1 ère partie : Enzymologie et Métabolisme

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1 SVI612 Biochimie-Immunologie Licence BGSTU Année SVI612 Biochimie TD,TP 1 ère partie : Enzymologie et Métabolisme Enseignantes ichri Imène Knoll-Gellida Anja Trossat-Magnin Claudine Equipe de mise en place du TP André Michèle Milochau Alexandra Trossat-Magnin Claudine Sommaire _ TD 1 et 2 Enzymologie pages 2 à 6 _ TD 1 et 2 Métabolisme pages 6 à 18 _ TP Enzymologie pages 19 à 20 _ Annexes pages 21 à 22 Responsable TP/TD: Trossat-Magnin Claudine

2 2 Exercice 1 On considère la réaction S P catalysée par une enzyme dont on connaît le K M égal à M et la Vmax égale à 400 mm.min -1. 1) Calculez (S) lorsque l on travaille à V = Vmax/4. 2) On souhaite doubler la vitesse de la réaction enzymatique, quelle concentration en substrat devra-t-on utiliser? Exercice 2 On considère une enzyme Michaélienne de poids moléculaire 60 kda. On réalise la réaction enzymatique en mettant 8 µl d une solution d enzyme à 120 µg/ml dont le degré de pureté est de 90% dans 1 ml de volume réactionnel. La Vmax est égale à 0,3 mm.min -1. Calculez : 1) la concentration d enzyme dans le milieu réactionnel. 2) le nombre d unités d enzyme contenues dans le milieu réactionnel. 3) l activité spécifique de l enzyme. 4) l activité moléculaire spécifique de l enzyme. Exercice 3 On dispose d une préparation de glucokinase (GK) dont on se propose de mesurer l activité. Pour cela, on utilise un dosage spectrophotométrique couplé à la glucose 6-phosphate déshydrogénase (GPD). NAD λ max = 340 nm et ε M = 6300 M -1 cm -1. GK GPD Glucose Glucose 6-P Gluconate 6P ATP ADP NAD + NAD + + On dispose d une solution mère de GK à 200 unités par ml et dont le poids moléculaire est égale à 41kDa. On déclenche la réaction enzymatique dans la cuve du spectrophotomètre par addition de GK dans 1,5 ml d une solution tamponnée de glucose. La réaction dure 10 min et la DO est linéaire jusqu à DO = 1. Les K M par rapport à l ATP et au Glucose sont de l ordre de 1 mm à 3 mm. 1) Calculez le nombre d unités de GK et de GPD à introduire dans le milieu réactionnel. 2) Indiquez les concentrations de glucose et d ATP qui devront être présentes dans la cuve. La GK possède également une activité mannokinase (MK) : Mannose MK Mannose 6P ATP ADP En mesurant l activité enzymatique à saturation, on constate que la variation de DO par

3 3 minute est de 0,115 pour l activité GK et de 0,025 pour l activité MK par un système couplé utilisant également le NAD + /NAD. 3) Que peut-on déduire de ce résultat? On a mesuré l activation thermique de la GK à saturation entre 20 C et 50 C, domaine dans lequel l enzyme n est pas inactivée. Le tableau donne les activités enzymatiques obtenues. R = 8,32 J.mol -1.K -1. T ( C) (DO/min)x , ,8 37,2 46 4) A partir d un graphe approprié, estimez l énergie d activation de la réaction. Exercice 4 On a mesuré la constante catalytique de la réaction enzymatique d hydrolyse du p-nitrophenyl-β-d-glucoside par la β-glucosidase d amande pour des températures comprises entre 2 C et 40 C. R = 8,314 J. mol -1.K -1 T ( C) k cat (s -1 ) 0,11 0,15 0,18 0,22 0,35 0,41 0,55 0,6 0,9 1) Calculez l énergie d activation de la réaction liée à k cat. 2) Par quel facteur Q10 la vitesse est-elle multipliée lorsque la température varie de 25 C à 35 C. Rappel : Q10 = V2/V1 pour T2-T1 = 10 C. Exercice 5 On prépare un extrait foliaire de mil en broyant 25 mg de matière sèche (MS) de feuille lyophilisée dans 1,5 ml d un tampon adéquat. Le broyat de feuille obtenu est centrifugé puis le surnageant est récupéré. On veut étudier la phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC) présente dans les feuilles de mil. La PEPC catalyse la transformation du phosphoénolpyruvate (PEP) en oxaloacétate. On sait que cette enzyme a un K M de l ordre de 2 mm et que la feuille de mil contient environ 100 unités/g de MS. On a mesuré l activité PEPC grâce à un dosage couplé utilisant la malate déshydrogénase (MD) : PEPC MD Phosphoénolpyruvate oxaloacétate malate (PEP) (OAA) CO 2 Phosphate NAD NAD + Dans une cuve de spectrophotomètre, on prépare 1,5 ml du milieu réactionnel contenant du NAD à 0,16 mm, du KCO 3 à 6,25 mm, du PEP, de la MD et du tampon. On déclenche la réaction en introduisant x µl de l extrait foliaire et on mesure la densité optique du milieu réactionnel à 340 nm. ε M du NAD = 6300 M -1 cm -1 1) Entre quelles valeurs faut-il faire varier la concentration de PEP pour déterminer le K M visà-vis du PEP?

4 4 2) Sachant que la réaction dure 10 min et que la mesure de la DO au spectrophotomètre est linéaire de 0 à 1 de DO, quel volume x d extrait foliaire proposez-vous d utiliser? 3) Combien d unités de MD proposez-vous d introduire dans le milieu réactionnel? Dans ces conditions expérimentales, on a mesuré l activité PEPC : (PEP) [mm] 1,05 1,09 1,11 1,23 1,4 1,89 2,96 3,8 4,89 5,92 6,95 Vi 9, ,5 19, ,5 55, ,3 85,2 92,5 [µmoles.min -1 /gms] 4) Déterminez les paramètres cinétiques de la PEPC. Exercice 6 La β-galactosidase catalyse l hydrolyse de l Ortho-nitrophényl-β-D-galactoside (ONPG). En présence d ions Mg 2+, la constante de Michaelis de ce substrat est proche de 0,1 mm. On a déterminé également le K M en absence d ions Mg 2+. Pour cela, on a mesuré l hydrolyse de l ONPG à 373 nm. A cette longueur d onde, le coefficient d extinction molaire de l ONPG est égal à 350 M -1 cm -1 et celui de l Ortho-nitrophénol est égal à 2400 M -1 cm -1. Le tableau ci-dessous donne les vitesses initiales de la réaction : (ONPG) [mm] 0,138 0,220 0,291 0,560 0,766 1,46 Vi [_DO.min -1 ] 0,148 0,171 0,234 0,324 0,390 0,493 1) Déterminer la Vmax en M.min -1. L absence d ions Mg 2+ modifie-t-elle le K M? Exercice 7 La glucose oxydase d Aspergillus niger catalyse l oxydation du D-glucose par l oxygène moléculaire pour donner la D-glucono-γ-lactone et 2 O 2. Cette enzyme est inhibée par un dérivé du glucose, le D-glucal. On a étudié l effet inhibiteur du D-glucal vis-à-vis de chacun des substrats de la réaction. Les valeurs des vitesses initiales ont été divisées par la concentration d enzyme. Elles sont données dans le tableau en 10-3 s -1. Les Vi ont été déterminées pour différentes concentrations de D-glucose avec (O 2 ) = 0,27 mm : [D-glucose] (mm) [D-glucal] = 0 0,066 0,11 0,165 0,22 0,26 [D-glucal] = 79 mm 0,044 0,078 0,126 0,183 0,235 [D-glucal] = 113 mm 0,04 0,07 0,115 0,17 0,225 Les Vi ont été déterminées également pour différentes concentrations d oxygène avec (D-glucose) = 20 mm. [oxygène] (µm) [D-glucal] = 0 0,068 0,08 0,094 0,1 0,112 0,122 [D-glucal] = 110 mm 0,05 0,056 0,062 0,0645 0,07 0,073

5 5 1) Déterminer le type d inhibition du D-glucal par rapport au D-glucose et par rapport à l O 2. 2) Donner les valeurs des constantes d inhibition correspondantes. Exercice 8 On a isolé à partir de l organe électrique de la gymnote une acétylcholinestérase et on a voulu déterminer le nombre de site(s) actif(s) par enzyme. Pour cela, on a incubé l acétylcholinestérase à une concentration de 10 mg/ml avec des concentrations croissantes de DIFP puis on a mesuré le pourcentage d activité enzymatique restante. L acétylcholinestérase est inhibée irréversiblement par le diisopropyl-phosphoro-fluoridate (DIFP). Des expériences de compétition avec le substrat permettent de conclure que cet inhibiteur se fixe uniquement au site actif de l enzyme. (DIFP) [µm] 0 19,2 38,5 57, Activité restante [%] ) Calculer le nombre de site(s) actif(s) par molécule d acétylcholinestérase. La masse moléculaire de l enzyme est de 260 kda. Exercice 9 L acétylcholine estérase catalyse in vivo la transformation de l acétylcholine en présence d 2 0 selon la réaction suivante : C 3 COO - (C 2 ) 2 N + (C 3 ) O O(C 2 ) 2 N + (C 3 ) 3 + C 3 COO - L ésérine (ES) et le diisopropoylfluorophosphate (DFP) inhibent cette enzyme. On incube l enzyme en présence d inhibiteur puis on ajoute 10-4 M de substrat. On mesure ensuite le pourcentage d inhibition de l enzyme (calculé à partir des vitesses initiales en présence et en absence d inhibiteur). Durée d incubation (min) % d inhibition Esérine DFP Esérine + DFP On élimine alors les inhibiteurs (par quelle méthode?). Les pourcentages d inhibition sont alors respectivement de 2%, 69% et 5%. On mesure d autre part la vitesse initiale de la réaction pour des concentrations variables d acétylcholine et d ésérine : (ES) [mm] 0 0,2 0,4 0,6 (S) [mm] ) Quel est le type d action de ces deux inhibiteurs? Proposez un schéma résumant le

6 6 mécanisme global d action. 2) Calculez le K M et la constante d inhibition Ki vis-à-vis de ES. Que peut-on dire concernant la constante Ki(DFP). 3) Quelle hypothèse peut-on faire concernant la structure du site actif de l enzyme? On dispose d une solution partiellement purifiée d acétylcholine estérase. 4) Proposez une méthode permettant de mesurer la concentration en site actif en utilisant les réactifs suivants : ES, DFP et 33 P-DFP. Exercice 1 : Flux métaboliques Chez le colibacille cultivé en aérobiose dans un milieu contenant du glucose comme seule source de carbone et d'énergie et de l'ammoniaque comme seule source d'azote, le cycle de Krebs joue à la fois un rôle énergétique et anabolique. Dans ces conditions, le cycle peut-être représenté par le schéma ci-dessous, page 7. Dans les bactéries en croissance exponentielle, le cycle est en équilibre dynamique et l'on se propose de mesurer la vitesse à laquelle il fonctionne. Grâce à l'emploi de composés radioactifs, on trouve : - L'isocitrate est décarboxylé à la vitesse de 38 µmoles par minute et par gramme de bactéries. - Le glutamate est synthétisé à la vitesse de 15µmoles par minute et par gramme de bactéries. - L'aspartate est synthétisé à la vitesse de 22 µmoles par minute et par gramme de bactéries. 1) Quelles sont les vitesses de toutes les autres réactions (compléter le schéma en mettant un nombre dans chaque cercle vide)? 2) Sachant que le glucose est dégradé par la voie d'embden-meyerhof, quelle est la vitesse de consommation du glucose par le cycle? 3) Quelle fraction des atomes de carbone du glucose est oxydée en C0 2 et quelle fraction sert à synthétiser le glutamate et l'aspartate (exprimer les résultats en %). 4) Grâce à la phosphorylation oxydative, l'oxydation d'une mole de NAD permet la synthèse de 3 moles d'atp, et l'oxydation d'une mole de FAD 2 permet la synthèse de 2 moles d'atp. En supposant que tous les coenzymes réduits sont réoxydés par la chaîne respiratoire, quelle est la vitesse de synthèse de l'atp? 4.1) Lié au fonctionnement du cycle de Krebs seul 4.2) Lié au fonctionnement du métabolisme dans son ensemble (glycolyse + cycle de Krebs).

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8 8 Exercice 2 : Dégradation comparée du glucose en aérobie et anaérobie En utilisant la glycolyse (+ cycle de Krebs + chaîne respiratoire), certaines levures peuvent, dans des conditions ne permettant pas leur croissance, dégrader le glucose en éthanol (en anaérobiose), ou bien l'oxyder en C0 2 (aérobiose). On considèrera ici que le glucose ne sert qu'à fournir de l'énergie sous forme d' ATP et on se placera a une concentration de glucose = 0,l mole par litre de milieu. - En anaérobiose, ces levures produisent du C0 2 à une vitesse v 1 =4,48 µ1 CO 2 /mn/mg poids sec. - En aérobiose, elles consomment de l'oxygène à une vitesse v 2 =0,672 µ1 0 2 /mn/mg de poids sec. Dans ces deux situations, calculez : 1) Les vitesses de consommation du glucose en µmole/mn/mg de poids sec. 2) Les vitesses de synthèse d' ATP en µmole/mn/mg de poids sec. 3) Les quantités maxima d' ATP produites à partir d'un litre de milieu. On observe que 1g de muscle frais au repos contient 1,60 mg de glycogène et 1,40 mg d'acide lactique. Après contraction on trouve pour 1g de muscle 0,70 mg de glycogène et 2,40 mg d'acide lactique. 4) Montrer par quelle voie métabolique s'est opérée la transformation observée. 5) Calculez en µmoles la quantité d'atp formée. Exercice 3 : Régulation de la glycolyse 1) Donner le schéma de la glycolyse à partir du glucose 6P, en précisant le nom des enzymes (ne pas commenter). NB : On pourra au choix écrire les formules des intermédiaires ou donner leur nom. 2) Indiquer au(x) niveau(x) de quelle(s) enzyme(s) s'effectue la régulation. Quelle caractéristique énergétique présente(nt) le(s) chaînon(s) correspondant(s)? Expliquer pourquoi cette propriété se retrouve en général aux points de régulation du métabolisme. La régulation hormonale de la glycolyse dans le foie par le glucagon s'effectue en particulier au niveau de la pyruvate kinase (PK). 3) Décrire avec le maximum de précision possible 1'ensemble du mécanisme correspondant. L'insuline participe à la régulation du taux de glucose dans le foie. Son effet est contraire à celui du glucagon. 4) Quel est-il? Parmi les hypothèses faites pour interpréter le mécanisme d'action de l'insuline, on trouve les deux suivantes : - L'insuline active l'ampc phosphatase - L'insuline active la PK phosphatase 5) Montrez que l'une ou l'autre de ces deux hypothèses suffit pour expliquer l'influence de l'insuline sur l'activité PK. Les courbes suivantes montrent I'influence de l'état de phosphorylation sur I'activité PK en absence ou présence de fructose 1-6P 5 µm.

9 9 6) Commentez ces courbes. Quelle(s) courbe(s) faudrait-il tracer en complément de ce réseau? 7) En admettant que l'activité de la PK in vivo obéit a des lois cinétiques voisines de celles obtenues lors des mesures in vitro (courbes ci-dessus), comparer les activités que doit avoir la PK dans des cellules de foie en culture, si on ajoute au milieu : a) du glucose à concentration élevée b) du glucose à concentration faible c) du glucose à concentration très élevée et du glucagon d) du glucose à concentration faible et du glucagon NB : Les concentrations de F1-6P et de PEP in vivo sont de l'ordre de quelques µm. Dans l'expérience précédente, on ajoute au milieu de culture du glucose à une concentration de l'ordre de grandeur de celle que l'on trouve normalement dans le foie. On ajoute alors un inhibiteur de la glycéraldéhyde3p deshydrogénase. 8) Discuter l'activité PK dans ces conditions? Exercice 4 : CYCLE DU FRUCTOSE 6-POSPATE/FRUCTOSE 1,6 BISPOSPATE (d'après Leite et al., J. Biol. Chem. 1988, 263, 17527) Le cycle futile (ou cycle de substrat) Fructose 6-phosphate/Fructose 1,6-bisphosphate (F6P/F1,6P2) est étudié chez un insecte (bourdon) en fonction des conditions d'exercice musculaire et/ou de température externe. Les enzymes étudiées sont isolées du muscle thoracique (alaire) de ces insectes. Dans les expériences qui suivent, les vitesses initiales (Vi) sont exprimées en unités arbitraires. Etude de la phosphofructokinase (PFK). Cette enzyme, comme celles isolées d'autres sources, est un tétramère composé de 4 sousunités identiques de PM En absence de tout autre effecteur les K M de la PFK pour l'atp et le F6P sont de l'ordre de 40 µm dans les deux cas. La Fig. 1 représente les courbes Vi=f [F6P] en présence de concentrations variables d'atp et de fructose 2,6-bis-phosphate (F2,6P 2 ).

10 10 La Fig. 2 représente les courbes Vi=f [F6P] en présence de ATP 5mM et de concentrations variables de F2,6P 2 et d'amp. 1) Analysez les effets de l'atp, du F2-6P 2, et de l'amp. Utilisez ces différents résultats pour caractériser le comportement de la PFK de ces insectes. Sur ces critères, peut-on dire que cette PFK diffère qualitativement de celle des cellules hépatiques des mammifères? Effets de la contraction musculaire et de la température externe sur le cycle F6P/F1,6P 2. On étudie le contrôle du cycle F6P/F1, 6P 2 chez les bourdons maintenus au repos à 25 C au repos à 5 C, ou en vol à 25 C. On mesure d'abord les concentrations physiologiques intramusculaires (in vivo) du F2, 6P 2 et de l'amp dans les conditions de repos à 25 et 5 C, et de vol à 25 C (voir Tableau 1). On étudie alors in vitro les propriétés régulatrices de la PFK et de la fructose 1,6- bisphosphatase (F1,6P 2 ase) : - la Fig. 3 représente les Vi de phosphorylation du F6P par l'atp, en présence de la PFK, et de F2,6P 2 et d'amp. - la Fig. 4 représente les Vi d'hydrolyse du F1,6P 2 par la F1,6P 2 ase, en présence de Ca 2+ et de F2,6P 2. On ajoute enfin que chez les insectes la PFK est insensible aux effets du Ca 2+ et la F1,6P 2 ase est insensible aux effets de l'amp. 2) En utilisant les données du tableau 1 et de la Fig. 3 que peut-on dire des activités PFK in vivo, comparées au repos à 25, au repos à 5, ou en vol à 25 C? En vous basant plus particulièrement sur les résultats obtenus au repos à 5 et à 25, pouvezvous proposer une interprétation du rôle de la PFK dans la thermogenèse chez ces insectes. 3) A partir de la Fig. 4 interprétez les effets du Ca 2+ et du F2,6P 2 sur l'activité F1,6P 2 ase. Lors de la contraction musculaire, la concentration de Ca 2+ libre cytoplasmique (relargué du réticulum sarcoplasmique) peut atteindre M, alors qu'elle est de 10-7 M au repos. Comment cette variation peut-elle moduler l'activité F1,6P 2 ase et quel est le rôle du F2,6P 2 dans cette modulation? Quelle est la conséquence de la contraction musculaire sur le cycle F6P/F1,6P 2 et sur la thermogenèse liée à ce cycle? 4) Résumez l'ensemble de vos observations concernant la régulation du cycle F6P/F1,6P2 en fonction des conditions de températures et/ou d'activité musculaire, sous forme d'un schéma clair. TABLEAU 1 Conditions (F2,6P2), µm (AMP), mm Repos 25 C Repos 5 C Vol

11 11 Exercice 5 : ROLE DU FRUCTOSE 2,6 DIPOSPATE 1) Qu'appelle-t-on une réaction irréversible? Pourquoi la régulation du métabolisme concerne-t-elle souvent les réactions irréversibles? Le fructose 2,6 diphosphate (Fruc-2,6-P 2 ) active la phosphofructokinase et inhibe le fructose 1,6 diphosphatase des cellules de foie. 2) Expliquer pourquoi ce double effet du Fru-2,6P 2 résulte en une régulation coordonnée de la glycolyse et de la gluconéogenèse. 3) Rappeler brièvement le rôle et le mécanisme d'action de l'amp-3,'5'-cyclique (AMPc) dans les cellules de foie. L'addition de AMPc à un extrait brut de cellules de foie provoque une diminution forte de la concentration en Fru-2-6-P2. 4) Quel sens physiologique peut-on donner à cette observation? Imaginer un dosage enzymatique couplé permettant de mesurer l'activité d'une kinase par spectrophotométrie. 5) Quelles sont les précautions expérimentales à prendre pour que ce dosage soit correct.

12 12 Le Fru-2,6-P 2 est biosynthétisé à partir du Fru-6-P par un enzyme spécifique, la Fru-6-P 2 kinase. L'activité de la Fru-6-P 2 kinase purifiée est insensible à l'ampc, alors que cette même activité dans un extrait brut disparaît progressivement après addition de AMPc. 6) Quelles hypothèses peut-on faire sur le mécanisme par lequel l'ampc influence le niveau de Fru-2,6-P 2? Lorsqu'on ajoute de l'ampc à un extrait brut de cellules de foie, la disparition du Fru-2,6-P 2 se produit plus rapidement que l'inactivation de la Fru-6-P 2 kinase. 7) Que peut-on en conclure? A un extrait brut dialysé on ajoute du Fru-6-P et de l'atp marqué au 32 P, puis on incube jusqu'à ce que la concentration de Fru-2,6-P 2 devienne constante. On ajoute alors de l'ampc qui provoque la disparition du Fru-2,6-P 2 et l'inactivation de la Fru-6-P 2 kinase. On isole et on analyse l'ensemble des protéines présentes alors dans l'extrait brut. 8) Pourquoi fait-on cette expérience? Comment la réalise-t-on? Quel résultat attend-on d'après ce qui précède? On passe l'extrait brut traité comme au 8 sur une colonne de Fru-6-P insolubilisé. Une élution avec du Fru-2,6-P 2 ne permet d'obtenir qu'une seule protéine radioactive. Cette protéine radioactive, ajoutée à un extrait brut de cellules de foie, provoque une disparition rapide du Fru-2,6-P 2 mais sans inhiber l'activité de la Fru-6-P 2 kinase. 9) Quelle est cette protéine et quel est son rôle? L'expérimentateur est parti en week-end prolongé en oubliant cette protéine radioactive sur la table. A son retour, il constate que cette protéine ne provoque plus la disparition du Fru-2,6-P 2 dans un extrait brut, et qu'au contraire, elle augmente la concentration de Fru-2,6-P 2. 10) Quelles hypothèses peut-on alors faire sur le rôle de cette protéine? Quelles expériences peut-on suggérer pour vérifier ces hypothèses? 11) Résumer en quelques lignes et un schéma l'ensemble des conclusions que l'on peut tirer de ces expériences sur le rôle du Fru-2,6-P 2 dans le métabolisme des cellules de foie. Exercice 6 : Synthèse et dégradation du glycogène A) Description du métabolisme 1) Résumer par un schéma les étapes importantes de la synthèse et de la dégradation du glycogène sans traiter de la régulation. 2) Expliquer succinctement la raison pour laquelle les sites de stockages principaux du glycogène sont le foie et le muscle. La synthèse et la dégradation du glycogène se font par des voies partiellement différentes. Ceci illustre un principe général important dans la régulation du métabolisme. 3) Lequel? B) Régulation du métabolisme Rôle de la glycogène phosphorylase (GP) 1) Rappeler la réaction catalysée par la GP Le delta G ' de la réaction dans le sens de l'élongation du glycogène est de -2K.joules/mol. 2) Dans quels sens cette réaction est-elle déplacée dans les conditions standards? Peut-on, au vu de ce seul résultat, prévoir dans quel sens la réaction intervient in vivo?

13 13 In vivo le rapport [P]/[G 1P] est supérieur ou égal à ) Quel est le sens probable de la réaction dans ces conditions? La phosphorylase est dimérique. Son activité est régulée allostériquement par différents effecteurs. Cette enzyme existe sous forme phosphorylée ou non phosphorylée. Dans chacun de ses états (phosphorylé ou non phosphorylé), l'enzyme peut prendre une conformation la rendant active (forme R, relachée) ou inactive (forme T, tendue). On a mesuré l'activité des formes phosphorylées ou non phosphorylées de la phosphorylase en présence de concentrations croissantes d'amp ou de glucose et en présence ou non de différents effecteurs possibles de cette enzyme. Les résultats sont les suivants : 4) Sous quel état la phosphorylase est-elle la plus active? 5) Discuter l'effet du glucose-6p, de l'atp et de glucose-6p + ATP sur la forme non phosphorylée. 6) Rappeler l'expression de la charge énergétique d'un système. Une charge énergétique faible correspondra-t-elle globalement à une activation ou à une inhibition de la phosphorylase? Pourquoi? 7) L'effet de concentrations croissantes de glucose (figure 1C) vous parait-il cohérent avec le rôle naturel de la phosphorylase dans le système glycogenèse/glycogénolyse. 8) Complétez le schéma ci-dessous en précisant le rôle éventuel des composés suivants

14 14 comme substrats et comme modulateurs : ATP, ADP, AMP, glucose, G-6P. on mettra en évidence les rôles modulateurs par des flèches montrant le sens de déplacement des équilibres. 9) Quelle est la forme prépondérante de l'enzyme dans le muscle (par rapport aux 4 formes possibles T, R, TP, RP) dans chacune des conditions suivantes : a) au repos (en absence d'adrénaline) b) en activité (en absence d'adrénaline) c) sous stimulation par de l'adrénaline (l'adrénaline à le même effet sur l'activité de la phosphorylase du muscle que le glucagon sur celle du foie). Exercice 7 : Régulation intracellulaire de la synthèse des acides gras libres On rappelle que les acides gras sont synthétisés dans le cytosol à partir d'acétylcoa et que celui-ci est importé depuis la mitochondrie par l'intermédiaire du citrate. L'acétylCoA carboxylase (ACC) dite aussi malonylcoa synthase est une enzyme clé de ce métabolisme qui permet la synthèse du malonylcoa à partir d'acétylcoa et de CO 2. C3COSCoA + CO 2 Biotine COO - C2COSCoA ATP ADP + P 1) Qu'appelle t-on enzyme clé? On a vérifié in vitro que le palmitate est un inhibiteur allostérique de l'acc. 2) Comment appelle-t-on ce type de régulation? En donner un autre exemple. Le palmitate est également un modulateur du transporteur de citrate de la membrane mitochondriale. 3) Pensez-vous qu'il est activateur ou inhibiteur? Justifiez. On purifie de l'acc à partir d'un broyat de cellules hépatiques et on le soumet à une électrophorèse sur gel d'acrylamide dénaturant (figure 1). 4) Que peut-on en conclure?

15 15 Expérience 1 : On soumet l'extrait d'acc précédent à une chromatographie d'exclusion de gel et on mesure dans chaque fraction, l'activité totale (figure 2a), l'activité par mg de protéine récupérée (figure 2b). On sépare ainsi deux isoformes dites ACC1 et ACC2 de masses molaires respectives 10 7 et g/mol. 5) Indiquer le pic d'élution correspondant à chaque isoforme. 6) Quel est le nombre de sous-unités présentes dans les deux isoformes? 7) La transformation de l'acc1 en ACC2 correspond-elle à une activation ou une inhibition de l'enzyme? Expérience 2 : On effectue la même expérience en ajoutant à l'extrait, au tampon d'élution et au milieu de mesure de l'activité, du citrate 10 mm. On compare l'activité totale contenue dans chaque fraction à celle mesurée si on n'ajoute pas de citrate (figure 2c). On mesure alors l'activité par mg de protéine contenue dans la fraction d'activité maximum et on constate qu'elle est la même que dans l'expérience 1 (figure 2b).

16 16 Expérience 3 : On reprend alors l'expérience en ajoutant du citrate à l'extrait mais sans en introduire dans le tampon d'élution ni dans le milieu de dosage. Les courbes donnant l'activité totale et l'activité par mg de protéine sont alors les mêmes que dans l'expérience 1 (fig. 2a et 2b). 8) Quel est l'effet du citrate sur la structure et l'activité de l'acc. 9) Comment peut-on interpréter le résultat obtenu dans la dernière expérience? 10) Expliquer comment cet effet contribue à la régulation de la synthèse des glycérides à partir du glucose. Expérience 4 : On perfuse des foies de rat avec du phosphate marqué ( 32 P). On extrait l'acc et on sépare les deux formes de l'acc par chromatographie d'exclusion de gel en absence de citrate. On mesure la radioactivité incorporée dans l'acc1 et l'acc2. Les résultats sont les suivants : ACC1 : 5700 cpm/µg de protéine ACC2 : cpm/µg de protéine 11) Déterminer le nombre de moles de phosphate incorporées par sous-unité d'acc1 et d'acc2 sachant que la radioactivité spécifique du 32 P est de 3, cpm/µmole. Expérience 5 : On incube l'acc2 marqué au 32 P en présence de citrate 10 mm de façon à la transformer en ACC1 et on mesure la radioactivité spécifique : on constate qu'elle est toujours de cpm/µg de protéine. 12) Déduire de ces deux expériences la cause structurale de l'augmentation d'activité de l'acc1 par rapport à celle de l'acc2. Montrer qu'il existe en fait deux isoformes de l'acc1 d'activités identiques. On soumet un lot de rats, ayant préalablement eu une alimentation riche en glucose, à un jeûne d'une durée comprise entre 0 et 48 heures. Un deuxième lot est maintenu à jeun pendant 48 heures, puis alimenté en glucose pendant 24 heures. En fin de chaque traitement, on extrait l'acc des cellules hépatiques et on détermine, dans un milieu standard, son activité par mg ainsi que le nombre de phosphates incorporés par sous-unité (exprimé en %) (Figure 3).

17 17 13) Quelles conclusions peut-on tirer de cette expérience? On a extrait d'un broyat de cellules, une activité phosphatase dont on étudie l'action sur l'acc2. Pour cela on préincube pendant des temps variables, un mélange de la phosphatase et d'acc2 marqué sur ses phosphates et on mesure l'activité et le pourcentage de phosphate résiduel (figure 4). On traite alors par chromatographie d'exclusion de gel, l'acc2 initiale et l'extrait obtenu après 120 min. d'incubation : on constate que la fraction d'élution contenant le maximum d'activité est la 30ème pour l'acc2 initiale et la 15ème après traitement par la phosphatase (voir figure 2a). 14) Quelle conclusion peut-on tirer de cette expérience? 15) Proposer à partir de ces résultats un mécanisme de régulation de l'acc par un activateur X de l'activité phosphatase précédente et une autre activité constante que l'on précisera. Exercice 8 : Régulation hormonale de la synthèse des acides gras (Examen Juin 2000) I- Questions de cours a) Rappeler l influence du glucagon et de l insuline sur le taux de glucose sanguin. b) Préciser dans quel sens varient les activités des grandes voies métaboliques de transformation du glucose en fonction du taux de glucagon ou d insuline sanguins. c) Ces deux hormones contribuent également à la synthèse des acides gras. Préciser, en justifiant, quelles sont leurs influences respectives sur cette synthèse. II- Exercice On se propose d étudier le mécanisme de contrôle de l acétyl-coa carboxylase (ACC) par le glucagon. 1) Rappeler la réaction catalysée par cette enzyme. On extrait l ACC des foies d un lot de rats à jeun et des foies d un lot de rats ayant eu une alimentation riche en glucose. On en mesure les activités spécifiques : Rats à jeun : 1 U/mg Rats alimentés : 3,1 U/mg On traite dans un deuxième temps l enzyme par une phosphatase et on obtient les résultats suivants : Rats à jeun : 3,1 U/mg Rats alimentés : 3,1 U/mg 2) Quelle hypothèse peut-on faire sur le mécanisme de régulation de l ACC? On injecte du glucagon dans le sang de rats et on compare l activité spécifique de l ACC extraite du foie à celle extraite d un lot de rats témoins : Témoin : 3,2 U/mg + glucagon : 1,4 U/mg 3) Ce résultat est-il conforme à vos prédictions? 4) En tenant compte des résultats obtenus dans les expériences précédentes, indiquez quelle conséquence à dû avoir l injection de glucagon sur la structure de l ACC.

18 18 On fait l hypothèse que le mécanisme de régulation par le glucagon de l ACC est du même type que celui de la glycogène synthase. 5) Donnez dans les grandes lignes le mécanisme que vous prévoyez. Afin de vérifier l hypothèse faite ci-dessus, on prépare une culture d adipocytes. On ajoute de l AMPc au milieu de culture et on compare l activité spécifique de l ACC avant l ajout de l AMPc et 10 minutes après l ajout. Activité avant l ajout : 3,1 U/mg Activité après l ajout : 3,2 U/mg On reprend alors la même expérience en ajoutant du dibutyryl-ampc au lieu de l AMPc. Le dibutyryl-ampc est de l AMPc couplé à une chaîne carbonée hydrophobe. Sa structure est : (C 3 -C 2 -C 2 -C 2 -CO) 2 AMPc. Les résultats sont les suivants : Activité avant l ajout : 3,1 U/mg Activité après l ajout : 1,5 U/mg 6) Ce résultat confirme-t-il le mécanisme proposé? 7) Expliquez pourquoi l expérience a réussi avec le dibutyryl AMPc et pas avec l AMPc.

19 19 Etude de la β-galactosidase acide d Aspergillus Orzyae (E.C ) INTRODUCTION La β -galactosidase hydrolyse les oligosaccharides dont l'extrémité non-réductrice est constituée par un résidu galactose engagé dans une liaison glycosidique dans la configuration β (β-galactosides). L'enzyme n'hydrolyse pas les α-galactosides. En plus de la spécificité de liaison (α ou β), les galactosidases peuvent présenter une activité enzymatique à p acide ou basique. Exemple: lactose galactose + glucose Dans la réaction étudiée le substrat utilisé est l'orthonitrophényl-βd-galactoside (ONPG) qui est hydrolysé en orthonitrophénol (ONP) et D-galactose. L'orthonitrophénol présente une coloration jaune en milieu alcalin (pka 7,2). Le but du TP est de déterminer les constantes de Michaelis-Menten vis-à-vis du substrat synthétique l ONPG et d étudier l effet du galactose sur l activité de l enzyme. MATERIEL ET METODES Solutions : - Tampon acétate de Na, 0,02 M, p 4,5 contenant du Mg ++ à 10-3 M. La β-galactosidase est à utiliser à 0,335 U par ml de milieu réactionnel (le stock d enzyme est à 9 U/ml, 13,3 mg d enzyme ont été dilués dans 500 µl de tampon acétate p = 4,5). - ONPG à M dissout dans le dans le tampon acétate p = 4,5 - Galactose à 1 M dans 2 O. - Na 2 CO 3 à 1M dans 2 O, à conserver à température ambiante.

20 20 Matériel : - 1 bécher ou erlenmeyer de 50 ou 100 ml - 8 cuves de spectrophotomètre plus un portoir - 1 spectrophotomètre - 1 timer - 1 pissette d 2 O distillée - 1 poubelle pour solides - 1 poubelle pour liquides - 1 éprouvette de 25 ou 50 ml - 1 bac à glace - Des micropipettes : 1 P1000, 1 P200 et 1 P50 plus 1 bte de cônes bleus et 1 de cônes jaunes - 1 bac à glace - 3 bouteilles : 2 de 100 ml et 1 de 250 ml - 2 Eppendorf, l un avec le stock d enzyme, l autre avec le stock de galactose. Remarque: le stock de β-galactosidase est à conserver dans la glace. Protocole expérimental : le test se déroule en discontinu sur 7 min 1- Mettre dans un bécher/erlenmeyer 10 ml d ONPG (la solution doit être à température ambiante lors de la mesure). Uniquement pour l expérience II, ajouter le galactose. 2- Faites le blanc (zéro de DO) : prélever 1ml du bécher que vous placerez dans une cuve de spectrophotomètre, ajouter 0,5 ml de Na 2 CO 3 1M. Poser la cuve dans le spectrophotomètre et faites le zéro de DO à 420 nm. 3- Démarrer la réaction (déclencher le chronomètre) par ajout de 12,5 µl de stock de β- Galactosidase. Mélanger. 4- Prélever 1 ml de milieu réactionnel toutes les minutes et arrêter la réaction par ajoux de 0,5 ml de Na 2 CO 3 1M. Travailler dans les cuves de spectrophotomètre. 5- Mesurer l absorbance (ou DO) dans le visible à 420 nm. EXPERIENCES I- Détermination des constantes cinétiques de l'enzyme pour l ONPG 1) Faites les mesures en prenant la concentration de β-galactosidase que l enseignant vous indiquera et les concentrations suivantes de substrat : M M 1, M M et 0, M. 2) Tracez sur papier millimètré les représentations adéquates qui vous permettront de déterminer les constantes Vmax et K M. II- Effet du galactose sur l activité de l enzyme 1) Faites les mesures comme précédemment mais en présence de galactose. Les concentrations finales de galactose à utiliser sont les suivantes : 0,01 M et 0,006 M. 2) Déterminer le mécanisme d action du galactose et les constantes associées.

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