ANALYSE DE L ACIDE LACTIQUE DANS LES ŒUFS
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- Judith Goudreau
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1 Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire Laboratoire de Liège MET-LFSAL 085 ANALYSE DE L ACIDE LACTIQUE DANS LES ŒUFS Version 03 Date d application Rédaction par : Vérification par : Autorisation de publication par : Ir M. Evrard, Responsable technique Ing. M. Aubry, Responsable de la Qualité Ir P. Genot, Manager LFSAL Gestion et localisation de la version valide : Serveur M du laboratoire Destinataires : Membres du personnel de la section Analyses Spéciales Mots clefs : acide lactique ; œufs LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
2 Aperçu des modifications * Révision par/date Motif de la révision Partie du texte/portée de la révision Y.Bouamar/ M. Evrard/ Première version Nouveau template tout tout M.Evrard/ 23/11/2012 Ajout méthode de séchage sur balance dessicatrice *L écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans. Les modifications par rapport à la version précédente sont reprises en rouge. Si à cause de l ampleur des modifications, le texte n est plus lisible en utilisant les marquages, les adaptations ne sont pas marquées dans la nouvelle version. Cela est mentionné dans l historique du document. LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
3 ANALYSE DE L ACIDE LACTIQUE DANS LES ŒUFS TABLE DES MATIERES 1 OBJECTIF CHAMP D APPLICATION DOCUMENTS LEGAUX ET NORMATIFS DEFINITIONS ET ABREVIATIONS PRINCIPE CRITERES DE PERFORMANCE CONSIGNES DE SECURITE ET MESURES SPECIFIQUES REACTIFS ET ADDITIFS APPAREILLAGE METHODE Réception, stockage et distribution des échantillons Préparation des réactifs Solution de NaOH 1 N Solution de dopage d acide L-lactique Préparation de la solution de CARREZ II Analyse Extraction Lecture au spectrophotomètre Détermination du pourcentage de MS CONTROLE DE LA QUALITE Contrôle première ligne Contrôle deuxième ligne Contrôle troisième ligne CALCUL ET RAPPORTAGE Evaluation des mesures Quantification Expression des résultats REFERENCE AUX PROCEDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES Y AFFERENTS Procédures Formulaires Liste LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
4 ANALYSE DE L ACIDE LACTIQUE DANS LES ŒUFS 1 Objectif Cette méthode est destinée à identifier et à quantifier l acide lactique par spectrophotométrie. 2 Champ d application L acide lactique est utilisé dans l industrie alimentaire comme additif (E270) en tant qu antioxydant, acidifiant ou exhausteur de goût. L acide lactique se présente aussi sous forme de sels : sel de sodium (E325), de potassium (E326), et de calcium (327). Ces sels sont sous forme de poudre et sont également solubles dans l eau. L'acide lactique agit comme agent bactériostatique, notamment sur les bactéries pathogènes comme la salmonelle (ou la Listeria). L acide lactique est présent naturellement dans les aliments fermentés et est un indicateur d hygiène de certains produits (œufs, ) ; l acide lactique (E270) se présente sous forme liquide soluble dans l eau. 3 Documents légaux et normatifs Norme/Fil conducteur L-lactic acid, UV-method for the determination of L-lactic acid in foodstuffs and other materials (Boehringer Mannheim / R-Biopharm Enzymatic Bioanalysis / Food Analysis). Clauses Tout 4 Définitions et abréviations L-LDH = L-lactate deshydrogenase GTP = glutamate-pyruvate-transaminase NAD = nicoyinamide-adenine dinucleotide L-lactate = acide L-lactique 5 Principe Les échantillons d œufs liquides, conditionnés hermétiquement ou non, ainsi que les échantillons lyophilisés arrivent au laboratoire et sont distribués au sein de la section par les préparateurs. L échantillon d œuf est dilué dans une certaine quantité d eau déminéralisée. Les protéines sont précipitées par les solutions de CARREZ et centrifugées. Le surnageant est amené à ph 8-9 à l aide de NaOH 1N, amené à un volume final de 25 ml puis filtré sur papier filtre. LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
5 Le filtrat est mis en présence des différents réactifs du kit d analyse. Il s ensuit une mesure au spectrophotomètre. En présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD), l acide L-lactique (L-lactate) est oxydé en pyruvate par la L-lactate-déshydrogénase. (1) L-lactate + NAD L -LDH + + pyruyate + NADH + H L équilibre de la réaction se situe du côté du lactate. En faisant réagir le pyruvate du milieu réactionnel (réaction 2), catalysé par la glutamatepyruvate-transaminase.(gtp), en présence de L-glutamate, l équilibre de la la réaction 1 est déplacé en faveur du pyruvate + NADH (2) Pyruvate + L-glutamate GTP L-alanine + 2-oxoglutarate La formation de NADH, mesurée par l augmentation de l absorbance à la longueur d onde à 340 nm est proportionnelle à la quantité d acide L-lactique. 6 Critères de performance Se référer au dossier de validation. 7 Consignes de sécurité et mesures spécifiques Afin d'éviter toute contamination et intoxication, le port de gants est conseillé durant toute la manipulation. L'élimination des solvants et des solutions se fait dans les bidons prévus à cet effet en suivant les recommandations d usage au laboratoire. 8 Réactifs et additifs Sauf mention contraire, les solutions restent valables jusqu à ce que les critères de validité de l analyse soient respectés. Les réactifs sont de qualités «pour analyse». Les dates de validités des réactifs du kits sont respectées. Eau ultrapure Kit L-LACTIC acid (Boeringher Manheim/R-Biopharm) Solution de CARREZ I Pur d acide L-lactique en poudre (sigma Aldrich ou équivalent) N-octanol NaOH solide ZnSO 4 7H 2 O NaOH 1N Solution de CARREZ II LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
6 9 Appareillage Tubes Falcon de 50 ml Entonnoirs en verre Papier filtre Centrifugeuse PH-mètre Spectrophotomètre Cuvettes spectrophotométriques jetables Balance analytique Microbalance Balance dessicatrice Bain-marie à 100 C Micropipettes Minuterie Béchers 10 Méthode 10.1 Réception, stockage et distribution des échantillons Les échantillons sont réceptionnés, inscrits par les préparateurs du laboratoire pour être ensuite confiés à la section qui les stocke dans les enceintes ad hoc en fonction de la matrice (congélateur pour les liquides et frigo pour les solides) Préparation des réactifs Solution de NaOH 1 N Dans un ballon jaugé de 500 ml, peser 20,0 g de NaOH. Mettre au trait à l aide d eau ultrapure. Homogénéiser Solution de dopage d acide L-lactique Dans un ballon jaugé de 10 ml, peser sur une microbalance 20,0 mg d acide L- lactique. Mettre au trait à l aide d eau ultrapure. Cette solution sera diluée 10x directement avant ajout dans la cuvette. Homogénéiser Préparation de la solution de CARREZ II Dans un ballon Jaugé de 100 ml, peser 30,0 g de ZnSO 4. 7H 2 O Mettre au trait à l aide d eau ultrapure. Homogénéiser. LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
7 10.3 Analyse Extraction Dans un tube Falcon, peser environ exactement 1,0 g pour les échantillons solides et 5,0 g pour les échantillons liquides. Pour les échantillons de contrôle, doper avec environ 450 µl de la solution de dopage pour les échantillons solides et liquides. Ajouter 2 gouttes de n-octanol. Ajouter 10 ml d eau ultrapure pour les liquides et 12 ml pour les solides. Passer au vortex. Chauffer au bain-marie aux environs de 100 C pendant 15 minutes et secouer très énergiquement toutes les 2 minutes environ pour éviter toute coagulation. Laisser les tubes revenir à température ambiante au besoin dans l eau froide. Ajouter 1.3 ml de solution CARREZ I Passer au vortex et secouer très énergiquement afin que l échantillon reste liquide. Ajouter 1 ml de la solution de CARREZ II. Passer au vortex et secouer très énergiquement afin que l échantillon reste liquide. Pour les échantillons liquides : - mettre au volume (25 ml) avec NaOH 0.1 N (obtenu par dilution 10 x du NaOH 1N - secouer très énergiquement afin que l échantillon reste liquide - centrifuger 10 minutes à 4000 tours/minutes - filtrer sur papier filtre et récolter le filtrat clair dans un tube falcon - utiliser 250 µl pour la lecture au spectrophotomètre Pour les échantillons solides : - ajuster à ph 8-9 avec NaOH 1 N - mettre au volume (25 ml) à l eau ultrapure (R293) - secouer très énergiquement afin que l échantillon reste liquide - centrifuger 10 minutes à 4000 tours/minutes - filtrer sur papier filtre et récolter le filtrat clair dans un tube falcon - utiliser 250 µl pour la lecture au spectrophotomètre LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
8 Lecture au spectrophotomètre Dans une cuvette spectrophotométrique, avec les réactifs du kit, procéder comme suit : BLANC CONTROLE ECHANTILLON Solution µl 1000 µl 1000 µl Solution µl 200 µl 200 µl Solution 3 20 µl 20 µl 20 µl Solution échantillon 250 µl Eau ultrapure 1000 µl 900 µl 750 µl Solution de dopage (diluée 10 X avant ajout cuvette) 100 µl Homogénéiser en couvrant la cuvette de parafilm ou d une tigette. Lire l'absorbance mesurée (A 1 ) après 5 minutes. Démarrer la réaction par addition de : Solution 4 20 µl 20 µl 20 µl Homogénéiser. Lire les absorbances des solutions approximativement 30 minutes après l ajout de la solution 4 (A 2 ). Tous les réactifs ne devant plus être utilisés doivent être conservés au frigo même durant l analyse Détermination du pourcentage de MS Œufs en poudre o Ouvrir le couvercle de la balance et charger le programme P1 o Tarer une coupelle jetable en aluminium o Effectuer une prise d essai de 3,0 g ± 0, 1 g d échantillon avec une spatule jetable en plastique et la répartir uniformément dans la coupelle o La température de travail est 100 C (programme P1) o Fermer le couvercle o La mesure démarre et s arrête automatiquement à poids constant et indique directement le % de matière sèche Œufs liquides o Ouvrir le couvercle de la balance et charger le programme P4 o Tarer une coupelle jetable en aluminium avec un filtre anhydre (conservé sous cloche dessicatrice) o Effectuer une prise d essai de 3,0 g ± 0, 1 g d échantillon avec une pipette pasteur jetable et répartir le liquide uniformément sur le filtre dans la coupelle o La température de travail est 105 C (programme P4) o Fermer le couvercle o La mesure démarre et s arrête automatiquement à poids constant et indique directement le % de matière sèche LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
9 11 Contrôle de la qualité 11.1 Contrôle première ligne Dans chaque séquence d analyse, un échantillon dopé (échantillon fortifié en acide lactique), par type de matrice, au niveau de la norme de contrôle (1000 mg/kg MS) est ajouté à la séquence. Il n y a pas de correction du résultat rendu au LIMS sur le rendement qui doit-être de minimum 70 % et maximum 110 %. Si la valeur mesurée corrigée ainsi que non corrigée sur le rendement du dopé dépasse la norme admise, l essai doit-être reconduit. Les résultats indépendants sont moyennés si ils sont inférieurs à la reproductibilité intra laboratoire Contrôle deuxième ligne Echantillon en aveugle Contrôle troisième ligne Si les circuits existent, le laboratoire sera inscrit aux différents tests interlaboratoires. 12 Calcul et rapportage 12.1 Evaluation des mesures Les données brutes (les pesées, les différentes absorbances observées, la date, le pourcentage en matière sèche, ) sont reprises sur les formulaires LAB23 F543 AS25 (feuille de calcul acide lactique.xls) et LAB23 F543 AS11 (fiche de travail acide lactique) 12.2 Quantification V MW C = ΔA(g/l) E d v 1000 Α = ( Α 2 Α 1 ) échantillon ( Α 2 Α 1 ) blanc où : V = volume final (ml) v = volume de l échantillon (ml) MW = masse moléculaire (g / mol) D = distance parcourue par le faisceau lumineux à travers la cuvette (cm) Ε = coefficient d extinction du NADH à 340 nm = 6,3 (l x mmol -1 x cm -1 ) Il s ensuit que pour l acide L-lactique : 2, C = A = (g d'acide L-lactique/l de solution) 6,3 1,00 0, Le résultat exprimé par en mg d acide L-lactique par kg de matière sèche d échantillon sera : LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
10 12.3 Expression des résultats Les résultats sont exprimés en mg/kg de matière sèche ce qui implique que la teneur en humidité de l échantillon doit être connue donc, que cette analyse doit être réalisée en parallèle (cf ) 13 Référence aux procédures, instructions, documents, formulaires ou listes y afférents 13.1 Procédures Pas d'application 13.2 Formulaires LAB23 F543 AS25 (feuille de calcul acide lactique.xls) LAB23 F543 AS11 (fiche de travail acide lactique) 13.3 Liste LAB L : Liste des incertitudes de mesure section Analyses Spéciales LAB 23 I-MET-LFSAL-085-Acide lact. dans oeufs- v /10
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