RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES D ANALYSES OIV

Transcription

1 Méthode OIV-MA-AS Méthode Type II Acide lactique Méthode enzymatique 1. Principe de méthode En présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) l'acide lactique total (L lactate et D-lactate) est oxydé en pyruvate dans une réaction catalysée par la L lactate déshydrogénase () et la D-lactate déshydrogénase (D-LDH). L'équilibre de la réaction est en faveur du lactate. L'élimination du pyruvate du milieu réactionnel déplace l'équilibre de la réaction dans le sens de la formation de pyruvate. En présence de L-glutamate, le pyruvate est transformé en L-alanine, réaction catalysée par la glutamate-pyruvate-transaminase (GPT). (1) L-lactate + NAD + pyruvate + NADH + H + (2) D-lactate + NAD + pyruvate + NADH + H + (3) Pyruvate + L-glutamate L-alanine + -cétoglutarate La formation de NADH, mesurée par l'augmentation de l'absorbance à la longueur d'onde de 340 nm, est proportionnelle à la quantité de lactate présente. Remarque : L'acide L-lactique peut être déterminé individuellement par application des réactions (1) et (3). L'acide D-lactique peut être déterminé individuellement par application des réactions (2) et (3). 2. Appareillage 2.1. Spectrophotomètre permettant d'effectuer les mesures à 340 nm, maximum d'absorption du NADH. À défaut, photomètre à spectre discontinu permettant d'effectuer les mesures à 334 nm ou à 365 nm Cuves de verre de 1 cm de trajet optique ou cuves à usage unique Micropipettes permettant de prélever des volumes compris entre 0,02 et 2 ml. OIV-MA-AS : R2009 1

2 3. Réactifs Eau bidistillée 3.1. Solution tampon ph 10 (glycylglycine 0,6 mole/l ; L-glutamate 0,1 mole/l). Dissoudre 4,75 g de glycylglycine, 0,88 g d'acide L-glutamique dans environ 50 ml d'eau bidistillée ; ajuster le ph à 10 avec quelques millilitres de solution d'hydroxyde de sodium 10 M et porter à 60 ml avec de l'eau bidistillée. La solution reste stable pendant au moins 12 semaines à + 4 C Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) environ M ; dissoudre 900 mg de NAD dans 30 ml d'eau bidistillée. La solution reste stable pendant au moins 4 semaines à + 4 C Suspension de glutamate-pyruvate-transaminase (GPT) à 20 mg/ml. La suspension est stable pendant au moins un an à + 4 C Suspension de L-lactate-déshydrogénase () à 5 mg/ml. La suspension est stable pendant au moins un an à + 4 C Suspension de D-lactate-déshydrogénase (D-LDH) à 5 mg/ml. La suspension est stable pendant au moins un an à + 4 C. Il est recommandé de procéder, préalablement au dosage, à la vérification de l'activité de l'enzyme. Remarque : L'ensemble des réactifs nécessaires pour le dosage est disponible dans le commerce. 4. Préparation de l'échantillon Le dosage du lactate s'effectue généralement directement sur le vin sans décoloration préalable et sans dilution si la concentration en acide lactique est inférieure à 100 mg/l. Si la concentration du vin en acide lactique est comprise entre : 100 mg/l et 1 g/l diluer 1 / 10 avec de l'eau bidistillée ; 1 g/l et 2,5 g/l diluer 1 / 25 avec de l'eau bidistillée ; 2,5 g/l et 5 g/l diluer 1 / 50 avec de l'eau bidistillée. 5. Mode opératoire Remarques préliminaires : Eviter de toucher avec les doigts la partie de la verrerie qui entre en contact avec le milieu réactionnel, ceci pouvant être une cause d apport d acide L-lactique qui fausserait le résultat. La solution tampon doit être ramenée à C avant de procéder au dosage Dosage de l'acide lactique total Le spectrophotomètre étant réglé sur la longueur d'onde 340 nm, les mesures d'absorbance se font dans les cuves de 1 cm de trajet optique, l'absorbance zéro étant réglée par rapport à l'air (pas de cuve sur le trajet optique) ou par rapport à l'eau. OIV-MA-AS : R2009 2

3 Dans les cuves de 1 cm de trajet optique introduire : Témoin (ml) Dosage (ml) Solution Solution Eau bidistillée Suspension Echantillon Mélanger à l'aide d'un agitateur de verre ou d'une baguette de matière synthétique à bout aplati ; après environ 5 minutes, mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A 1 ). Ajouter 0,02 ml de solution 3.4 et 0,05 ml de solution 3.5, homogénéiser, attendre la fin de la réaction (environ 30 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A 2 ). Déterminer les différences d'absorbances (A 2 -A 1 ) du témoin et du dosage. Déduire la différence d'absorbances du témoin de la différence d'absorbance du dosage. A = A D A T 5.2. Dosage de l'acide L-lactique et de l'acide D-lactique Le dosage de l'acide L-lactique et D-lactique peut être réalisé individuellement en appliquant le mode opératoire indiqué pour l'acide lactique total, mais en opérant ainsi après avoir déterminé A 1 : Ajouter 0,02 ml de solution 3.4, homogénéiser, attendre la fin de la réaction (environ 20 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A 2 ). Ajouter 0,05 ml de solution 3.5, homogénéiser, attendre la fin de la réaction (environ 30 minutes) et mesurer les absorbances des solutions témoin et dosage (A 3 ). Déterminer les différences d'absorbances (A 2 -A 1 ) pour l'acide L-lactique et (A 3 A 2 ) pour l'acide D-lactique dans le cas du témoin et dans le cas du dosage. Déduire la différence d'absorbance du témoin de la différence d'absorbance du dosage A = A D A T Remarque : Le temps nécessaire à l'action des enzymes peut varier d'un lot à l'autre. Il n'est donné ci-dessus qu'à titre indicatif. Il est recommandé de le déterminer pour chaque lot. Lorsqu'on dose l'acide L-lactique seul, le temps d'incubation après addition de la L-lactate deshydrogénase peut être ramené à 10 minutes. OIV-MA-AS : R2009 3

4 6. Expression des résultats La concentration en acide lactique est donnée en grammes par litre (g/l) avec 1 décimale Mode de calcul 6.1. Mode de calcul La concentration en grammes par litre est calculée par la formule générale : V x PM C x x x 1000 x V = volume du test en millilitres (V = 2,24 ml pour l'acide L-lactique, V = 2,29 ml pour l'acide D-lactique et l'acide lactique total). ν = volume de l'échantillon en millilitres (ici 0,2 ml) PM = masse moléculaire de la substance à doser (ici acide DL-lactique = 90,08) δ = trajet optique de la cuve en centimètres (ici 1 cm) = coefficient d'absorption du NADH à 340 nm ( = 6,3 mmole -1 x l x cm -1 ) Acide lactique total et acide D-lactique C = 0,164 x A Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution. Remarque : Mesure à 334 nm : = 6,2 (mmole -1 x l x cm -1 ). C = 0,167 x A, Mesure à 365 nm : = 3,4 (mmole -1 x l x cm -1 ). C = 0,1303 x A, Acide L-lactique C = 0,160 x A Si une dilution a été effectuée lors de la préparation de l'échantillon, multiplier le résultat par le facteur de dilution. Remarque : Mesure à 334 nm : = 6,2 (mmole -1 x 1 x cm -1 ). C = 0,163 x A, Mesure à 365 nm : = 3,4 (mmole -1 x 1 x cm -1 ). C = 0,297 x A, OIV-MA-AS : R2009 4

5 6.2. Répétabilité (r) r = 0,02 + 0,07 x i x i = concentration en acide lactique de l'échantillon en g/l Reproductibilité (R) R = 0,05 + 0,125 x i x i = concentration en acide lactique de l'échantillon en g/l. BIBLIOGRAPHIE HOHORST H.J., in Méthodes d'analyse enzymatique, par BERGMEYER H.U., 2 e éd., p. 1425, Verlag-Chemie Weinheim/Bergstaße, GAWEHN K. et BERGMEYER H.U., ibid., p BOEHRINGER, Mannheim, Méthodes d'analyse enzymatique en chimie alimentaire, documentation technique. JUNGE Ch., F.V., O.I.V., 1974, n o 479. VAN DEN DRIESSCHE S. et THYS L., F.V., O.I.V., 1982, n o 755. OIV-MA-AS : R2009 5