments Applied Biosystems de la série DESCRIPTION DU KIT Le kit fournit deux des trois réactifs nécessaires pour la reconstitution du mélange de réaction complète et pour l'exécution de l'essai: HSV1 AmpliMIX Mélange d'oligonucléotides d'amorçage AmpliMIX pour l'amplification en real time dans une solution stabilisante, pré-dosée dans quatre tubes jetables. Chaque tube contient 110 µl de solution, suffisants pour 24 tests. HSV1 AmpliPROBE Mélange de sondes fluorescentes AmpliPROBE pour l'amplification real time dans une solution stabilisante, pré-dosée dans quatre tubes jetables. Chaque tube contient 110 µl de solution, suffisants pour 24 tests. Les oligonucléotides d amorçage et la sonde pour HSV1 (marquée avec le fluorophore FAM et bloquée par le groupe MGB-NFQ) sont spécifiques à une région du gène codant la gpd d'hsv1 (région US6). Les oligonucléotides d'amorçage pour le contrôle interne de cohérence de l'échantillon (marquée avec le fluorophore VIC et bloquée par le groupe MGB-NFQ) sont spécifiques de la région promoteur et 5'UTR du gène humain de la ß-globine. Le kit permet d'effectuer 96 détections, standards et contrôles inclus. MATÉRIEL FOURNI Composant Description Quantité Composition Étiquetage HSV1 AmpliMIX mélange d'oligonucléotides d'amorçage 4 x 110 µl Oligonucléotides, TRIS base, TRIS chlorhydrate, Glycérol, Triton X HSV1 AmpliPROBE mélange de sondes fluorescentes marquées avec FAM / MGB-NFQ et avec VIC / MGB-NFQ 4 x 110 µl Oligonucléotides fluorescents, TRIS base, TRIS chlorhydrate, Glycérol, Triton X SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 1/19 SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 2/19

3 MATÉRIEL REQUIS MAIS NON FOURNI - Hotte à flux laminaire. - Gants sans poudre, jetables en nitrile ou équivalent. - Malaxeur vortex. - Microcentrifugeuse de paillasse ( Tr/min). - Micro pipettes et embouts stériles avec filtre pour aérosol ou à distribution positive (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Eau ultra pure pour la biologie. - Thermostat programmable avec système optique de détection de la fluorescence (thermocycleur pour real time). AUTRES PRODUITS REQUIS Les réactifs pour l'extraction de l'adn des échantillons à analyser, le contrôle positif d'extraction, les réactifs optimisés pour l'amplification, le contrôle positif d'amplification ou les ADN standard à quantité connue ne sont pas fournis dans ce kit. Pour procéder à ces phases d'analyse, il est nécessaire d'utiliser les kits accessoires suivants, produits par ELITechGroup S.p.A.: «CPE - Internal Control» (code CTRCPE), contrôle positif d'extraction d'adn plasmidique pour extractions de l'adn d'échantillons non cellulaires; «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (code RTS000), mélange de réactifs optimisés pour l'amplification real time; Lorsqu'un résultat qualitatif de l'analyse est requis (détection de l'adn d HSV1): «HSV1 / HSV2 - Positive Control» (code CTR03), contrôle positif d'adn plasmidique. Lorsqu'un résultat quantitatif de l'analyse est requis (détection de l'adn d HSV1): «HSV1 Q - PCR Standard» (code STD031), ADN plasmidique à quantité connue pour obtenir la courbe standard. Pour l'extraction manuelle d'adn des échantillons à analyser, il est requis d'utiliser le produits suivant: «EXTRAgen» (code EXTG01), kit d'extraction des acides nucléiques à partir d'échantillons non cellulaires. Pour l'extraction automatique d'adn des échantillons à analyser, il est requis d'utiliser les produits suivants: NucliSENS easymag Reagents, kits d'extraction des acides nucléiques d'échantillons biologiques (biomérieux SA, réf , , , , , ), avec l'automate d'extraction NucliSENS easymag (biomérieux SA, réf ). Avec un instrument 7300 Real-Time PCR System, il est requis d'utiliser le produit générique «Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., code RTSACC01), contenant des microplaques de 0,2 ml et des films adhésifs, pour l'amplification en temps réel. Avec un instrument 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, il est requis d'utiliser le produit générique «Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., code RTSACC02) contenant des microplaques de 0,1 ml et des film adhésifs, pour l'amplification en temps réel. AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS Ce kit est réservé uniquement à l'usage in vitro. Avertissements et précautions Manipuler et éliminer tous les échantillons biologiques comme s'ils pouvaient transmettre des agents infectieux. Éviter le contact direct avec les échantillons biologiques. Éviter les éclaboussures ou les aérosols. Le matériel qui entre en contact avec les échantillons biologiques doit être décontaminé à l'hypochlorite de sodium 3% pendant un temps minimum de 30 minutes ou autoclavé à 121 C pendant une heure avant d'être éliminé. Manipuler et éliminer tous les réactifs et tous les matériels utilisés pour le test comme s'ils étaient potentiellement infectieux. Éviter le contact direct avec les réactifs. Éviter les éclaboussures ou les aérosols. Les déchets doivent être traités et éliminés conformément aux normes de sécurité. Le matériel jetable combustible doit être incinéré. Les déchets liquides contenant des acides ou des bases doivent être neutralisés avant leur élimination. Porter des vêtements de protection et des gants et protéger les yeux et le visage. Ne jamais pipeter les solutions à la bouche. Ne pas manger, boire, fumer ni se maquiller dans l'environnement de travail. Se laver parfaitement les mains après avoir manipulé les échantillons et les réactifs. Éliminer les réactifs en surplus et les déchets en respectant les réglementations en vigueur. Lire toutes les instructions fournies dans le kit avant de procéder au test. Respecter scrupuleusement les consignes fournies dans le kit pendant l'exécution du test. Respecter la date de péremption du kit. N'utiliser que les réactifs présents dans le kit et ceux conseillés par le producteur. Ne pas mélanger des réactifs provenant de lots différents. Ne pas utiliser de réactifs provenant de kits d'autres fabricants. Avertissements et précautions à adopter en biologie moléculaire Les procédures de biologie moléculaire, comme l'extraction, la transcription inverse, l'amplification et la détection d'acides nucléiques doivent être exécutées par un personnel ayant reçu une formation appropriée afin d'éviter tout risque de résultats erronés dus en particulier à la dénaturalisation des acides nucléiques ou à la contamination des échantillons par des produits d'amplification. Il est nécessaire de disposer de locaux distincts pour l'extraction / préparation des réactions d'amplification et pour l'amplification / détection des produits d'amplification. Ne jamais introduire un produit d'amplification dans la zone d'extraction / préparation des réactions d'amplification. Il est nécessaire de disposer de blouses, gants et instruments dédiés pour l'extraction / préparation des réactions d'amplification et pour l'amplification / détection des produits d'amplification. Ne jamais transférer les blouses, gants et instruments de la zone dédiée à l'amplification / détection des produits d'amplification vers la zone dédiée à l'extraction / préparation des réactions d'amplification. Les échantillons ne doivent être utilisés que pour ce type d'analyse. Les échantillons doivent être manipulés sous une hotte à flux laminaire. Les tubes contenant des échantillons différents ne doivent jamais être ouverts simultanément. Les pipettes utilisées pour manipuler les échantillons ne doivent servir qu'à cet usage exclusif. Les pipettes doivent être du type à distribution positive ou utiliser des embouts à filtre pour aérosol. Les embouts utilisés doivent être stériles, dépourvus de ADNses et ARNses, dépourvus d'adn et ARN. Les réactifs doivent être manipulés sous une hotte à flux laminaire. Les réactifs nécessaires à l'amplification doivent être préparés de façon à être utilisés en une seule session de travail. Les pipettes utilisées pour manipuler les réactifs ne doivent servir qu'à cet usage exclusif. Les pipettes doivent être de type à distribution positive ou utiliser des embouts à filtre pour aérosol. Les embouts utilisés doivent être stériles, dépourvus de ADNses et ARNses, dépourvus d'adn et ARN. Les produits d'amplification doivent être manipulés de façon à en limiter le plus possible la dispersion dans l environnement afin d'éviter tout risque de contamination. Les pipettes utilisées pour manipuler les produits d'amplification ne doivent servir qu'à cet usage exclusif. Avertissements et précautions concernant les composants Les tubes contenant l'amplimix et l'ampliprobe sont des tubes jetables. Ils ne doivent donc être utilisés qu'une seule fois pour la préparation du mélange de réactions. SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 3/19 SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 4/19

4 ÉCHANTILLONS ET CONTRÔLES PROCÉDURE Échantillons Ce produit doit être utilisé avec de l'adn extrait des échantillons biologiques suivants : tampons de lésions muco-cutanées et de plasma prélevé sur EDTA. Tampons de lésions muco-cutanées Les tampons de lésions muco-cutanées utilisés pour l'extraction de l'adn doivent être prélevés selon les indications du laboratoire, mis en suspension dans un moyen de transport pour cultures cellulaires ou dans une solution physiologique stérile ou PBS stérile, transportés à +2 / +8 C et conservés à +2 / +8 C pendant un temps maximum de quatre heures ou congelés à -20 C et conservés pendant un maximum de trente jours ou à -70 C pour un temps de conservation supérieur. Il est conseillé de subdiviser en aliquotes les échantillons à conserver et congeler de façon à ne pas les soumettre à plusieurs cycles de congélation/décongélation. Les instructions de pré-traitement éventuel de l'échantillon clinique et d'extraction de l'adn sont fournies dans la Notice d'instructions et d'utilisation du kit «EXTRAgen». Plasma prélevé sur EDTA Le plasma prélevé sur EDTA doit être récolté suivant les indications du laboratoire, transporté à +2 / +8 C et conservé à +2 / +8 C pendant un temps maximum de quatre heures ou congelé à -20 C et conservé pendant un maximum de trente jours ou à -70 C pour un temps de conservation supérieur. Il est conseillé de subdiviser en aliquotes les échantillons à conserver et congeler de façon à ne pas les soumettre à plusieurs cycles de congélation / décongélation. Les instructions de pré-traitement éventuel de l'échantillon clinique et d'extraction de l'adn sont fournies dans la Notice d'instructions et d'utilisation du kit «EXTRAgen» ou de l'automate d'extraction «NucliSENS easymag». Lors de l extraction de l ADN du plasma avec l automate d extraction «NucliSENS easymag» suivre le protocole d'extraction Generic à partir de 500 µl d échantillon et 55 µl de tampon d'élution. Ajouter au début de l extraction 5 µl de CPE à chaque échantillon à extraire après avoir ajouté le réactif NucliSENS easymag Magnetic Silica. Substances interférentes L'ADN extrait de l'échantillon ne doit pas contenir d'héparine, d'hémoglobine, de dextran, de Ficoll, d'éthanol ou de 2-propanol. Ceci afin d'éviter des phénomènes d'inhibition et des résultats erronés trop fréquents. Des quantités élevées d'adn génomique humain dans l'adn extrait de l'échantillon peuvent inhiber la réaction d'amplification. Aucune donnée n'est disponible concernant les éventuels phénomènes d'inhibition par des médicaments antiviraux, antibiotiques, chimiothérapiques ou immunosuppresseurs. Contrôles d'amplification Chaque étape d'amplification doit impérativement être validée en préparant une réaction de contrôle négatif et une réaction de contrôle positif. Pour le contrôle négatif, utiliser de l'eau bi-distillée stérile (non comprise dans le kit) à ajouter à la réaction à la place de l'adn extrait de l'échantillon. Pour le contrôle positif, utiliser le produit «HSV1 / HSV2 - Positive Control» ou le produit «HSV1 Q - PCR Standard». Contrôles de la qualité Il est conseillé de valider toute la procédure d'analyse de chaque session, extraction et amplification, en utilisant un échantillon négatif et un échantillon positif déjà testés ou du matériel de référence calibré. Mise en œuvre de la session d'amplification real time (À effectuer dans la zone d'amplification / détection des produits d'amplification) En cas d'utilisation de l'instrument 7300 Real-Time PCR System: Avant de commencer, en se reportant à la documentation de l'instrument, il faut: - allumer le thermocycleur pour amplification en temps réel, allumer l'ordinateur, lancer le logiciel dédié et ouvrir une étape de quantification absolue; - paramétrer (Detecteur Manager) le "détecteur" pour la sonde d'hsv1 avec le "reporter" = "FAM" et le "quencher" = "none" (NFQ est un quencher non fluorescent) et l'appeler "HSV1"; - paramétrer (Detecteur Manager) le "détecteur" pour la sonde du contrôle interne avec le "reporter" = "VIC" et le "quencher" = "none" (NFQ est un quencher non fluorescent) et l'appeler "CI"; - pour chaque puits utilisé, paramétrer (Well Inspector) les "détecteurs" (type de fluorescence à mesurer), la "référence passive" = "ROX" (normalisation de la fluorescence mesurée) et le type de réaction (échantillon, contrôle négatif d'amplification, contrôle positif d'amplification ou standard en indiquant le titre). Reporte ces informations dans la Grille de travail annexée à cette notice d'instructions et d'utilisation ou imprimer l'organisation de la microplaque. La Grille de travail doit être suivie scrupuleusement pendant le transfert du mélange de réaction et des échantillons dans les puits. Remarque: pour déterminer le titre de l'adn dans l'échantillon initial, il est nécessaire de préparer une série de réactions avec les Q - PCR standard (10 5 copies, 10 4 copies, 10 3 copies, 10 2 copies) pour obtenir la Courbe standard. Exemple d'organisation d'une l'analyse quantitative de 11 échantillons: C1 C9 C2 C10 C3 C11 C4 CN C C C C Légende: C1 - C12: Échantillons à analyser; CN: Contrôle négatif d'amplification; 10 2 : Standard à 10 2 copies; 10 3 : Standard à 10 3 copies; 10 4 : Standard à 10 4 copies; 10 5 : Standard à 10 5 copies. - En consultant la documentation de l'instrument, sur le thermocycleur paramétrer le cycle de température en indiquant 45 cycles et un volume de réaction de 25 µl. Lorsqu'il est possible sélectionner l'option "9600 émulation". Cycle de température Phase Températures Temps Décontamination 50 C 2 min. Dénaturation initiale 95 C 10 min. 45 cycles 95 C 15 sec. 60 C 1 min. SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 5/19 SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 6/19

5 En cas d'utilisation de l'instrument 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: Avant de commencer, en se reportant à la documentation de l'instrument, il faut: - allumer le thermocycleur pour amplification en temps réel, allumer l'ordinateur, lancer le logiciel dédié, ouvrir une étape de quantification absolue et paramétrer "Run mode: Fast 7500"; - paramétrer (Detecteur Manager) le "détecteur" pour la sonde d'hsv1 avec le "reporter" = "FAM" et le "quencher" = "none" (non fluorescent) et l'appeler "HSV1"; - paramétrer (Detecteur Manager) le "détecteur" pour la sonde du contrôle interne avec le "reporter" = "VIC" et le "quencher" = "none" (NFQ est un quencher non fluorescent) et l'appeler "CI"; - pour chaque puits utilisé, paramétrer (Well Inspector) les "détecteurs" (type de fluorescence à mesurer), la "référence passive" = "ROX" (normalisation de la fluorescence mesurée) et le type de réaction (échantillon, contrôle négatif d'amplification, contrôle positif d'amplification ou standard en indiquant le titre). Reporte ces informations dans la Grille de travail annexée à cette notice d'instructions et d'utilisation ou imprimer l'organisation de la microplaque. La Grille de travail doit être suivie scrupuleusement pendant le transfert du mélange de réaction et des échantillons dans les puits. Remarque: pour déterminer le titre de l'adn dans l'échantillon initial, il est nécessaire de préparer une série de réactions avec les Q - PCR standard (10 5 copies, 10 4 copies, 10 3 copies, 10 2 copies) pour obtenir la Courbe standard. Le modèle d'organisation d'une analyse quantitative de 12 échantillons est illustré à titre d'exemple dans la section précédente concernant la procédure relative à l'instrument 7300 Real Time PCR System. A l'aide de la documentation de l instrument, configurer sur le logiciel dédié (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile) les paramètres du cycle de température: - Ajouter à la phase d amplification l'étape (Add Step) d extension à 72 C; Remarque: l'acquisition de la fluorescence (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) doit être paramétrée lors de l étape d hybridation à 60 C. - modifier les temps selon les valeurs fournies dans le tableau suivant; - paramétrer 45 cycles; - paramétrer un volume de réaction de 30 µl; Cycle de température Phase Températures Temps Décontamination 50 C 2 min. Dénaturation initiale 95 C 10 min. Amplification et détection (45 cycles) 95 C 15 sec. 60 C (acquisition de la fluorescence) 45 sec. 72 C 15 sec. Préparation de l'amplification (À effectuer dans la zone d'extraction / préparation de la réaction d'amplification) Avant de lancer la session, il est nécessaire de : - Prélever et décongeler les échantillons à analyser. Les centrifuger pour en reporter le contenu sur le fond et les conserver dans la glace. - Prélever et décongeler les échantillons d'hsv1 AmpliMIX nécessaires pour la session. Se rappeler que le contenu de chaque tube suffit à la préparation de 24 réactions. Les centrifuger pendant 5 secondes pour en reporter le contenu sur le fond et les conserver dans la glace. - Prélever et décongeler le même nombre de tubes d'hsv1 AmpliPROBE que d'hsv1 AmpliMIX. Les centrifuger pendant 5 secondes pour en reporter le contenu sur le fond et les conserver dans la glace. - Prélever le même nombre de tubes d'amplimaster que d'hsv1 AmpliMIX. À l'encre indélébile, inscrire "HSV1" et la date sur l'étiquette des tubes. Les centrifuger pendant 5 secondes pour en reporter le contenu sur le fond et les conserver dans la glace. - Prélever et décongeler les tubes de HSV1 / HSV2 - Positive Control ou les tubes d HSV1 Q - PCR Standard nécessaires. Remuer doucement les tubes, les centrifuger pendant 5 secondes pour emporter le contenu sur le fond et les conserver dans la glace. - Prélever l Amplification microplate utilisée au cours de la session en prêtant attention à la manipuler avec des gants sans poudre et veiller à ne pas endommager les puits. 1. Transférer 100 µl d'hsv1 AmpliMIX dans le tube d'amplimaster. Mélanger soigneusement et pipeter trois fois le volume de 100 µl dans le mélange. 2. Transférer 100 µl d'hsv1 AmpliPROBE dans le tube d'amplimaster. Mélanger soigneusement et pipeter trois fois le volume de 100 µl dans le mélange. 3. Mélanger pendant 5 secondes au Vortex à faible vitesse, en évitant la production de mousse. 4. Centrifuger les tubes pendant 5 secondes pour en reporter le contenu sur le fond. 5. En les déposant délicatement sur le fond, transférer dans les puits de l Amplification microplate 20 µl du mélange de réaction ainsi obtenu, comme défini précédemment dans la Grille de travail. Remarque : Le mélange de réaction résiduel éventuel doit être conservé à l'abri de la lumière, à une température de -20 C pendant un temps maximum d'un mois, dans le tube marqué "HSV1". Ne congeler et décongeler le mélange de réaction QU'UNE SEULE FOIS. 6. Transférer, en les déposant délicatement dans le mélange de réaction, 5 µl d'adn extrait du premier échantillon dans le puits correspondant de l Amplification microplate, conformément à la Grille de travail élaborée précédemment. Procéder de même avec tous les ADN extraits. 7. Transférer, en les déposant délicatement dans le mélange de réaction, 5 µl d eau ultra pure pour la biologie (non comprise dans le kit), dans le puits de l Amplification microplate du contrôle négatif d'amplification conformément à la Grille de travail élaborée précédemment. 8. Transférer, en les déposant délicatement dans le mélange de réaction, 5 µl de HSV1 / HSV2 - Positive Control, dans le correspondant de l Amplification microplate conformément à la Grille de travail élaborée précédemment. Remarque: Quand ce produit est utilisé pour le dosage de l'adn d'hsv1, transférer, en les déposant délicatement dans le mélange de réaction, 5 µl d HSV1 Q - PCR Standard 10 2 copies dans le puits correspondant de l Amplification microplate conformément à la Grille de travail élaborée précédemment. Procéder de même avec les autres HSV1 Q - PCR Standard (10 3, 10 4, 10 5 copies). 9. Sceller soigneusement l'amplification microplate à l'aide de l'amplification Sealing Sheet. 10. Transférer l'amplification microplate dans le thermocycleur à temps réel, placé dans la zone d'amplification / détection des produits d'amplification et lancer le cycle de température d'amplification en sauvegardant, avec un nom identifiable et ne pouvant prêter à confusion, les données de l étape (p.ex. "année-mois-jour-hsv1-egspa"). Remarque: Au terme du cycle d'amplification, l'amplification microplate contenant les produits de réaction doit être retirée de l instrument et jetée afin de ne pas contaminer l'environnement. Ne jamais soulever l'amplification Sealing Sheet de l'amplification microplate afin d'éviter toute fuite des produits de réaction. SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 7/19 SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 8/19

6 Analyse qualitative des résultats Les valeurs de la fluorescence émise par la sonde spécifique d HSV1 (detecteur FAM "HSV1") et par la sonde spécifique du Contrôle interne (détecteur VIC "CI") doivent être analysées à l'aide du logiciel de l'instrument. Avant de procéder à l'analyse il est nécessaire de : - En consultant la documentation de l'instrument, paramétrer manuellement l'intervalle de calcul du Niveau de fluorescence de base (Baseline) du cycle 6 au cycle 15*. *Remarque : Dans le cas spécifique d'un échantillon positif à titre d HSV1 élevé, la fluorescence FAM de la sonde spécifique pour HSV1 peut commencer d'augmenter avant le 15ème cycle. Dans ce cas, l'intervalle de calcul de la fluorescence de base doit être adapté du cycle 3 au cycle dans lequel la fluorescence FAM commence à augmenter, par exemple le cycle 10. En cas d'utilisation de l'instrument 7300 Real-Time PCR System: - programmer manuellement à 0,2 le Seuil (Threshold) pour le détecteur FAM "HSV1"; - programmer manuellement à 0,1 le Seuil (Threshold) pour le détecteur VIC "CI". En cas d'utilisation d'un instrument 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: - programmer manuellement à 0,1 le Seuil (Threshold) pour le détecteur FAM "HSV1"; - programmer manuellement à 0,05 le Seuil (Threshold) pour le détecteur VIC "CI". Les valeurs de fluorescence émises par les sondes spécifiques et la valeur Seuil de fluorescence sont utilisées pour déterminer le Cycle Seuil (Ct, Threshold Cycle), le cycle où la valeur Seuil de fluorescente a été atteinte. Les valeurs de fluorescence émises par la sonde spécifique pour HSV1 dans la réaction d'amplification de l HSV1 / HSV2 - Positive Control* et la valeur Seuil de fluorescence sont utilisées pour valider l'amplification et la révélation comme décrit dans le tableau suivant : Réaction HSV1 / HSV2 - Positive Control détecteur FAM "HSV1" Résultat du test Amplification / Détection Ct 25 POSITIF CORRECTE Si le résultat de la réaction d'amplification de l HSV1 / HSV2 - Positive Control est Ct > 25 ou si le Ct d'hsv1 est non interprétable (Undetermined), cela indique que l'adn cible n'a pas été détecté correctement. Des problèmes sont apparus pendant la phase d'amplification ou de détection (distribution erronée du mélange de réaction ou du contrôle positif, dégradation du mélange de réaction ou du contrôle positif, paramétrage erroné de la position du contrôle positif ou du cycle de température) qui peuvent engendrer des résultats erronés. La session de travail n'est pas valide et doit être recommencée à partir de la phase d'amplification. *Remarque: Pour le dosage de l ADN d HSV1, l HSV1 / HSV2 - Positive Control a été remplacée par les HSV1 Q - PCR Standard. Dans ce cas, pour valider l amplification et la détection il est nécessaire de se référer aux résultats de l HSV1 Q - PCR Standard Pour la réaction d'amplification du Contrôle négatif, la valeur du Ct d'hsv1 (Results > Report) sert à valider l'amplification et la détection comme indiqué dans le tableau ci-dessous: Réaction Contrôle négatif détecteur FAM "HSV1" Résultat du test Amplification / Détection Ct Non interprétable NÉGATIF CORRECTE Pour les échantillons, la valeur du Ct d'hsv1 est utilisée pour détecter la présence de l'adn cible et la valeur du Ct du contrôle interne est utilisée pour valider l'extraction, l'amplification et la détection. Remarque: Vérifier à l'aide du logiciel de l'instrument (Results > Amplification plot > delta Rn vs Cycle) que le Ct est bien déterminé à partir d'une augmentation rapide et régulière des valeurs de fluorescence et pas à partir de phénomènes de pic ou d'augmentation progressive du signal de fond (fond irrégulier ou élevé). Ce kit est en mesure de détecter une quantité minimale de 10 copies d'adn du gène de la gpd d'hsv1 par réaction d'amplification, correspondant aux génomes Équivalents par réaction (limite de détection du produit, voir paragraphe sur les Caractéristiques des performances). Les résultats relatifs à chaque échantillon sont utilisés pour la recherche d'hsv1, comme décrit dans le tableau ci-dessous: Cycle seuil de l'échantillon detecteur FAM "HSV1" Non interprétable Déterminé detecteur VIC "CI" Ct > 35 ou Non interprétable Échantillon adapté Résultat du test ADN d'hsv1 non adapté non valable - Ct 35 adapté valable, négatif NON REVELE Ct > 35 ou Non interprétable adapté* valable, positif PRÉSENTE Ct 35 adapté valable, positif PRÉSENTE Si le résultat d'un échantillon est Ct Non interprétable pour l'hsv1 et Ct > 35 ou Ct Non interprétable pour le Contrôle interne, cela indique que l'adn du Contrôle interne n'a pas été détecté correctement et que des problèmes sont apparus pendant la phase d'amplification (amplification inefficace ou nulle) ou lors de l'extraction (altération de l'adn, quantité de cellules insuffisante dans l'échantillon, perte de l'adn pendant l'extraction ou présence d'inhibiteurs). Ces problèmes peuvent engendrer des résultats erronés et des faux négatifs. L'échantillon n'est pas conforme, le test n'est pas valable et doit être recommencé à partir de l'extraction de l'échantillon. Si le résultat d'un échantillon est Ct Non interprétable pour l'hsv1 et Ct 35 pour le Contrôle interne, cela indique que l'adn d'hsv1 n'a pas été détecté dans l'échantillon. Il ne faut pas exclure la possibilité que l'adn d'hsv1 soit présent à un titre inférieur au seuil de détection du produit (voir Caractéristiques des performances). Dans ce cas, le résultat serait un faux négatif. Les résultats obtenus avec ce test doivent être interprétés en tenant compte de toutes les données cliniques et des résultats des autres examens de laboratoire du patient. Remarque: Lorsque, dans la réaction d'amplification d'un échantillon, la présence de l'adn d'hsv1 a été détectée, le Contrôle interne peut avoir un Ct > 35 ou Ct Non interprétable. En effet, la réaction d'amplification à faible efficacité du Contrôle interne peut être annulée par la compétition avec la réaction d'amplification à haute efficacité d'hsv1. Dans ce cas, l'échantillon est convient et le résultat positif du test est valable. Si le résultat de la réaction d amplification du Contrôle négatif est différent de Ct Non interprétable (Undetermined), cela indique que de l ADN cible a été détecté et que des problèmes sont apparus pendant la phase d'amplification (contamination) pouvant engendrer des résultats erronés et des faux positifs. La session de travail n'est pas valide et doit être recommencée à partir de la phase d'amplification. SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 9/19 SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 10/19

7 Analyse quantitative des résultats Apres avoir exécuter la procédure pour l'analyse qualitative des résultats, il est possible exécuter l'analyse quantitative des résultats inhérents les échantillons positifs. Les valeurs de Ct de la sonde spécifique pour HSV1 dans les réactions d'amplification des quatre Q - PCR Standard sont utilisés pour calculer la Courbe standard (Standard Curve) de la session d'amplification et pour valider l'amplification et la détection, comme décrit dans le tableau suivant: Courbe Standard détecteur FAM "HSV1" Intervalle d'acceptabilité Amplification / Detection Coefficient de corrélation (R2) 0,990 R2 1,000 CORRECTE Si la valeur du Coefficient de corrélation (R2) ne rentre pas dans les seuils il y a eu de problèmes en phase d'amplification ou de révélation (volumes de mélange de réaction erronés, dégradation de la sonde ou des standards, distribution erronée des standards, paramétrage erroné de la position des standards ou du cycle de température) qui peuvent générer des résultats erronés. La session n'est pas valable et doit être recommencée à partir de la phase d'amplification. Les valeurs de Ct émises par la sonde spécifique pour HSV1 dans les réactions d'amplification de chaque échantillon et la Courbe standard de la session d'amplification sont utilisées pour calculer la Quantité (Quantity) d'adn cible présente dans les réactions d'amplification relatives aux échantillons. Ce kit est en mesure de doser de à 10 copies d'adn du gène codant la gpd de HSV1 dans la réaction d'amplification, correspondant aux génomes Équivalents par réaction (voir paragraphe sur les Caractéristiques des performances), comme décrit dans le tableau ci-après : Résultat de l'échantillon détecteur FAM "HSV1" génomes Équivalents d'hsv1 par réaction Quantité > 1 x 10 6 SUPÉRIEURS À x 10 1 Quantité 1 x 10 6 = Quantité Quantité < 1 x 10 1 INFÉRIEURS À 10 Les résultats (Quantité) de chaque échantillon (Results > Report) sont utilisés pour calculer le nombre de génomes Équivalents (geq) d HSV1 présents dans l'échantillon initial (Nc) selon la formule: Ve x Quantité Nc = Vc x Va x Ee Où: Vc est la quantité d'échantillon utilisée dans l'extraction exprimé selon l unité de mesure requête; Ee est l'efficacité de l'extraction, exprimée en décimaux; Ve est le volume total de l'extraction exprimé en µl; Va est le volume de produit d'extraction utilisé dans la réaction d'amplification exprimé en µl; Quantité est le résultat de la réaction d'amplification exprimé en geq par réaction. Lorsque l'on utilise le kit d'extraction «EXTRAgen» et on veut obtenir le résultat exprimé en geq / ml, la formule devient: Formule simplifiée pour «EXTRAcell» Vc = 0,3 ml Ee = 0,8 (efficacité moyenne de 80%) Ve = 15 µl Va = 5 µl 15 x Quantité Nc (geq / ml) = 0,3 x 5 x 0,8 Nc (geq / ml) =12,5 x Quantità Lorsque l'on utilise le système d'extraction «NucliSENS easymag» en vue d'obtenir le résultat exprimé en geq / ml, la formule est la suivante: Formule simplifiée pour «NucliSENS easymag» Vc = 0,5 ml Ee = 1,0 (efficacité moyenne de 100%) Ve = 55 µl Va = 5 µl 55 x Quantité Nc (geq / ml) = 0,5 x 5 x 1,0 Nc (geq / ml) = 22 x Quantité Calcul des seuils de l'intervalle du dosage Lorsque l'on utilise une méthode d'extraction particulière, les seuils de l'intervalle de dosage peuvent être calculés à partir de l'intervalle de dosage de la réaction d'amplification suivant ces formules: Ve x 10 geq Seuil inférieur (geq / ml) = Vc x Va x Ee Ve x geq Seuil supérieur (geq / ml) = Vc x Va x Ee Lorsque l'on utilise le kit d'extraction «EXTRAgen», la formule devient: Seuils de l'intervalle linéaire de mesure avec «EXTRAgen» Seuil inférieur (geq / ml) = 12,5 x 10 geq Seuil supérieur (geq / ml) = 12,5 x geq de 125 à geq / ml Lorsque l'on utilise le système d'extraction «NucliSENS easymag», la formule devient: Limites de l'intervalle de mesure linéaire avec «NucliSENS easymag» Seuil inférieur (geq / ml) = 22 x 10 geq Seuil supérieur (geq / ml) = 22 x geq De 220 à geq / ml SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 11/19 SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 12/19

8 LIMITES DE LA PROCÉDURE CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES Utiliser avec ce produit uniquement l'adn extrait des échantillons humains suivants : tampons de lésions muco-cutanées et de plasma prélevé sur EDTA. Ne pas utiliser l'adn extrait d'échantillons contenant de l'héparine: l'héparine inhibe la réaction d'amplification des acides nucléiques et génère des résultats erronés. Ne pas utiliser de l'adn contaminé par de l'hémoglobine, du dextran, du Ficoll, de l'éthanol ou du 2-propanol: ces substances inhibent la réaction d'amplification des acides nucléiques et peuvent engendrer des résultats erronés. Ne pas utiliser de l'adn contenant des quantités élevées d'adn génomique humain car l'adn génomique peut inhiber la réaction d'amplification des acides nucléiques. Aucune donnée n'est disponible pour les performances de ce produit avec de l ADN extrait des échantillons cliniques suivants: liquide céphalo-rachidien, sang total prélevé dans un tube EDTA, liquide amniotique. Aucune donnée n'est disponible concernant les éventuels phénomènes d'inhibition par des médicaments antiviraux, chimiothérapiques ou immunosuppresseurs. Les résultats du test sont subordonnés à la bonne exécution de la collecte, du transport, de la conservation et de la préparation des échantillons ; pour éviter tout résultat erroné, il est donc essentiel d'y apporter tout le soin possible et de suivre attentivement les instructions fournies avec les produits pour l'extraction des acides nucléiques. Compte tenu de sa forte sensibilité analytique, la méthode d'amplification en real time des acides nucléiques utilisée dans ce test, est sujette à contamination par des échantillons cliniques positifs pour l'hsv1, par des contrôles positifs et par des produits mêmes de la réaction d'amplification. Les contaminations entraînent des résultats faux positifs. Les modes de réalisation du produit peuvent limiter les contaminations ; cependant, ces phénomènes peuvent être évités avec une bonne pratique des techniques de laboratoire et le respect scrupuleux des consignes fournies dans cette notice. Pour éviter tout accident pouvant avoir des conséquences graves pour l'utilisateur ou des tierces personnes, ce test doit être réalisé par un personnel compétent et formé à la manipulation d'échantillons biologiques (pouvant transmettre des agents infectieux) et de produits chimiques dangereux. Pour éviter tout accident pouvant avoir des conséquences graves pour l'utilisateur ou des tierces personnes, le port de vêtements de travail et l'accès à des locaux adaptés à la manipulation d'échantillons biologiques (pouvant transmettre des agents infectieux) et des produits chimiques dangereux sont requis. Afin d'éviter d'obtenir des résultats erronés, ce produit doit être manipulé par un personnel compétent et formé aux procédures de biologie moléculaire (extraction, amplification et détection d'acides nucléiques). Afin d'éviter d'obtenir les faux positif, il est nécessaire de disposer de locaux distincts pour l'extraction / préparation des réactions d'amplification et pour l'amplification / détection des produits d'amplification. Afin d'éviter d'obtenir les faux positif, il est nécessaire de porter de vêtements de travail et d'utiliser des instruments dédiés à l'extraction / préparation des réactions d'amplification ou à l'amplification / détection des produits d'amplification. Un résultat négatif obtenu avec ce produit indique que l'adn de HSV1 n'a pas été détecté dans l'adn extrait de l'échantillon, mais il n'est pas à exclure que l'adn de HSV1 soit présent à un titre inférieur au seuil de détection du produit (voir paragraphe sur les Caractéristiques des performances); dans ce cas, le résultat serait un faux négatif. À l'instar de tous les autres tests diagnostiques, les résultats obtenus avec ce produit doivent être interprétés au vu de toutes les données cliniques et des autres examens de laboratoire concernant le patient. À l'instar de tout autre dispositif de diagnostic, ce produit présente un risque résiduel de résultats non valables, faux positifs et faux négatifs. Ce risque résiduel ne peut être supprimé ni même diminué. Dans certaines situations, par exemple le diagnostic d'urgence, ce risque résiduel peut contribuer à la prise de décisions erronées pouvant avoir de graves conséquences pour le patient. Sensibilité analytique : seuil de détection La sensibilité analytique de ce test permet d'identifier la présence d'environ 10 molécules d'adn cible dans les 5 µl d'adn extrait ajoutés à la réaction d'amplification. La sensibilité analytique du test, comme seuil de détection, a été testée à partir d'un ADN plasmidique contenant le produit d'amplification dont la concentration initiale a été mesurée par spectrophotométrie. L'ADN plasmidique a été dilué à un titre de 10 copies / 5 µl dans de l'adn génomique humain à un titre de 500 ng / 5 µl. Cet échantillon a été utilisé dans 50 réplications pour effectuer l'amplification avec les produits ELITechGroup S.p.A. (voir paragraphie sur les kits accessoires). Les résultats finaux sont récapitulés dans le tableau suivant : Échantillons N positifs négatifs 10 copies d'adn plasmidique ng d'adn génomique humain Sensibilité analytique : intervalle linéaire de mesure La sensibilité analytique de ce test, comme intervalle linéaire de mesure, permet de déterminer un titre de à 10 molécules d'adn cible dans les 5 µl d'adn extrait, ajoutés à la réaction d'amplification. La sensibilité analytique du test, comme intervalle linéaire de mesure, a été déterminée en utilisant un panel de dilutions (1 log10 entre une dilution et l'autre) d'adn plasmidique contenant le produit d'amplification, dont la concentration initiale a été mesurée par spectrophotométrie. Les points du panel de 10 7 à 10 1 molécules par réaction ont été utilisés dans 9 réplications pour réaliser l'amplification avec les produits ELITechGroup S.p.A. L'analyse des données obtenues, réalisée par régression linéaire, a démontré que le test présente une réponse linéaire pour tous les points du panel (coefficient de corrélation linéaire supérieur à 0,99). Le seuil supérieur de l'intervalle linéaire de mesure a été fixé à 10 6 molécules / 5 µl, dans un logarithme du standard d'amplification HSV1 Q - PCR Standard à la plus haute concentration, (10 5 molécules / 5 µl). Le seuil inférieur de l'intervalle linéaire de mesure a été fixé à 10 molécules / 5 µl, dans un logarithme du standard d'amplification HSV1 Q - PCR Standard à la plus faible concentration, (10 2 molécules / 5 µl). Les résultats finaux sont récapitulés dans le tableau suivant : Intervalle linéaire de mesure Copies d ADN / réaction Seuil supérieur Seuil inférieur 10 À la page 11 sont indiquées les limites de l intervalle linéaire de mesure exprimées en geq / ml en fonction du kit d extraction utilisé. Sensibilité analytique: Précision L'étude de la précision du test, entendue comme variabilité des résultats obtenus avec différentes réplications d'un échantillon au cours d'une même session, a permis de déterminer un coefficient de variation pourcentage moyen (CV%) de 9,6% compris dans un intervalle linéaire de mesure de 10 6 molécules / 5 µl à 10 molécules / 5 µl. Sensibilité analytique: Fidélité L'étude de la fidélité du test, entendue comme différence entre la moyenne des résultats obtenus au cours d'une même session avec différentes réplications d'un échantillon et la valeur théorique de la concentration de l'échantillon, a permis de déterminer un manque de fidélité moyenne de 6,4% compris dans l'intervalle linéaire de mesure de 10 6 molécules / 5 µl à 10 molécules / 5 µl. SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 13/19 SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 14/19

9 Sensibilité analytique: reproductibilité avec panel pour test de rendement En ce qui concerne la reproductibilité des résultats comparés aux résultats obtenus avec d'autres méthodes dans différents laboratoires, la sensibilité analytique du test a été vérifiée avec un panel de plasmas pour test de rendement. Les essais ont été effectués en utilisant comme matériel de référence calibré un panel de dilution (1 log10 entre une dilution et l'autre) d'hsv1 en plasma dans la concentration limite (PeliCheck HSV-1/2-DNA- 02, AcroMetrix Europe B.V., the Netherlands). Chaque échantillon du panel a été utilisé dans 3 réplications pour effectuer toute la procédure d'analyse, extraction et amplification, avec les produits ELITechGroup S.p.A. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant : Essais avec produit de référence calibré Valeur théorique Valeur théorique Valeur théorique Moyenne des résultats Réplications Positifs NDU / ml NDU / extraction NDU / réaction geq / réaction 5,0 1,5 0, ,49 50,0 15,0 4, ,19 500,0 150,0 40, , ,0 1500,0 400, , , ,0 4000, ,30 Dans ces tests, une NDU (NAT Detection Unit) d'acrometrix Europe B.V. s'est révélée équivalente à environ 9 geq calculés à l'aide de produit «HSV1 Q - PCR Standard» de ELITechGroup S.p.A. Sensibilité diagnostique : efficacité de détection et de quantification sur différents génotypes / soustype La sensibilité diagnostique du test, entendue comme efficacité de détection et de quantification sur différents génotypes / sous-types, a été évaluée en comparant des séquences à des banques de données nucléotidiques. L'examen de l'alignement des régions choisies pour l'hybridation des oligonucléotides d'amorçage d'amplimix et de la sonde fluorescente AmpliPROBE avec les séquences disponibles dans la banque de données du gène codant la glycoprotéine D (gpd) d HSV1, a démontré leur conservation et l'absence de mutations significatives. Sensibilité diagnostique: échantillons positifs La sensibilité diagnostique du test, entendue comme confirmation d'échantillons cliniques positifs, a été évaluée en utilisant comme matériel de référence plusieurs tampons muco-cutanés positifs pour l'adn d'hsv1. La sensibilité diagnostique a été évaluée en utilisant 5 tampons muco-cutanés positifs pour l'adn d'hsv1 (testés suivant une méthode d'amplification nested). Chaque échantillon a été utilisé pour effectuer toute la procédure d'analyse, extraction et amplification, avec les produits ELITechGroup S.p.A. Les résultats finaux sont récapitulés dans le tableau suivant : Échantillons N positifs négatifs non valable Tampons génitaux positifs pour l'adn d'hsv Spécificité analytique: marqueurs potentiellement interférents La spécificité analytique du test, entendue comme réactivité croisée avec d'autres marqueurs potentiellement interférents, a été évaluée en comparant des séquences avec des banques de données nucléotidiques. L'examen de l'alignement des régions, choisies pour l'hybridation des oligonucléotides d'amorçage d'amplimix et de la sonde fluorescente AmpliPROBE avec les séquences, disponibles dans la banque de données, d'organismes différents d'hsv1, notamment celles du génome complet d'hsv2, le virus herpétique humain le plus similaire à HSV1, a démontré leur spécificité et l'absence d'homologies significatives. En ce qui concerne l'absence de réactivité croisée avec d'autres marqueurs potentiellement interférents, la spécificité analytique du test a été vérifiée en utilisant comme matériel de référence plusieurs échantillons de tampons génitaux positifs pour l'adn d'hsv2. La spécificité analytique du test a été vérifiée en utilisant 22 tampons muco-génitaux positifs pour l'adn d'hsv2 (testés suivant une méthode d'amplification nested). Chaque échantillon a été utilisé pour effectuer toute la procédure d'analyse, extraction et amplification, avec les produits ELITechGroup S.p.A. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant : Échantillons N positifs négatifs Tampons génitaux positifs pour l'adn d'hsv Un échantillon positif pour l'adn d'hsv2 s'est avéré positif aussi pour l'adn d'hsv1 à un titre inférieur à 125 geq / ml (105 geq / ml). Ce titre est inférieur au seuil de détection de la plupart des méthodes d'amplification et peut, statistiquement, engendrer des résultats positifs. En outre, 9 autres échantillons positifs pour l'adn d'hsv2 avec un titre similaire (environ geq / ml) se sont avérés négatifs pour l'hsv1. Il semble donc que cette positivité ne puisse être imputée à une réactivité croisée avec HSV2. Spécificité diagnostique : échantillons négatifs La spécificité diagnostique du test, comme confirmation d'échantillons cliniques négatifs, a été évaluée en effectuant l'analyse d'un panel de plasmas normaux de donateurs et de plusieurs échantillons de tampons génitaux négatifs pour l'adn d'hsv1 et s'est avérée être de 89,8%. La spécificité diagnostique a été évaluée en utilisant un panel d'échantillons de plasmas normaux de donateurs (Panel Normal Human Plasma, Acrometrix Europe B.V., the Netherlands). Chaque échantillon du panel a été utilisé pour effectuer toute la procédure d'analyse, extraction et amplification, avec les produits ELITechGroup S.p.A. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant: Échantillons N positifs négatifs Panel de plasmas normaux de donateurs L'écart entre les résultats obtenus avec les produits ELITechGroup S.p.A. et les résultats attendus pourrait s'expliquer par le fait que les plasmas sont probablement négatifs pour l'adn d'hsv1, un virus très répandu parmi la population et à l'origine d'infections récurrentes qui, dans la plupart des cas, ne présentent pas d'intérêt clinique. Les 3 échantillons qui se sont avérés positifs ont un titre inférieur à 125 geq / ml (16, 29 et 12 geq / ml. La spécificité diagnostique a été évaluée en utilisant 21 tampons génitaux négatifs pour l'adn d'hsv1 (testés suivant une méthode d'amplification nested). Chaque échantillon du panel a été utilisé pour effectuer toute la procédure d'analyse, extraction et amplification, avec les produits ELITechGroup S.p.A. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant : Échantillons N positifs négatifs Tampons génitaux négatifs pour l'adn d'hsv Les écarts entre les résultats obtenus avec les produits ELITechGroup S.p.A. et ceux obtenus avec le système d'amplification nested pourraient s'expliquer par le titre inférieur à 125 geq / ml (63 et 11 geq / ml) des 2 échantillons positifs. Ces titres sont inférieurs au seuil de détection de la plupart des méthodes d'amplification et peuvent générer des résultats statistiquement positifs. Remarque: Les données et les résultats complets des essais effectués pour l'évaluation des caractéristiques des performances du produit avec les matrices et les instruments ont été enregistrés dans la Section 7 du Fascicule Technique de Produit "", FTP RTS031. BIBLIOGRAPHIE E. Aurelius et al. (1993) J. Med. Virology 39: SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 15/19 SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 16/19

10 PROBLÈMES ET SOLUTIONS LÉGENDE DES SYMBOLES ADN cible non révélé dans la réaction de Positive Control / Q - PCR Standard ou Coefficient de corrélation de la Courbe standard non valable Référence du catalogue. Causes éventuelles Erreur de préparation du mélange de réaction. Erreur de distribution dans la microplaque. Dénaturation de la sonde. Solutions Vérifier les volumes de réactifs distribués pendant la préparation du mélange de réaction. Distribuer avec soin les réactions dans la microplaque en suivant la grille de travail. Vérifier les volumes de mélange de réaction distribués. Vérifier les volumes de standards distribués. Utiliser un nouvel aliquote de sonde. Limite supérieure de température. Numéro du lot. Date de péremption (dernier jour du mois). Dénaturation des standards. Erreur de paramétrage de l'instrument. Présence d'adn cible dans la réaction de Contrôle négatif Utiliser un nouvel aliquote de standards. Vérifier la position des réactions des standards paramétrée sur l'instrument. Vérifier le cycle de température paramétré sur l'instrument. In vitro diagnostic. Conforme aux exigences essentielles de la Directive européenne 98\79\CE concernant le diagnostic in vitro. Causes éventuelles Erreur de distribution dans la microplaque. Solutions Éviter de répandre le contenu des tubes contenant les échantillons. Changer toujours d'embout entre un échantillon et l'autre. Distribuer soigneusement échantillons, contrôles négatifs et standard dans la microplaque en suivant la grille de travail. CONT Contenu suffisant pour "N" tests. Contenus. Erreur de paramétrage de l'instrument. Vérifier la position des échantillons, contrôles négatifs et standards paramétrés sur l'instrument. Attention, consulter le mode d'emploi. Microplaque mal scellée. Sceller méticuleusement la microplaque. Contamination de l eau ultra pure pour la biologie. Utiliser un nouvel aliquote d'eau. Fabriqué par Contamination du mix d'amplification. Utiliser un nouvel aliquote de mix d'amplification. Contamination de la zone d'extraction / préparation des réactions d'amplification. Nettoyer les surfaces et les instruments à l'aide d'un détergent aqueux, laver les blouses et remplacer les tubes et les embouts utilisés. Présence élevée de fluorescence de base dans les réactions Causes éventuelles Erreur de paramétrage de la "baseline". Solutions Paramétrer l'intervalle de calcul de la "baseline" dans une plage de cycles où la fluorescence de base est déjà stabilisée (contrôler les enregistrements "component") et où la fluorescence du signal n'a pas encore commencé à croître, par exemple du cycle 9 au cycle 15. Ce produit permet à l'acheteur de l'utiliser pour l'amplification et la révélation de séquences d'acides nucléiques afin de fournir des services de diagnostic humain in vitro. Ce droit est accordé uniquement si le produit fourni est utilisé conjointement aux produits couverts par une licence "Positive Control" ou "Q - PCR Standard" d ELITechGroup S.p.A. L'achat de ce produit ne confère aucun droit général ni aucune autre licence, d'aucun type, différents de cette autorisation spécifique d'utilisation. «NucliSENS easymag» sont des marques enregistrées de biomérieux. SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 17/19 SCH mrts031m_fr 01/02/16 Révision 04 Page 18/19