Les IM : Etude épidémiologique, biochimique et étiologique d une cohorte de 214cas.

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1 Introduction Historique-Définition 1

2 Les immunoglobinopathies monoclonales (IM), improprement appelées gammapathies monoclonales (GM) regroupent des pathologies diverses pouvant relever d étiologies malignes ou bénignes. Il faut remonter au XIX e siècle pour voir apparaître les premières notions d IM avec la description par le docteur S. Solly du premier cas du myélome en Ce n est qu en 1889 que le docteur Otto Kahler en fait une description clinique détaillée et lui donne le nom éponyme de maladie de Kahler. Parallèlement, le Dr. Henry Bence Jones met en évidence en 1848, une protéine anormale dans les urines d un patient atteint de myélome [1]. Plus tard, en 1944, le Dr. Jean Gösta Waldenström décrit une nouvelle maladie caractérisée par la sécrétion d une protéine anormale, la macroglobulinémie ou maladie de Waldenström (MGW). En 1964, Jean Waldenström sera le premier, à préciser le classement nosologique des IM et à attirer l attention sur des cas où celles-ci ne sont pas liées à un syndrome immunoprolifératif malin [2]. Ce concept d IM «bénigne» sera transformé par Kyle en gammapathie monoclonale de signification indéterminée (MGUS) du fait de l observation des cas de transformation maligne au cours de la surveillance [3]. Les immunoglobulines monoclonales (Igm), constituent une population homogène d immunoglobulines identiques entre elles, présentes dans le sang et/ou les urines et témoignant de l expansion non contrôlée d un clone lymphocytaire B (lymphoplasmocytes ou plasmocytes). Elles se caractérisent par une seule classe de chaîne lourde (γ, α, μ, δ, ε) et un seul type de chaîne légère (κ ou λ). L Igm peut être parfois incomplète représentée seulement par sa chaîne lourde ou légère [4]. 2

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4 De nombreux contextes physiopathologiques peuvent conduire à l apparition d une Igm avec des conséquences variables au niveau de l expression clinique et de l évolution. De nos jours, la prévalence des IM est importante. L augmentation de leur détection depuis deux décennies n est toutefois pas univoque. Elle a une explication évidente, liée au vieillissement de la population, à la systématisation de l électrophorèse des protéines sériques et à l amélioration des techniques du diagnostic biologique en termes de rapidité, de fiabilité, de sensibilité et de facilité d interprétation pour le biologiste [5]. Le caractère monoclonal de l Ig n est pas synonyme de malignité certaine [6]. Une enquête étiologique semble donc indispensable. La biologie et plus particulièrement la biochimie tient un rôle majeur dans le dépistage et le diagnostic de ce type de pathologie. En effet les différentes techniques électrophorétiques utilisées représentent un outil important dans la mise en évidence mais également dans le typage de l Igm. Depuis l an 2000, le laboratoire de biochimie de l HMIMV de Rabat répertorie les cas d IM révélés à l EPP sérique. Dans ce travail, nous nous proposons donc d exploiter dans ce contexte l ensemble des données biochimiques disponibles afin d établir des profils de répartition d une cohorte de 214 cas d IM diagnostiqués sur une période de 9 ans et d étudier leurs caractéristiques épidémiologiques et étiologiques. Cette thèse s articulera donc selon 2 axes principaux : Une première partie consacrée à une revue de la littérature et une seconde partie présentant notre manœuvre pratique, ainsi que les résultats que nous discuterons à la lumière des données bibliographiques avant de conclure. 4

5 Partie théorique: Revue de littérature 5

6 I. LES IMMUNOGLOBULINES PHYSIOLOGIQUES: RAPPEL A. Généralités et définition Le terme d immunoglobuline (Ig) a été proposé la première fois par HEREMAS. Les Ig sont des glycoprotéines complexes de masse moléculaire très élevée, présentes essentiellement, soit à la surface des lymphocytes B (immunoglobulines de membrane), soit dans le milieu intérieur (immunoglobulines circulantes), soit dans certaines secrétions externes (immunoglobulines sécrétoires). Elles sont dénommées anticorps en raison de leur fonction essentielle de liaison aux antigènes [7, 8]. Ces molécules sont caractérisées par un certains nombres de propriétés: Dualité fonctionnelle : Les Ig sont des molécules bipolaires qui présentent 2 pôles fonctionnels : régions variables, impliquées dans les fonctions de reconnaissance de l Ag (Fab) et régions constantes (Fc), responsables des fonctions effectrices, Dualité structurale : Les Ig sont constituées par deux types de chaînes légères et lourdes, Hétérogénéité : Les Ig humaines sont utilisées comme immunogènes, ce qui a permis de définir les différentes spécificités antigéniques qu on peut classer en trois types : Spécificité isotypique : Uniforme pour tous les individus d une même espèce, elle définit les catégories (classes, sous classe, types) des Ig. Chez l homme, appartiennent à ce type de spécificité les cinq classes principales d Ig 6

7 (G, A, M, D et E), ainsi que les sous classes de chaînes lourdes (G1 à G4, A1/A2) et les types de chaines légères (κ et λ). Spécificité allotypique: Elle correspond au polymorphisme génétique existant entre les différents individus d une même espèce. Spécificité idiotypique : Elle est liée à l'hyper variabilité du site de liaison à l'antigène. Cette variation est propre à chaque clone de lymphocyte B [7,9]. B. Structure [8, 9, 10]. Malgré leur très grande diversité, les Ig se sont rapidement révélées être toutes faites selon le même modèle par des chaînes lourdes ou Heavy (CH) et légères ou Light (CL), comprenant des domaines variables V et constants C et assemblées de manière monomérique ou polymérique. Le modèle le plus général des Ig est celui de l IgG, décrit ci-après : - Chaque molécule d Ig est composée de quatre chaînes polypeptidiques identiques deux à deux : 2 chaînes légères (CL) et 2 chaînes lourdes (CH), reliées entre elles par des ponts disulfures dits inter caténaires dont la réduction n altère généralement ni l organisation de la molécule ni son activité. - Il existe aussi des ponts disulfures internes à chaque chaîne dits intracaténaires et qui sont difficiles à réduire mais essentiels au reploiement et à l activité des Ig, ils stabilisent les structures tertiaires. La figure 1 illustre le modèle décrit. 7

8 Figure 1 : Schéma illustrant la structure d une Ig complète [8]. Les chaînes lourdes définissent la classe et la sous classe d Ig. Les chaînes µ, δ, α et ε correspondent respectivement aux classes des Ig M, G, A et E. Les chaînes γ 1, γ2, γ3, γ4 correspondent aux sous-classes des IgG. Alors que les chaînes légères définissent dans chaque classe 2 types d Ig κ et λ. Les domaines entrant dans la formation des chaînes des immunoglobulines ne sont que des séquences de 110 acides aminés environ de longueur. Et selon la nature de ces séquences, on distingue les domaines constants et les domaines variables pour chaque chaîne d Ig. Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant (CL) et d'un domaine variable (VL). 8

9 Les chaînes lourdes sont composées d'un fragment variable (VH) et de 3 ou 4 fragments constants CH1, CH2, CH3 et CH4 selon l'isotype. C. Synthèse Les Ig sont synthétisées et secrétées par des plasmocytes résultant de la maturation des lymphocytes B. La présentation de l Ag, la coopérativité des cellules T et B sous l action des cytokines font que les lymphocytes B s activent, se différencient, prolifèrent et produisent des anticorps ou des immunoglobulines, dirigés contre les différentes épitopes de l Ag [9, 10]. D. Fonctions [7] Elles sont très nombreuses, on cite quelques unes : Reconnaissance de l Ag, Fixation et activation du complément, Propriétés cytophylitiques : opsonisation, Neutralisation, Agglutination et précipitation, Autres fonctions particulières à la classe d Ig : - IgG (70 à 75 % d Ig sériques) : constituant principal au cours de la réponse immunitaire secondaire. - IgM (10 % d Ig sériques) : première classe d Ig produite au cours de la réponse immunitaire primaire, - IgA (15 à 20 % d Ig sériques) : protection des muqueuses, - IgD (<1 % d Ig sériques) : différenciation des lymphocytes B après activation, - IgE (<0.1% d Ig sériques) : action antiparasitaire et antiallergique. 9

10 I. IMMUNOGLOBULINE MONOCLONALE (Igm) A. Définition et caractéristiques Il s agit d une Ig de structure le plus souvent normale mais en quantité augmentée par rapport à l état physiologique [11]. Elle peut être : Complète, le plus souvent de classe G, A, M et rarement D ou E. Ou incomplète sous forme de fragments d Ig : Chaînes légères (souvent appelées dans les urines protéine de Bence-Jones) ou chaînes lourdes [12,4]. A la différence des Ig physiologiques, les Ig monoclonales sont synthétisées par un seul clone de cellules B malignes ou hyper stimulées, ce qui leur confère un caractère homogène. L homogénéité des Igm est reflétée par les critères suivants [4,13]: L identité de charge électrique Les molécules d Igm ayant la même structure primaire, la même séquence d acide aminé, leur charge électrique globale est donc équivalente. Il en résulte une mobilité électrophorétique homogène, objectivée par une bande étroite sur le support de migration ou un pic étroit sur le tracé. Ce pic les différencie des augmentations polyclonales d Ig qui migrent selon une bande large. Il est très souvent retrouvé dans la zone des gammaglobulines en cas de mobilité anodique, il peut se trouver superposé à d autres protéines (zone α1 voir α2 plus rarement). Ce pic peut être discret voir absent lorsque le composant monoclonal a un poids moléculaire suffisamment faible pour franchir le filtre glomérulaire (CLL). 10

11 L identité structurale La population d Igm ne possède qu un seul type de chaîne lourde et un seul type de chaîne légère. Cette identité structurale sera d ailleurs à la base du typage immunochimique par les techniques d immunoélectrophorèse ou d immunofixation. L identité immunologique L ensemble des Igm ont les mêmes déterminants iso-, allo- et idiotypiques. Elles possèdent donc la même activité anticorps, mais celle-ci n est que très rarement recherchée. B. Etapes d identification biochimique La recherche et la caractérisation d une Igm, dans le sérum et les urines des patients est une étape essentielle du diagnostic et du suivi évolutif des IM. 1- Lesquelles? Au laboratoire de biologie, l exploration d une Igm comporte trois volets principaux : le diagnostic, l évaluation du retentissement et le pronostic. Le diagnostic biologique de l Igm comporte les étapes suivantes : - L exploration protéinologique, visant à détecter et à caractériser l Ig. elle repose sur une panoplie de techniques réalisées concomitamment dans le sang et dans les urines. L analyse du sérum comporte une détermination du taux de protides sériques associée à la réalisation d une électrophorèse, une IF(ou IS) pour typer le composant monoclonal, un dosage des Ig sériques (permettant d évoquer parfois la classe de l Ig en cause) et en fin la recherche d une éventuelle cryoglobuline. 11

12 L analyse simultanée des urines bien souvent négligée quoiqu essentielle, associe à la recherche et au dosage de la protéinurie, la réalisation de l électrophorèse pour détecter une éventuelle PBJ et une IF en vue de déterminer la nature de celle-ci et celle de l Igm si elle est présente dans l urine. - La confirmation du diagnostic biologique, apportée par le myélogramme et/ou la BOM. Quand à l évaluation du retentissement et du pronostic de l Igm, elle se fait par la pratique d examens complémentaires sanguins et urinaires. Il est à préciser que les renseignements cliniques sont importants à connaître par le biologiste, pour que ce dernier puisse orienter les différentes explorations biologiques. Cela est d autant plus vrai lorsque les anomalies biologiques sont peu évidentes (cas de MCL). A côté de cela, le laboratoire joue un rôle indéniable dans la surveillance de ce type de pathologie par la réitération périodique de certaines analyses comme l EPP et le dosage pondéral. Il permet, en effet, le suivi de l efficacité du traitement au cours des IMM et la surveillance des MGUS. 2- Diagnostic biologique : exploration protéinologique 2.1. La phase pré-analytique Elle concerne toutes les étapes depuis le prélèvement jusqu au démarrage de l analyse proprement dite. C est une étape cruciale, car elle peut influencer les résultats. 12

13 Prélèvement sanguin L étude d une Igm se fait impérativement sur un échantillon de sérum, soit un prélèvement réalisé sur tube sec. En effet, le fibrinogène présent dans le plasma peut simuler un pic monoclonal situé entre les zones β et γ globulines, à l origine de résultats faussement positifs. Le prélèvement est réalisé par ponction veineuse sur tube sans gel séparateur (les microgels interfèrent dans la réaction Ag-Ac). Le patient doit être à jeun depuis 12h, les sérums troubles peuvent être à l origine d une fausse interprétation des résultats (cryoglobulines faussement positives). Les prélèvements sont à conserver, à +4 o c lorsque l analyse est différée pour une durée maximum d une semaine [4,14]. L étude correcte d une cryoglobuline, ne peut être envisagée que si l on dispose d un prélèvement de sang réalisé dans des conditions strictes de prélèvement et de transport. Les cryoglobulines ont une amplitude thermique de précipitation qui varie de +11 à +37 C, il faut donc impérativement éviter cette précipitation tant que le sérum n est pas décanté, sous peine de perdre le cryoprécipité par absorption dans le caillot. C est pour cette raison que le prélèvement sanguin doit être maintenu à +37 C dés l instant de la ponction veineuse jusqu à la séparation complète du sérum. Les spécimens sont immédiatement placés dans un pot pour centrifugeuse préalablement réchauffé à + 37 C et couvert de coton cardé. Après centrifugation à + 37 C, 3000 tours/mn pendant 10 minutes, les sérums sont placés au réfrigérateur à + 4 C et seront observés chaque jour pendant une semaine [15,16]. 13

14 Recueil urinaire L envoi au laboratoire d un échantillon d urine issue d une miction ou de préférence d un recueil de 24h (impérativement accompagné de valeur de la diurèse) devrait être systématique. Les urines sont collectées de préférence sur un antiseptique (azide de sodium ou cristal de thymol) afin d éviter l altération des protéines par prolifération bactérienne. Par ailleurs l existence d une hématurie peut entrainer une majoration importante de la protéinurie [17] La phase analytique et post-analytique Dosage des protéines totales sériques et urinaires Ces examens de base non spécifiques, peuvent malgré tout, évoquer l existence d une IM en cas d hyperprotidémie importante voire même d une hypoprotidémie, ou lors d une protéinurie significative en l absence de maladie rénale connue. De plus, ils sont indispensables à l interprétation quantitative de l électrophorèse. Technique : La méthode de dosage de la protidémie actuellement recommandée, fait partie du groupe des méthodes chimiques basées sur une réaction avec la liaison peptidique, il s agit de la technique au Biuret. Son principe repose sur la propriété de Biuret de donner avec les solutions alcalines de cuivre une coloration rose rouge. La réaction est fournie par la condensation des ions cuivriques avec les liaisons peptidiques des protéines qui s ionisent en milieu 14

15 alcalin. Les atomes d azote de la chaîne peptidique, forment de liaisons de coordination avec le cuivre. La réaction développe une coloration rose qui, en présence du réactif cuivrique bleu, conduit finalement à la coloration violette du milieu réactionnel dont l intensité peut être mesurée par spectrophotométrie d absorbance moléculaire à nm [18]. De nombreux réactifs mettent à profit le principe réactionnel du Biuret, le plus utilisé est le réactif de Gornall. En ce qui concerne la réaction et le dosage d une éventuelle protéinurie, le biologiste doit être averti que les méthodes de détection par bandelette, basées sur la réaction protéine/colorant sont surtout sensibles à l albumine mais sousestiment les chaînes légères d Ig dont la détection sera inconstante et donc responsable de faux négatifs. La méthode de dosage recommandée par la société française de biologie clinique (SFBC) est la technique au rouge de pyrogallol. Elle présente l avantage d être automatisable, d avoir une bonne sensibilité, une bonne praticabilité, une bonne répétabilité et une reproductibilité acceptable. Le rouge de pyrogallol forme, en présence de molybdate en milieu acide, un complexe bleu photométrable à 600 nm [4]. Résultat : La protidémie normale chez l adulte est de 62 à 85g/l. Chez le sujet adulte sain, il existe une protéinurie physiologique <0.15g/24h, non détectable par les méthodes habituelles de recherche et de dosage [4]. Limites du dosage de la protidémie et de la protéinurie : 15

16 L albumine et les globulines ont une réponse variable au biuret selon la technique utilisée (cinétique ou point final). Cette différence est encore augmentée s il existe une Igm. L erreur analytique est alors proportionnelle à son taux et le résultat de la protidémie peut varier de plus d une dizaine de grammes lorsqu elle est dosée sur deux appareils utilisant des méthodologies très différentes. La PBJ est fréquemment prise en défaut par les bandelettes réactives et certaines méthodes de dosage n utilisant pas une réaction de type colorimétrique comme le rouge de pyrogallol ou le bleu de Coomassie. C est ainsi le cas des méthodes turbidimétriques utilisant l acide sulfosalicylique ou l acide trichloracétique qui sous-estiment les globulines et peuvent ne pas détecter des chaînes légères libres présentes en faible concentration dans une urine [4] L électrophorèse du sérum et des urines Principe Il s agit d une analyse peu onéreuse, simple, actuellement totalement automatisée, très utilisée en biologie clinique pour séparer les différentes fractions protéiques contenues dans un milieu complexe comme le sérum ou les urines. Introduite en 1930, comme technique de séparation, par le chimiste suédois Arne Tiselius lors de l étude des protéines du sérum [19,20], elle représente l examen de première intension, demandé dans l exploration d une anomalie monoclonale. L électrophorèse est un phénomène physique qui désigne le déplacement d ions ou de particules chargées en suspension ou en solution sous l influence d un champ électrique. Elle repose sur le principe suivant: Les protéines 16

17 sériques ou urinaires sont séparées en fonction de leur mobilité électrophorétique dans un tampon alcalin de faible molarité sous l effet d un champ électrique. En solution, les protéines acquièrent une charge électrique et sous l effet d un champ électrique, elles se déplacent dans un sens déterminé. Le sens de leur migration dépend du ph de la solution étudiée et du ph isoélectrique des protéines. En effet, la mobilité des protéines est principalement déterminée par leur charge nette, très peu par leur taille, car les supports utilisés (acétate de cellulose ou agarose) exercent très peu l effet de tamisage moléculaire [13, 21] Electrophorèse sérique Techniques Les techniques électro phorétiques utilisées ont connu une évolution considérable au fil du temps, en terme de support, rapidité et sensibilité d où l existence de nombreuses méthodes pour la réalisation de cet examen. Le laboratoire de biochimie de l HMIMV a connu ce type d évolution durant la période d étude puisqu il est passé de l utilisation de l acétate de cellulose en manuel, au gel d agarose sur automate puis enfin au capillaire. Nous allons essayer de décrire ces différentes méthodes. Techniques sur acétate de cellulose La technique manuelle fait appel à un matériel simple ; une cuve de migration dans laquelle est introduite la bande d acétate de cellulose. Le rouge ponceau va fixer les protéines séparées et les colorer en fonction de leur concentration. Après ce traitement (fixation, coloration lavage ) les bandes peuvent être analysées qualitativement par un examen visuel ou 17

18 quantitativement par une intégration densitométrique afin d obtenir un tracé électrophorétique [22] (figure 2). 18

19 Pic monoclonal en β Bande etroite en β Bande d acétate de cellulose (1) Proteinogramme après lecture densitométrique Figure 2 : Résultat d une EPP réalisée sur acétate de cellulose (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv). Technique sur gel d agarose Le gel d agarose (figure3) nécessite une fixation préalable des protéines ainsi qu une déshydratation du gel, avant la coloration par «l amidoschwartz» permettant une meilleure résolution [19,22]. Cette technique est réalisée sur l automate Hydrasys de chez Sébia, où la lecture densitométrique peut fournir un tracé caractérisé par une individualisation des fractions β 1 et β 2, 19

20 Figure 3:Résultat de la migration des protéines sériques sur gel d agarose /Hydragel protéine 30 patients (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv) Figure 4 : Protidogramme illustrant l intégration densitométrique du cas n 27 sur le gel d agarose (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv) 20

21 Electrophorèse capillaire L électrophorèse capillaire (EC) est une technique analytique d introduction relativement récente, considérée aujourd hui comme une méthode de séparation analytique très performante, rapide, plus reproductible et plus résolutive par rapport à l EP en gel d agarose. Cette technique utilise des capillaires étroits (diamètre interne de 10 à 200µm). Dans le laboratoire de biochimie de l HMIMV, l EC est réalisée sur le Capillarys (Sebia). Il s agit d un automate multicapillaire (8 capillaires) de deuxième génération, avec une complète automatisation (identification code barre) qui permet une analyse rapide et sécurisée. Le principe général de l EC repose sur la migration des espèces en solution, porteuses d une charge électrique globale, soumises à l effet d un champ électrique, et au contact d un support approprié. La mise en œuvre consiste à utiliser un tube capillaire ouvert à ses extrémités, en verre de silice de très faible diamètre (15 à 150 μm). Ce capillaire, d une longueur L variant entre 20 et 80 cm, est rempli de la même solution aqueuse d électrolyte tampon que les deux réservoirs situés de part et d autre. On applique aux électrodes une différence de potentiel pouvant atteindre 30 kv. L intensité ne doit pas dépasser 100 μa (soit une puissance dissipée d environ 3 W maximum), pour éviter l échauffement du capillaire qu il est préférable néanmoins de placer dans une enceinte thermostatée. Les espèces, qu elles soient chargées positivement ou négativement, migrent en général vers la cathode. Un système de détection est placé avant l extrémité avale du capillaire. En mode UV par exemple, le capillaire coupe le trajet 21

22 optique entre la source et le photomultiplicateur, ce qui permet de mesurer l absorbance de la solution en évitant tout volume mort. Il en est de même pour la détection électrochimique. De minuscules électrodes sont, dans ce cas, insérées dans le capillaire. La séparation repose donc sur 2 phénomènes [23]: La différence de mobilité éléctrophorétique entre les analytes à séparer, ce qui se traduit par des vitesses de migration différentes dans le tampon d électrophorèse à l intérieur du capillaire, Le courant d électroendosmose qui est plus important, il permet dans la même manipulation de séparer à la fois les anions et les cations. Dans ces conditions les protéines, chargées négativement, migrent de l anode vers la cathode. La figure 5 présente un schéma illustrant ce principe 22

23 Figure 5:Schéma illustrant le principe de séparation des particules en EC [21]. Un logiciel permet la reconstitution des courbes sous forme de protéinogramme [24]. Cette méthode présente de nombreux avantages en comparaison des électrophorèses réalisées sur gel. Tout d abord, c est une technique complètement automatisée qui fonctionne en vase clos, du prélèvement de l échantillon jusqu à l émission du tracé électrophorétique [25]. Ensuite, c est un système rapide effectuant 100 tests à l heure avec la possibilité d une alimentation en continu des échantillons. Le système de lecture par code barre permet, en outre, de diminuer les erreurs d identification des tubes. Enfin la résolution des pics est améliorée, tout comme la sensibilité (0.20g/l), ce qui affine nettement la détection des composés monoclonaux [26]. Un exemple de tracé électrophorétique obtenu sur le Capillarys (EC) au laboratoire de Biochimie de l'hmimv est illustré par la figure 6. 23

24 Figure 6: Exemple de tracé électrophorétique obtenu sur Capillarys (EC), (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv). Résultat Les résultats de cet examen sont présentés sous deux formes : - Un graphique, résultat de l intégration par densitométrie de la bande électrophorétique ; - Des valeurs chiffrées, pour chacune des fractions en pourcentage et en concentration g/l calculée à partir de la protidémie totale. Selon le support utilisé, 5 à 6 fractions sont alors bien individualisées : La fraction albumine biochimiquement homogène, la plus importante des protéines sériques et 4 groupes de globulines de migration α1, α2, β et γ globulines. 24

25 Figure 7 : Tracé électrophorétique illustrant les différentes fractions protéiques après intégration densitométrique [27]. Normes des fractions protéiques dans le sérum : Fractions % g/l - Albumine α 1 -globulines α 2 -globulines β-globulines γ-globulines L interprétation rigoureuse d une électrophorèse oblige à considérer simultanément la migration électrophorétique sur gel, la courbe obtenue sur le densitomètre et le résultat chiffré en g/l ou en pourcentage [21]. 25

26 Pièges Les principaux pièges de l électrophorèse sont : - la présence de fibrinogène qui se traduit par la présence d un pic à l électrophorèse, fin de migration β ou γ très rapide, - l augmentation des α2- ou des β-globulines (transferrine, composant C3 du complément, β-lipoproteines, hémolyse importante), - pic masqué dans les β-globulines (petite IgA monoclonale), - absence de pic en cas d Igm à activité cryoprécipitante pour non respect des conditions de prélèvement, - existence de formes diversement polymérisées d une Igm, responsable de plusieurs pics, - complexation de l Igm à d autres protéines, lui faisant perdre son homogénéité de charge : α1 antitrypsine pour les chaînes légères, facteurs rhumatoïdes monoclonaux [12] Electrophorèse des urines Technique C est la méthode la plus appropriée pour déceler la présence d une PBJ majoritairement constituée de chaînes légères libres d Ig d un seul type. Elle doit être réalisée parallèlement à l électrophorèse des protéines sériques. L électrophorèse sur acétate de cellulose est une méthode simple mais peu discriminatoire dans l étude des protéinuries. La nécessité d une concentration préalable dépendra de la quantité totale des protéinés urinaires [19]. Sont actuellement disponibles, des kits prêts à l emploi, permettant l analyse d échantillon d urine sans concentration préalable. 26

27 La séparation électrophorétique fractionne les protéines selon leur poids moléculaire (Hydragel protéinurie : fig. 8) ou selon leur charge électrique (Hydragel 7 HR ou 15HR : fig. 9) en fonction du kit commercial utilisé [28]. Cette technique permet aussi de détecter les Igm complètes en cas de leur passage dans les urines. Actuellement, l utilisation de l EC est difficilement applicable aux échantillons urinaires et nécessite encore de nombreuses mises au point [29]. Comme pour l Igm sérique, la nature monoclonale de la PBJ ne peut être affirmée qu après immunofixation [19]. A B Figure 8: Hydragel protéinurie: Séparation des protéines selon leur poids moléculaire(a), Les différentes fractions séparées(b) [30]. 27

28 A B Figure 9 : Hydragel 15HR(A) : Séparation des protéines selon leur charge électrique, Les différentes fractions séparées (B) [31]. Résultat La figure 10 présente un exemple des résultats d électrophorèse urinaire sur Hydragel protéinurie. Figure 10 : Un exemple de profil tubulaire (5) [31]. 28

29 Pièges Les pièges de l EPP urinaire concernent surtout la zone des β-globulines : -Présence de sang dans les urines ; hémoglobinurie ou myoglobinurie importante pouvant simuler un pic de PBJ dans la zone des β-globulines. -Des chaînes légères libres polyclonales kappa et lambda peuvent apparaître dans des atteintes tubulaires mais, dans ce cas, elles sont de 2 types, et en concentration peu importante. La zone des gammaglobulines est diffuse sur l électrophorèse urinaire (absence de pic homogène comme dans une PBJ) [4] Dosage immunochimique Des Ig A, G, M, D, E Intérêt et techniques En cas de détection d une Igm par électrophorèse, le dosage pondéral des Ig résiduelles physiologiques est indispensable pour l orientation diagnostique et le suivi des IM. Il ne doit être utilisé que pour quantifier les Ig polyclonales normales. Il permet de mettre en évidence une diminution ou non des Ig résiduelles qui représente un élément d orientation vers le caractère plutôt malin de l IM. Il ne doit en aucun cas être utilisé pour quantifier le composant monoclonal car il ne distingue pas l Igm des Ig polyclonales de la même classe. Il renseigne également sur les risques infectieux éventuels encourus par le patient, en raison de l hypogammaglobulinémie portant sur les Ig physiologiques (anticorps responsables de l immunité humorale) [4,12]. Différentes techniques peuvent être utilisées : néphélémétrie, turbidimétrie ou immunodiffusion radiale (technique de Mancini). Il s agit de méthodes 29

30 immunochimiques utilisant des réactions d immunoprécipitation. L immunoprécipitation résulte de la mise en évidence d un Ag soluble et de son Ac homologue ou immun sérum spécifique qui en se liant forme un complexe immun insoluble pour un certain rapport Ag-Ac. L immunoturbidimétrie et l immunonéphélémétrie sont des techniques d immunoprécipitation en milieu liquide. Les complexes Ag-Ac sont ainsi formés en présence d un excès d Ac en solution, ces complexes diffusent de la lumière de façon plus importante que les Ag ou les Ac libres. Il est dès lors possible de mesurer la lumière diffusée (néphélémétrie) ou la lumière transmise dans l axe des faisceaux (turbidimétrie) [32]. L immunodiffusion radiale de Mancini est une technique quantitative d immunodiffusion simple bidimensionnelle. C est une technique de mise en œuvre très simple mais demandant un temps de diffusion d au moins 24h en chambre humide. Elle n est donc pas adaptée à l urgence, mais demeure la technique de référence et la méthode de choix pour les protéines se trouvant en très faible concentration comme les IgD ou les sous-classes d Ig [4,12]. Résultat Les concentrations moyennes des immunoglobulines sériques sont présentées dans le tableau I [12]. Tableau I : Taux normaux des Ig IgG IgA IgM IgD IgE Taux en (g/l)

31 Pièges du dosage des Ig (G, A, M,..): -Redissolution possible par excès d Ag en cas d Ig monoclonale en concentration très importante (problème de plus en plus évité avec les équipements actuels), -Dosage normal des Ig en cas d Ig monoclonale exclusivement cryoglobulinique (notamment IgM dans la maladie de Waldenstrom) si le prélèvement a été amené au laboratoire à température ambiante et non à 37 C, -Penser à l existence éventuelle d une Ig D ou Ig E monoclonale s il existe un pic monoclonal associé à une hypo-gammaglobulinémie [4] Dosage des CLL et rapport κ/λ Intérêt et techniques Utilisé depuis 1986, le dosage pondéral des chaînes légères libres (κ et λ) est également réalisé par technique immunochimique, il permet le calcul du rapport κ/λ. Il s agit d un test biologique sensible, reproductible, disponible dans de nombreux laboratoires hospitaliers et un critère biologique utile pour l exploration, le suivi et la prise en charge des myélomes à chaînes légères, des myélomes peu ou non sécrétant et de l amylose AL [33]. Différentes techniques de dosage permettant de quantifier spécifiquement la forme libre des chaînes légères d immunoglobulines, ont été mises au point [34], mais aucune n a été développée en routine. Depuis 2001, une méthode immunologique automatisée (Freelite TM ) de dosage des chaînes légères libres κ et λ est disponible [35]. 31

32 Cette technique permet le dosage des CLL dans le sérum ou les urines, par immunonéphélémétrie ou immunoturbidimétrie avec une sensibilité de 0,5 mg/l et est adaptable sur différents automates de laboratoires. Elle utilise des Ac polyclonaux monospécifiques des CLL κ ou λ adsorbés sur des particules de latex, qui vont réagir et former des complexes immuns, dont la quantité est directement proportionnelle à l intensité de la lumière diffractée [36]. Les CLL κ et λ sont quantifiées séparément et le calcul du rapport κ/λ permet de faire la différence entre une augmentation polyclonale des CLL (les concentrations des 2 types de CLL sont augmentées mais le rapport κ/λ reste normal) et une production monoclonale de l une des CLL (rapport κ/λ perturbé). Dans le deuxième cas le rapport κ/λ, aide également au typage de l Igm (en complément du dosage des Ig (G, A et M)) : - rapport κ/λ élevé : Igm type kappa. - rapport κ/λ diminué : Igm type lambda [37]. Résultats Les valeurs normales sériques ont été définies par l équipe de Katzmann chez 127 donneurs de sang, âgés de 21 à 62 ans et 165 individus sains plus âgés (51 à 90 ans). Les intervalles de normalité sont, pour les concentrations sériques des CLL kappa de 3.3 à 19.4 mg/l, des CLL lambda de 5.7 à 26.3 et pour le rapport κ/λ de 0.26 à 1.65 [37]. Difficultés de dosage de CL Le dosage CLL présente un certain nombre de problèmes analytiques inhérents à la technique néphélémétrique. 32

33 Le phénomène de zone reste la principale limite de ce dosage. Phénomène immunologique liée à un excès d antigènes a été décrit chez plusieurs patients, il se traduit par une sous-estimation, voir même une normalisation de la concentration des CLL au dosage, alors qu il existe une CLL monoclonale importante à l immunofixation [38] Caractérisation isotypique Techniques Plusieurs méthodes combinent l électrophorèse et des réactions Ag-Ac. Elles permettent l appréciation simultanée de l homogénéité de charge et de la restriction isotypique des Ig. L IF est actuellement la plus répondue, elle a totalement remplacé l immunoélectrophorèse décrite par Grabar et Williams. Par ailleurs l avènement de l électrophorèse capillaire a donné naissance à une nouvelle méthode dite immunosoustraction pour le typage de l Igm. Immunoélectrophorèse (Figure 11) Technique de référence avec laquelle, ont été faites les premières identifications d IM, l immunoélectrophorèse est décrite à l institut pasteur par GRABAR et WILLIAMS dans les années 50. Il s agit d une réaction d immunoprécipitation en milieu gélifiée basée sur la combinaison de deux méthodes effectuées en deux temps : l électrophorèse de zone en agarose et l immunodiffusion en gel [19]. Le premier temps consiste en une migration électrophorétique, en tampon alcalin ph , de différentes fractions protéiques de la solution à analyser après son dépôt dans un puits creusé dans le gel. 33

34 Le deuxième temps consiste à déposer un antisérum monospécifique ou poly spécifique dans une rigole parallèle à la direction de migration. Une double diffusion de l antigène et de l anticorps l un vers l autre se produit donnant ainsi aux zones d équivalence respectives autant d arc de précipitation qu il y a de systèmes antigène-anticorps [12]. Cette analyse est toujours effectuée en comparaison avec un sérum humain normal eu égard de la position, la forme et l intensité des arcs. Figure 11: Plaque d IEP pour le typage des Igm (Laboratoire de biochimie de l HMIMV) L IEP est un examen long, qui demande une bonne expérience. Elle tend à être remplacée par des méthodes rapides, sensibles et d interprétation facile [13]. 34

35 Immunofixation (IF) Son principe fut décrit pour la première fois par Alfonso et Wilson en 1964, c est une technique qualitative qui associe à une séparation électrophorétique en tompan alcalin (ph=9.1), une immunoprécipitation par des antisérums antichaînes lourdes γ, α, et μ et antichaînes légères κ et λ (libres et liées), en première intension puis antichaines δ et anti ξ, antichaînes légères κ et λ dans le cas où seules les chaînes légères ont réagi. Une première piste est mise en évidence en contact avec un réactif fixateur de protéine pour servir de référence. Après l IF, les protéines précipitées, sont colorées par une solution de violet acide ou de noir amide. Les Ig polyclonales sont révélées sous forme d un précipité diffus, plus au moins large. La présence d Igm, se traduit par une bande étroite révélée par un antisérum antichaîne lourde associée à une bande étroite révélée par un antisérum antichaîne légère. Toutes deux sont précipitées au même niveau de migration que la bande étroite présente sur la piste témoin d EP. Dans le cas particulier de MCL, l IF révèle l unique présence de CL κ ou λ sans correspondance avec les chaînes lourdes. Dans les rares cas de myélome non excrétant ou non synthétisant, l IF se révèle sans anomalie. Cette technique est également applicable pour la recherche et le typage d une PBJ avec ou sans concentration préalable. Les immuns complexes utilisés sont alors : anti GAM, anti κ-totales, anti λ-totales, anti κ-free, anti λ- free [39,4]. 35

36 Les avantages de l IF sont nombreux : c est une technique résolutive, simple, pratique, rapide (délai de réponse en 3h), très sensible (0.5 à 1 g/l), spécifique et d interprétation facile [12,4]. Les figures12 et 13 illustrent des exemples d IF sérique et urinaire réalisées au laboratoire de Biochimie à l HMIMV Rabat. Figure 12: Résultat de l immunotypage par IF des protéines sériques sur gel d agarose (IM, Ig M de type kappa), (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv). Figure 13: Résultat de la recherche de la PBJ par IF des protéines urinaires (PBJ de type λ), (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv). Immunosoustraction La dernière et plus récente technique mise en place au laboratoire de biochimie pour typer une Igm est l immuno-soustraction (IS). Cette technique s est développée grâce à l émergence de l électrophorèse capillaire qui est son support direct. Dans le système de Paragon CZE 2000 (Beckman Coulter, USA), l IS consiste à faire réagir le sérum renfermant le composé monoclonal avec différentes familles de billes de sépharose sur lesquelles a été greffé un anticorps 36

37 spécifique réagissant contre les chaînes γ, μ, α, κ, ou λ. Après agitation puis sédimentation des billes (précipitation de complexe antigène-anticorps, le surnagent est ensuite prélevé et injecté dans les capillaires où a lieu l étape classique de séparation électrophorétique [40,41]. Dans le système de Sebia, la technique est basée sur l utilisation des anticorps spécifiques en milieu liquide ce qui présente l avantage d obtenir des immuns complexes solubles. L injection dans les capillaires se fait donc plus rapidement, sans étape de sédimentation. Ces complexes ainsi formés, plus lourds que les autres fractions protéiques vont migrer avant l albumine ne gênant pas la lecture des six traces d électrophorèses [25]. La présence d une Igm se traduit par la disparition ou la diminution d un pic observé en superposant l électrophorégramme de référence (Figure14). 37

38 1. Profil témoin 2. Profil avec l anti-γ 3. Profil avec l anti-α bbμαααακμαγα 4. Profil avec l anti-μ bbμαααακμαγα 5. Profil avec l anti-κ 6. Profil avec l anti-λ Figure 14: Résultat de l immunotypage par immunosoustraction sur le Capillarys révélant une IM IgG/λ, (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv). Le principal inconvénient de cette méthode est que l identification d une Igm n est possible qu en présence d un pic fin, étroit et bien individualisable à l électrophorèse. Ainsi, toute Igm migrant en dehors de la zone gamma et/ou en dehors d une vallée, peut passer inaperçue [25]. 38

39 Pièges du typage de l Igm: Ils sont essentiellement représentés par la redissolution complète de l arc en immunoélectrophorèse en cas d excès d Ag, le phénomène de zone n existant pas en immunofixation où l image obtenue reste interprétable (bande homogène importante et zone centrale décolorée) [4] Recherche, quantification et typage d une cryoglobulinémie Les cryoglobulinémies sont définies par la présence persistante dans le sérum d'ig qui précipitent au froid et se resolubilisent lors du réchauffement. Cette définition permet de distinguer les cryoglobulinémies des autres cryoprotéines, c'est-à-dire les cryofibrinogènes et les agglutinines froides [42, 43] Mise en évidence d une cryoglobuline La recherche de cryoglobulinémie se justifie par le fait que certaines sont constituées d une Igm. Sa détection in vitro se base sur ses propriétés de précipitation à basse température. Sa mise en évidence nécessite, comme cela a été souligné, un protocole stricte depuis le prélèvement jusqu au typage de la cryoglobuline : le sérum doit être conservé au moins 7 jours au réfrigérateur à 47 O C et observé quotidiennement. La cryoglobulinémie est positive s il apparaît au fond du tube un précipité blanchâtre et de granulation fine, donnant un aspect en volutes de fumées s il est doucement remis en suspension. Parfois c est une gélification de sérum, ou plus rarement l apparition de cristaux précipitant au fond du tube. Dans tous les cas, la redissolution doit être complète si le sérum est placé à 37 O C, confirmant la nature cryoglobuliniques du précipité [16]. 39

40 Quantification et typage Avant d effectuer le dosage et le typage d une cryoglobulinémie, il est important de l isoler et de la purifier par lavage et centrigufication. Il n existe pas de méthodes idéales de dosage de cryoglobulinémie dans la mesure où les protéines entrant dans leur composition sont des Ig parfois de trois classes différentes [4]. Une technique simple et sensible est proposée au biologiste sous forme d un coffret prêt à l emploi, il s agit d une technique colorimétrique optimisée, dérive de la méthode de biuret. Le typage est indispensable quand la cryoglobuline est en quantité suffisante (>50 mg/l). L immuno-empreinte (Western Blot) est la technique de choix pour le typage des cryoglobulines mais elle est assez longue, ce qui constitue un frein à son utilisation courante. L IF est une technique plus accessible applicable au typage des cryoglobulinéemies [4,16]. Un exemple de typage de cryoglobuline par immunofixation, réalisé au laboratoire, est représenté par la figure 15. Figure 15 : Résultat de l immunotypage par IF d une cryoglobuline IgM/κ 40

41 (Laboratoire de biochimie, HMIMV) 41

42 Interprétation La classification des cryoglobulines en trois types (I, II et III) proposée en 1974 par Brouet et al. [44] est toujours utilisée par la plupart des auteurs, mais elle apparaît aujourd'hui incomplète car elle est basée sur l'analyse par IEP. L'utilisation de l'if, technique plus sensible et plus résolutive, a mis en évidence un nouveau groupe de cryoglobulines comportant un profil oligoclonal [16]. Ainsi, la nouvelle classification proposée par Le Carrer [16] conserve le type I monoclonal et le type mixte III polyclonal, mais subdivise le type mixte II en deux sous-groupes: le type IIa monoclonal et polyclonal et le type IIb oligoclonal et polyclonal Pièges de la cryoglobulinémie Les pièges sont représentés par les faux négatifs et les faux positifs. Dans le premier cas, le non respect des modalités du prélèvement et du transport peut entrainer la précipitation de la cryoglobuline dans le caillot, donc sa perte dans le sérum. Dans le deuxième cas, les lipides présents dans le sérum d un patient non à jeun ou avec une dyslipidémie importante peuvent donner un trouble qui se redissout à 37 o C. 3- Confirmation du diagnostic Le myélogramme sternal est nécessaire pour établir le diagnostic. Il permet de savoir si l Igm est le témoin d une prolifération lymphocytaire et ou plasmocytaire avérée, ou si au contraire, elle est de nature bénigne. La BOM est indiquée dans tous les cas où le myélogramme semble non informatif ou infructueux. 42

43 4- Examens évaluant le pronostic et le retentissement de l Igm 4.1. Dosage de la β 2 microglobuline La bêta 2 microglobuline (β2m) est une protéine de faible poids moléculaire (11800 daltons), constitutive du système HLA, et présente à la surface de toutes les cellules à l exception des érythrocytes. Ce polypeptide est secrété principalement sous forme libre, et son élimination est exclusivement rénale [45,46]. Marqueur de la prolifération lymphoplasmocytaire, son augmentation devra toujours être interprétée en fonction de l état rénal [19]. Son dosage peut être déterminé par technique immunochimique : immunoturbidimétrique, immunonéphélémétrique ou immunoenzymatique. Ces techniques répondent le mieux à des exigences de rapidité, de sensibilité et de spécificité. Le taux chez l adulte est en fonction des techniques de dosages utilisées, variant de 1.2 à 3 µg/ml. Il est augmenté dans toute prolifération myélo- et lymphocytaire et dans les tubulopathies [19]. La β2m permet d évaluer la masse tumorale dans le myélome, de surveiller la réponse au traitement et constitue un marqueur fiable d appréciation pronostique de la maladie de Kahler [4] Bilan biochimique standard L hypercalcémie et l hyper calciurie parallèles, dues aux destructions osseuses sont fréquentes dans le myélome, Le bilan rénal complet peut mettre en évidence une hypercréatininémie si l insuffisance rénale est déjà installée [4]. 43

44 4.3. Hémogramme La NFS est également un examen capital dans le bilan diagnostique d un myélome. Elle met fréquemment en évidence une anémie (généralement normocytaire), plus rarement une thrombopénie et de manière exceptionnelle, une neutropénie. Dans de très rares cas, la NFS peut mettre en évidence des plasmocytes circulants, signant alors une leucémie à plasmocytes. L examen du frottis met en évidence des rouleaux érythrocytaires, témoin du composant monoclonal sérique [47] Dosage de la CRP La Protéine C Réactive est une glycoprotéine de masse moléculaire daltons, formée par l union de 5 sous-unités identiques. Cette protéine porte son nom en raison de sa propriété de précipiter au contact de polysaccharide C du pneumocoque. C est un marqueur très précoce de l inflammation, s élevant dans les 2 à 4 heures après le début du processus inflammatoire [45]. Le taux normal varie de 0 à 6 mg/l. Au cours du myélome multiple, l interleukine 6 (IL6), produite en grande quantité par le microenvironnement tumoral, stimule la synthèse de la CRP qui est donc un bon critère d efficacité thérapeutique, et surtout un indicateur sensible de rechute pour les myélomes mis en rémission [4]. 44

45 II. LES IMMUNOGLOBULINOPATHIES MONOCLONALES A. Classification des immunoglobulinopathies monoclonales [4] 1. Classification basée sur des critères immunochimiques 1.1. Hyperproduction sélective d une Ig monoclonale complète (95 à 97% des cas environs) Cette biosynthèse anormale concerne les IgG, les IgA, les Ig M et le plus rarement les IgD ou les IgE. Elle sera en relation avec une immunoglobulinopathie monoclonale maligne ou bénigne et en général, se traduira par l existence d un pic monoclonal net à l électrophorèse Hyperproduction de chaînes légères libres monoclonales (3à 5 % des cas environ) Il existe dans ce cas une augmentation anormale de la biosynthèse des chaînes légères libres de type κ ou λ. Cette anomalie se rencontre presque exclusivement dans le myélome à chaînes légères, constamment malin. Le pic monoclonal est en général absent ou très discret sur l électrophorèse du sérum, sauf s il existe des polymères de chaînes légères libres de poids moléculaire (PM) trop important pour passer le filtre rénal. Une hypogammaglobulinémie d accompagnement portant sur les trois classes d Ig est en général présente. 45

46 1.3. Hyperproduction de chaînes lourdes libres monoclonales structuralement anormale (très rare) Ce type d immunoglobulinopathie monoclonale concerne les chaînes lourdes libres α, γ ou µ et se rencontre dans les pathologies rares et malignes des maladies des chaînes lourdes (MCL). Leur diagnostic est difficile et le pic monoclonal inconstant sur l électrophorèse du sérum. 2. Classification basée sur des critères cliniques 2.1. Immunoglobulinopathies monoclonales malignes Elles sont principalement représentées par les pathologies suivantes : Le Myélome à IgG, IgA, chaînes légères ou plus rarement à IgD, IgE ou IgM, La Maladie de Waldenström à Ig M, La Maladie des chaînes lourdes α, γ ou μ. L Ig monoclonale constitue ici un marqueur tumoral de diagnostic et de surveillance de la maladie Gammapathies monoclonales de signification indéterminée Elles concernent les IgG, IgM ou plus rarement IgA. Deux types de MGUS peuvent être individualisés, l Ig monoclonale détectée ne pouvant pas être considérée comme un marqueur tumoral : Les Gammapathies monoclonales associées à certaines pathologies connues malignes ou bénignes du sujet jeune ou âgé. 46

47 Les Gammapathies monoclonales idiopathiques, souvent asymptomatiques chez le sujet âgé. B. Les immunoglobulinopathies monoclonales malignes (IMM) Les immunoglobulinopathies malignes regroupent les syndromes lymphoprolifératifs à caractère tumoral. Dans ce groupe, les immunoglobinopathies monoclonales de type IgG et IgA doivent être distinguées de celles de type IgM, les premières témoignent d un myélome multiple, les deuxièmes caractérisent la maladie de Waldenström [48]. Selon le type et la concentration de l Igm synthétisée, on peut distinguer les différents tableaux cliniques abordés ci-après. 1. Myélome multiple 1.1. Définition Décrit par Mac Intyre en 1850, le myélome multiple des os porte le nom de maladie de kahler, lequel a contribué à sa description par une publication de 1889 [49]. C est une hémopathie maligne développée à partir d un clone lymphoïde B, aboutissant à une prolifération de plasmocytes monoclonaux dans la moelle hématopoïétique [50] Épidémiologie Le MM est la forme la plus fréquente des proliférations lymphocytaires malignes. Les connaissances sur son épidémiologie descriptive sont rares. 47

48 Dans les pays développés, elles donnent une incidence annuelle de 4 cas par habitants [50]. Alors qu il n existe pas de chiffre précis au Maroc [51]. Il représente 1% de l ensemble des cancers et 15% des hémopathies malignes [51]. D une façon générale, la fréquence de la maladie augmente avec l âge. Selon des études, l âge médian de diagnostic se situe entre 60 [38] et 71 ans [48], avec un ratio H/F de 3/2 ; ce qui indique que les hommes sont plus souvent atteints que les femmes Signes cliniques C'est une maladie à symptomatologie très polymorphe : les signes cliniques et biologiques sont dus en grande partie à la sécrétion des médiateurs sériques de façon variable d un malade à l autre. Lorsque le MM est symptomatique, le plus souvent, l altération de l état général et les douleurs osseuses dominent le tableau clinique. Les fractures pathologiques sont fréquentes et les tuméfactions osseuses possibles. Les complications peuvent être inaugurales en particulier l insuffisance rénale, l anémie, les complications osseuses ou infectieuses et rarement le syndrome d hyperviscosité [52,53] Signes biologiques -Anomalies protéiques La réalisation d une exploration des protéines sériques et urinaires est indispensable. Dans 80% des cas, l EPS met en évidence un pic étroit 48

49 correspondant à une protéine monoclonale de type IgG ou IgA, migrant le plus souvent dans la zone des gammaglobulines, parfois des β-globulines ou des α 2 globulines. L albuminémie est diminuée. La présence d une protéine monoclonale sérique est habituellement responsable d une hyperprotidémie, pouvant être supérieure à 100g/l (Figure 16). Parfois, il n existe pas d aspect de pic étroit à l EPS qui révèle en outre une hypogammaglobulinemie, cette situation correspond surtout au MCL (Figure 18) ou au myélome de type IgD. Plus rarement, il s agit d un MNE ou MNS. Il est également possible de détecter une immunoglobulinopathie biclonale. L EPS est complétée par le dosage pondéral des Ig dont la principale indication est l évaluation du taux des Ig polyclonales (apprécié par l effondrement des autres classes d Ig). L IF des protéines sériques permet de typer la protéine monoclonale pour sa chaine lourde (G, A) et sa chaine légère (κ ou λ). L électrophorèse des protéines urinaires montre dans 90% des cas une protéinurie de Bence-Jones et l IF urinaire en précise le type. -La VS est souvent augmentée pouvant dépasser 100 mm à la 1ère heure. -L hémogramme dévoile, dans plus de la moitié des cas, une anémie qui est le plus souvent normochrome normocytaire arégénérative traduisant un envahissement médullaire. La leucopénie et la thrombopénie sont rares et de mauvais pronostic reflétant une importante masse tumorale. -Le myélogramme montre une infiltration plasmocytaire habituellement supérieure à 30%. (Figure 17) 49

50 Sur le reste du bilan biologique, on pourra constater une augmentation de la creatininémie ainsi que de la calcémie [52,53]. Figure 16 : Résultat de l EPP et de l IF sériques sur gel d agarose dans le cas d un MM IgG de type κ, (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv). 50

51 Figure 17 : Résultat du myélogramme illustrant l existence d une plasmocytose médullaire avec des éléments dystrophiques (Diagnostic positif du MM. (Laboratoire d Hématologie de l'hmimv) 1.5. Critères diagnostiques D après «The international myeloma working group definition of multiple myelome» réuni en 2003, le diagnostic du myélome multiple symptomatique repose sur deux critères biologiques et un critère clinique [54] : Igm dans le sérum et/ou les urines + plasmocytose médullaire. +une anomalie organique Sous le terme d anomalie organique, on distingue : - l hypercalcémie - l insuffisance rénale - l anémie - Les lésions osseuses, l ostéoporose ou les fractures - Autres : hyperviscosité, amylose, infections bactériennes récurrentes. En outre, il est important de différencier le myélome multiple actif, de la notion de «smoldering multiple myeloma» [52, 53] qui est le versant asymptomatique du MM et qui est défini comme suit : Igm dans le sérum 30 g/l et / ou plasmocytose médullaire 10%. 51

52 D autres variants moins connus du myélome multiple vont être abordés dans le paragraphe suivant Formes cliniques de myélomes Formes immunochimiques Les myélomes multiples peuvent être définis par le type de l Igm et par ordre décroissant de fréquence, on individualise [53] : Les myélomes à IgG (55 %) Les myélomes à IgA (26 %) Les myélomes à chaîne légère (14 % des cas) : Ceux-ci présentent les caractéristiques suivantes : - La VS est basse ou peu augmentée, - L EPP sérique montre le plus souvent une hypogamma-globulinémie sans pic monoclonal (figure 18), - L IF révèle la présence de CLLm parfois dans le sang mais presque toujours dans les urines avec des difficultés de dépistage (figure 18). En effet la suspicion d un MCL sera basée sur la visualisation d une seule bande de précipitation au niveau de l un des immunsérums antichaînes légères κ ou λ (première IF). Cet aspect est aussi retrouvé dans les myélomes à IgD et IgE. Le diagnostic d un MCL ne pourra être posé qu en recommençant l IF (deuxième IF) en utilisant deux types d antisérums, l un dirigé contre les formes liées et libres et l autre dirigé contre les formes libres de chaînes légères. La même plaque d IF (deuxième IF) permet la 52

53 recherche indispensable d une éventuelle IgD ou IgE monoclonale en utilisant des immuns sérums anti IgD ou IgE. C est la visualisation d une bande colorée dans la piste contenant les antisérums dirigés contre les formes libres sans correspondance avec une chaine lourde qui signera la présence de CLL dans le sang [55] (figure 19). - Les MCL se compliquent très fréquemment d insuffisance rénale surtout si la protéinurie de Bence Jones est importante. Les myélomes à IgD sont rares (3% des cas) et particulièrement graves. La chaîne légère est lambda. Dans la majorité des cas, ils se compliquent là encore d insuffisance rénale ou d amylose. Le myélome non sécrétant ou non excrétant (2 % des cas): l immunotypage ne détecte aucune immunoglobuline ni dans le sérum ni dans les urines. Le diagnostic repose sur l association lésions osseuses et la plasmocytose médullaire. Il est affirmé par l immunofluorescence sur les plasmocytes médullaires (non excrétant). Les myélomes IgM et IgE sont exceptionnels. 53

54 Figure 18 : Résultat de l EPP et de l IF sérique sur gel d agarose dans le cas d un MCL de type λ, (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv) L t : anti CL lambda totales (libres et liées) L f : anti CL lambda libres Première IF (1) Deuxième IF (2) -Présence d une anomalie avec l antisérum anti-lambda totales «libres et liées» (1). -Identification des chaînes légères libres sur une autre immunofixation avec les antisérums anti-igd, anti-ige, anti-cl lambda totales et anti-cl lambda libres (2) Figure 19 : Résultat de l IF sérique sur gel d agarose montrant la présence de CLLm de type λ (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv). 54

55 Plasmocytome solitaire [56,57] C est une lésion plasmocytaire unique, de localisation osseuse (plasmocytome vertébral, cranieofacial, d un os long) ou extra-osseuse (cavum, amygdale, fosses nasales, ganglions, parties molles, seins, tube digestif). Le diagnostic est histologique. On peut trouver les anomalies protidiques habituelles avec l excrétion d une Ig monoclonale qui disparaitra progressivement après le traitement du plasmocytome Leucémie à plasmocytes [58] La leucémie à plasmocytes réalise un tableau clinique proche de celui de leucémie aiguë avec [58]: - insuffisance médullaire marquée ; - hépato-splénomégalie ; - présence de signes généraux, fièvre. Son diagnostic est basée sur la présence dans le sang périphérique d un pourcentage de plasmocytes >20% de leucocytes circulants [59]: Le pronostic est particulièrement redoutable malgré les traitements actuels " POEMS syndrome " [60] Le POEMS syndrome, dénommé syndrome de CROW-FUCASE principalement au Japan, est une dyscrasie plasmocytaire rare. Cet acronyme, proposé par Bardwick, se définit par l association : - P une polyneuropathie (Polyneuropathy), - O une organomégalie (Organomegaly), 55

56 - E une endocrinopathie (Endocrinopathy), - M une dysglobulinemie monoclonale (Monoclonal protein) qui correspond à une prolifération plasmocytaire avec immunoglobuline monoclonale, - et S des anomalies cutanées (Skin abnormalities). Typiquement, il comporte les cinq éléments annoncés. Cependant, il faut souligner que les formes incomplètes sont les plus fréquentes, ce qui pose de véritables problèmes diagnostiques Evolution et pronostic du myélome Malgré la thérapeutique, le MM reste une hémopathie de pronostic redoutable constamment mortelle. L espérance de survie médiane est comprise entre 3 et 5 ans selon les études. Cependant cette survie est très variable allant de quelques mois dans les formes les plus graves, jusqu'à plus de 10ans [52, 53, 61]. Cette hétérogénéité résulte de l existence de plusieurs facteurs pronostiques, on en distingue : - Ceux liés à l hôte : âge, atteinte rénale, réponse au traitement - Ceux liés à la tumeur : β2m sérique, anomalies cytogénétiques, morphologie des plasmocytes La classification historique de Durie et Salmon, basée sur la masse tumorale est encore utilisée (Tableau II). Néanmoins un nouveau système de classification a apparu récemment, basé sur la mesure de l International Pronostic Index (IPI) qui détermine 3 stades de la maladie en fonction des valeurs de deux paramètres biologiques : la β 2 M et l albuminémie (Tableau III) [61, 62]. Une β 2 M sérique élevée est associée à une survie plus courte. 56

57 Les anomalies cytogénétiques prennent de plus en plus une importance pronostique croissante. En effet le développement des techniques d hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur cellules interphasiques a rendu possible l analyse de cellules plasmocytaires non proliférantes. De même, la démonstration de la très grande fréquence des réarrangements illégitimes du gène codant pour les chaines lourdes d Ig dans les lignées cellulaires de MM a permis d identifier de nouvelles translocations récurrentes dans cette pathologie. De plus, des études ont montré que certaines de ces anomalies pouvaient se rencontrer dès le stade préclinique, dans les MGUS [63]. Ces études ont permis de dresser un «catalogue» assez précis des anomalies chromosomiques les plus fréquemment rencontrées (Tableau IV). 57

58 Tableau II : La classification de Durie et Salmon [62]. Cette classification est basée sur la masse tumorale et comprend trois stades et une sous-classification. Stade I: Stade II: Stade III: Critères -Myélome de faible masse tumorale -Présence de tous les critères suivants : 1) Hémoglobine > 10 g/dl 2) Calcémie < ou = 3 mmol/l 3) Os normal ou un seul plasmocytome osseux 4) Faible taux d immunoglobuline monoclonale : IgG sérique < 50 g/l IgA sérique < 30 g/l Protéïnurie monoclonale < 4 g/24 h -Myélome de masse tumorale intermédiaire -Regroupe les myélomes multiples ne répondant ni aux critères de stade I, ni aux critères de stade III -Myélome de forte masse tumorale -Présence d un ou plusieurs des critères suivants : 1) Hémoglobine < 8.5 g/dl 2) Calcémie > 3 mmol/l 3) Atteinte ostéolytique multiple 4) Taux élevé d immunoglobuline monoclonale : IgG sérique > 70 g/l IgA sérique > 50 g/l protéïnurie monoclonale > 12 g/24 h Sous-classification selon la fonction rénale Stade A: Stade B: Créatinine < 20 mg/l Créatinine > ou = 20 mg/l 58

59 Tableau III : index du pronostic international de classification du myélome multiple [48] Stade Critères Survie (médiane) Stade I Bêta2-m < 3.5 mg/l + albuminémie > ou 62 mois = 35 g/l Stade II Ni stade I, ni stade III 44 mois Stade III Bêta2-m > ou = 5.5 mg/l 29 mois Bêta2-m : bêta2-microglobulinémie sérique Tableau IV: Incidence des principales anomalies chromosomiques dans les Anomalies chromosomiques Incidence GMSI (%) Incidence MM (%) Impact pronostique Réarrangement IGH 60 > 50 Inconnu t (11;14) Neutre t (4; 14) Défavorable +++ t (14;16)/t (14;20) 1 5 Défavorable +++ Hyperdiploïdie Favorable + Del (13) Défavorable ++ Gains 1q Défavorable ++ Del (17p) 0 10 Défavorable +++ GMSI et le MM [63] 59

60 2. Macroglobulinémie de Waldenström 2.1. Définition Initialement décrite par Jan Waldenström, la macroglobulinémie de Waldenström (MGW) est une hémopathie lymphoïde chronique touchant la cellule B. C est une affection rare qui s inscrit parmi les syndromes lymphofrolifératifs [64]. Elle se définit par l association d une IgM monoclonale présente dans le sérum à un taux supérieure à 5g/l et d une infiltration lymphoïde médullaire, le plus souvent polymorphe, lymphoplasmocytaire [65,66]. En amont, la présence d une IgM témoigne d une prolifération lymphoïde B. En aval, les IgM ont des conséquences clinicobiologiques propres, tantôt liées à leurs propriétés anticorps, tantôt liées à leurs propriétés physico-chimiques [67] Epidémiologie La MGW est une affection rare. Elle est en effet, 3 à 4 fois moins fréquente que le myélome, elle représente 6% des syndromes lymphoprolifératifs B et 2% des hémopathies malignes et son incidence est inferieur 1 pour de la population. La maladie est exceptionnelle avant 30 ans. La médiane d âge de survenue est de 63 ans avec une nette prédominance masculine [68, 69] Tableau clinique La MGW a souvent une évolution progressive et de ce fait compatible avec une survie prolongée. 60

61 Les manifestations cliniques sont directement liées aux propriétés physicochimiques et antigéniques de l IgM secrétée, elles sont de deux ordres [70, 71, 72]: certaines liées à l infiltration médullaire et représentées essentiellement par un syndrome tumoral (adénopathie, splénomégalie et hépatomégalie), et d autres liées aux propriétés physicochimiques et antigéniques de l IgM : syndrome d hyperviscosité, syndrome hémorragique, anémie, maladies des agglutinines froides, et neuropathie périphérique Biologie Le principal paramètre biologique de la MGW c est l existence dans le sang d une Igm de type IgM (Macroglobuline monoclonale), avec un taux élevé>30g/l chez le tiers des patients [73]. L électrophorèse du sérum met en évidence un pic habituellement situé dans la zone γ-globulines (fig.20). Le dosage pondéral montre pour les autres Ig polyclonales, un taux normal, peu diminué, ou augmenté modérément. On trouve parfois dans les urines une PBJ en faible quantité [11]. D autres manifestations biologiques peuvent faire penser à la MGW : les rouleaux érythrocytaires sur frottis sanguin et la très forte accélération de la VS résultante d une hyper protidémie fréquente au cours de cette pathologie [11]. Une hyperlymhocytose inconstante, généralement discrète peut être observée. L hémogramme révèle en outre une anémie chez 60% et une thrombopénie chez 16% des patients [73,11]. Le myélogramme montre des cellules lymphoïde plus proche de lymphocytes que de plasmocytes, mais l aspect cytologique est habituellement pléomorphe. 61

62 La BOM confirme l infiltration lymphoïde. La présence d une cryoglobulinémie caractérise 10 à 20% des patients [11]. Figure 20: Résultat de l EPP et de l IF sériques sur gel d agarose dans le cas d une MGW, IgM de type λ, (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv) Diagnostic de la MGW Les critères diagnostiques définis lors du 2ème workshop sur MGW, sont les suivants: [72] IgM monoclonale sérique quelle que soit la concentration ; infiltration médullaire par de petits lymphocytes avec différenciation plasmocytaire ; infiltration à la biopsie médullaire souvent diffuse ; 62

63 phénotype des cellules tumorales (immunophynotypage par cytométrie de flux) : IgM +, CD5 /+, C10, CD19 +, CD20 +, CD22 +, CD23, CD25 +, CD27 +, FMC7 +, CD Pronostic : La médiane de survie varie entre 5 et 10 ans selon les séries [74, 75, 76]. Dans la plupart des études pronostiques, 3 facteurs sont cités : - l âge avec seuil compris entre 60 et 70 ans [75, 76, 70,78]. - L abaissement du taux d hémoglobine [74, 75, 76, 77,78]. - L élévation du taux de β-microglobulines [74,76, 77,78]. 3. Amylose 3.1. Définition C est une maladie rare, secondaire au dépôt extracellulaire fibrillaire des chaînes légères de l Igm. On parle des fibrilles amyloïdes qui se précipitent au niveau des organes, entrainant ainsi leur dysfonctionnement. Elle peut survenir de façon primitive ou dans un contexte avéré de prolifération tumorale lymphoïde B [79]. Les chaînes légères des Ig responsable des amyloses AL sont 2 à 4 fois plus souvent λ que κ à la différence des IM usuelles [80] Epidémiologie L amylose AL est 5 fois moins fréquent que le myélome avec une incidence de 8 cas pour d habitants [81]. Il existe une prédominance masculine modérée de l amylose AL. 63

64 L âge moyen au moment de diagnostic est entre 60 et 65 ans selon les séries, mais l amylose AL peut également s observer chez les adultes jeunes. La durée moyenne de survie est de 14ans [82] Manifestations cliniques : [79,82, 83] L amylose est une maladie multi-viscérale susceptible de toucher pratiquement tous les organes. Elle se manifeste cliniquement par : - Une cardiomyopathie, cause du décès dans environs la moitié des cas. Elle se manifeste initialement par une dyspnée, asthénie qui peut évoluer vers une insuffisance cardiaque, s accompagnent souvent de trouble de rythme, - Une néphropathie (protéinurie et insuffisance rénale), - Des atteintes digestives : macroglossie, hémorragie hépatobiliaire/ splénomégalie, - Une atteinte cutanée : purpura ecchymotique 3.4. Diagnostic Une fois le diagnostic clinique de l amylose est évoqué, il faut s efforcer d en faire le diagnostic histologique pour la confirmer. Cela implique donc la réalisation d une biopsie et son étude après coloration spécifique principalement par le rouge CONGO [82]. 4. Maladies des chaînes lourdes Définition [11] Ce sont des hémopathies peu fréquentes, caractérisées par une prolifération monoclonales de cellules de la lignée B, qui sont sécrétantes mais d Ig incomplètes constituées uniquement de chaînes lourdes. 64

65 On distingue trois variantes de maladies de chaines lourdes correspondant aux 3 principales classes d Ig secrétées et connues par ordre de fréquence : Maladie de chaîne lourde α : IgA Maladie de chaîne lourde γ : IgG Maladie de chaîne lourde µ: IgM 4.2. Clinique et épidémiologie Maladie des chaines lourdes γ Décrite la première fois en 1964, cette maladie est aussi fréquente chez l homme que chez la femme. Elle n'a pas de distribution géographique ou raciale particulière. L âge moyen des malades au moment de diagnostic est de 60 ans, mais elle peut s observer chez des sujets jeunes voire chez l enfant ou l adolescent. L aspect clinique se caractérise par une grande hétérogénéité. Elle se présente comme une prolifération plasmocytaire avec quelques plasmocytes touchant la moelle et fréquemment les ganglions, une hépatosplénomégalie est également possible, la survenue de manifestations auto-immunes est fréquente lors de cette maladie : polyarthrite, hémolyse auto-immune. Généralement, elle présente un tableau clinique polymorphe proche de la MGW [11,84] Maladie des chaines lourdes α Décrite par Feligman en 1968, également appelée lymphome méditerranéen. Contrairement à la plupart des hémopathies lymphoplasmocytaires, la maladie des chaînes lourdes alpha survient le plus souvent chez des sujets jeunes 65

66 originaires pour la plupart d entre eux du pourtour méditerranéen, d Extrême et de Moyen-Orient. Depuis que le premier cas est répertorié en 1968, cette maladie se présente sous deux formes cliniques principales [85,86] : - La forme digestive la plus fréquente c est l expression d un syndrome de malabsorption et d une entéropathie exsudative, - Et la forme respiratoire qui reste très rare Maladie des chaînes lourdes µ Exceptionnelle, car un petit nombre d observations a été connu depuis la description initiale de la maladie en 1970 par Forte et Franklin. Cliniquement, elle se présente comme une leucémie lymphoïde chronique [11] Diagnostic biologique [87,88] Le diagnostic des maladies des chaînes lourdes repose uniquement sur l étude immunochimique des Ig sériques et éventuellement des Ig urinaires et cellulaires. Le taux sérique de la protéine pathologique est souvent peu important. L'EPS ne met donc qu'inconstamment en évidence une bande anormale, qui est souvent assez large, située habituellement dans la région: - des γ ou β 2 -globulines pour les maladies des chaînes lourdes γ, - des α2-globulines pour les maladies des chaînes lourdes µ, - S étendent au α2-globuline pour les maladies des chaînes lourdes α. Dans ce cas, le typage (IF sérique avec les antichaines lourdes) du composant monoclonal permet d établir le diagnostic. La protéine anormale est rarement retrouvée dans les urines. 66

67 5. Autres hémopathies Il existe de nombreuses autres affections malignes au cours desquelles un pic monoclonal, qu il soit de nature IgG, IgM ou IgA, peut être découvert. Sans entrer dans les détails, nous pouvons citer notamment : la leucémie lymphoïde chronique, les lymphomes non hodgkiniens, la leucémie myélonormocytaire chronique, ainsi que certaines myélodysplasies. C. Les gammapathies monoclonales de signification indéterminée (MGUS) Les gammapathies monoclonales de signification indéterminée (MGUS) sont des affections asymptomatiques, caractérisées par l existence d un pic d immunoglobuline monoclonale dans le sérum, en dehors de tout signe d hémopathie lymphoïde [89]. 1. Définition Le terme classique de gammapathie monoclonale bénigne ne doit plus être employé, au regard de leur potentiel évolutif [90,91]. On lui préfère donc celui de GM apparemment bénigne ou plus souvent de GM de signification indéterminée, traduction littérale de la terminologie anglosaxone MGUS (Monoclonal Gammopathy of undetermined Significance). Une MGUS est définie par l association des critères suivants [92]: - présence d un pic d Igm sérique de moins de 30g/l (quel que soit le type d Ig); - myélogramme contenant moins de 10 % de plasmocytes non dystrophiques; - PBJ faible ou absente (<1g/24h) ; 67

68 -absence de signes cliniques ou biologiques de toute lymphoprolifération maligne (hypercalcémie, lésion osseuse, IR, ou médullaire). Il s agit donc d une définition purement biologique : il faut cependant lui ajouter, comme proposé par Durie, une stabilité pendant un minimum d un an, afin d exclure les myélomes multiples découverts à leur tout début [90]. ajouter, comme proposé par Durie, une stabilité pendant un minimum d un an, afin d exclure les myélomes multiples découverts à leur tout début [91]. Figure 21 : Résultat de l EPP et de l IF sériques sur gel d agarose dans le cas d une MGUS, IgM de type κ, (Laboratoire de Biochimie de l'hmimv). ; 2. Epidémiologie Les MGUS représentent la majorité des cas d IM [93,94], presque 60% d après les données de la Mayoclinic aux Etats unis [95]. 68

69 Leur fréquence est estimée à 3.4 %, chez les plus de 50 ans et augmente avec l âge allant de 1.7 % entre 50 et 59 ans à 6.6 % au delà de 80 ans [89,95]. L âge médian du diagnostic se situe autour de 70 ans. Comme pour le MM, les MGUS sont 2 fois plus fréquentes dans la race noire. Leur prévalence est plus importante chez l homme [96]. 3. Exploration et diagnostic différentiel La notion de MGUS ne peut être retenue qu après exclusion de pathologie lymphoïde détectable sous-jacente. Si l isotype de l Ig est IgG ou IgA, il faut rechercher systématiquement un myélome. L anamnèse clinique recherche l existence de douleurs osseuses, d infections récurrentes. Un minimum d examens est nécessaire chez un patient asymptomatique avec un examen clinique normal. Les résultats de l étude immunochimique des protéines sériques et urinaires, de la calcémie, de la créatinémie, de l hémogramme sont confrontés pour écarter l hypothèse d un MM. Quand le pic monoclonal est d importance modérée IgG<20g/l ou IgA<10g/l, aucun autre examen complémentaire ne sera réalisé mais quand le taux de composant monoclonal est plus important, il est conseillé d effectuer des radiographies osseuses, un myélogramme pour évaluer la plasmocytose et un dosage de β2-microglobuline. Ces examens doivent être normaux et la plasmocytose médullaire doit être inferieure à 10% pour parler de MGUS [97]. Si l isotype est IgM, il faut éliminer une pathologie lymphoïde de type MGW, LLC ou lymphome de bas grade. La recherche d un syndrome tumoral ganglionnaire ou hépatosplénique est obligatoire. L échographie abdominale et 69

70 éventuellement un scanner et la BOM si le pic est supérieur à 5g/l, évaluent la prolifération lymphoïde latente. Enfin, il faut toujours évoquer l amylose AL et envisager le cas échéant un prélèvement biopsique (glande salivaire accessoire ou graisse abdominale ou rectum) avec coloration histologique adaptée [98]. Le diagnostic de MGUS posé, il est nécessaire d informer le patient de la nécessité d un suivi annuel clinique et biologique, compte tenu du risque de transformation en MM ou autre lymphoprolifération. Bien entendu, les rares cas de transformations brutales nécessitent une réévaluation rapide en cas d apparition d une symptomatologie clinique [98]. 4. Les facteurs prédictifs de l évolution maligne La disparition d une Igm est une éventualité rare, en dehors des IM transitoires. Dans la majorité des cas ; le taux d Igm reste stable sans symptomatologies associées. Le risque de transformation d une MGUS en une hémopathie maligne est à présent bien précisé. Il est de 10% à 10 ans, 21% à 20 ans, et 26% à 25 ans. Le risque global de progression était de 1 % par an selon la série de Kyle [96]. Certains paramètres sont très utiles pour prédire la probabilité de cette transformation maligne des MGUS, ils sont individualisés dans plusieurs études. Décaux, Avet-Loiseau et Grosbois 2008, ont identifiés 4 facteurs de transformation maligne des MGUS [92] : 70

71 Isotypie de chaînes lourdes (du pic monoclonal) Plusieurs études ont démontré que les patients avec une MGUS à IgA ou IgM ont un risque plus accru à développer un MM ou une autre hémopathie maligne que ceux avec une IgG [92]. Taux de composant monoclonal Le risque d évolution maligne est directement proportionnel à la concentration de la protéine monoclonal au moment du diagnostic, il est évalué à 5.3% à 5ans et à 15.2% à 10 ans lorsque le taux de composant monoclonal est <15g/l, ce risque s élève à 22.1% à 5ans et à 33.7% à 10 ans si le taux du composant monoclonal est 15g/l [99,100]. Plasmocytose médullaire Selon Decaux, la plasmocytose médullaire a été citée comme facteur prédictif de l évolution maligne avec une valeur seuil de 5%. [101] L incidence des hémopathies malignes est presque 2 fois plus importante avec une plasmocytose > 5% par rapport à celle 5%. Dosage des chaînes légères libres sériques Un rapport de chaînes légères libres sériques κ/λ anormal était associé à un risque de transformation plus élevé [99, 100, 102], et plus le rapport est éloigné de valeurs normales, plus ce risque est important [102,104]. 5. Affections associées aux MGUS Les MGUS peuvent être associées à d autres maladies d autant plus qu il s agit d une anomalie qui survient sur une population d âge avancé. 71

72 On en distingue [104, 93,4] : Les maladies hématologiques : maladie de Willebrand acquise, anémies pernicieuse et réfractaire, thrombose veineuse, Les maladies cancéreuses : cancers épithéliaux, Les maladies hépatobiliaires : hépatite chronique, hépatite virales, cirrhose, Les maladies dermatologiques : gangrène polydermique, xanthome plan normocholesterolemique, Les endocrinopathies : hyperparathyroïdie, diabète, Les Maladies auto-immunes : LED, polyarthrite rhumatoïde, syndrome de Gougerot-Sjögren, sclérodermie, spondylarthrite ankylosante, Les infections virales, bactériennes ou parasitaires : cytomégalovirus, virus HIV, virus d Epstein Barr (EBV), tuberculose, amibiase, Les neuropathies périphériques, Autres pathologies associées : Maladie de Gaucher, néphropathies, D- Variantes d immunoglobulinopathies Les gammapathies biclonales sont habituellement rattachées par la plupart des auteurs aux aspects oligoclonaux. Elles sont caractérisées sur l EPP par la présence de deux bandes étroites, homogènes et bien différenciées ; lorsque leur mobilité électrophorétique est très proche, elles ne sont visibles que si le support utilisé est suffisamment résolutif (gel d agarose), et leur identification immunochimique est en général aisée par une technique d IF. Ce type d image apparait le plus souvent lorsque deux clones cellulaires indépendants synthétisent deux populations d Ig monoclonales bien distinctes (le plus souvent de classes différentes et d un même type de chaînes légères), on utilise alors 72

73 dans ce cas préférentiellement au terme de gammapathie biclonale, celui de gammapathie double. Le typage immunochimique des deux Ig en cause doit être réalisé par IF. Selon le contexte justifiant la réalisation d une EPP et en fonction de l importance respective des deux Ig monoclonales visualisées sur l EPP et typées par l IF ; deux cas sont à envisager quant à la signification clinique de l existence dune gammapathies biclonale dans le sérum d un patient : - si l une des deux bandes est prédominante et quantitativement très importante, il s agit en général d une gammapathies biclonale maligne rencontrée dans le cadre des anomalies protéiques d un myélome (IgG ou IgA prédominante), ou d une maladie de Waldenström (IgM prédominante) ; il existe bien souvent dans ce cas une baisse concomitante du taux des Ig physiologiques ; - si les deux Igm sont en faible concentration dans le sérum sans diminution significative des autres Ig, leur présence doit obligatoirement être interprétée en fonction des éléments clinico-biologiques : s il existe un contexte d immunosuppression thérapeutique ou virale, leur interprétation sera identique à celle de tout profil oligoclonal. S il n ya pas notion d immunosuppression, la signification clinique d une gammapathie double est la même que celle d une MGUS souvent associée à des pathologies dont l étiologie peut être très variée [105, 4]. 73

74 74

75 Partie pratique: Notre étude 75

76 Matériels et méthodes 76

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78 I. MATERIELS Il s'agit d'une étude rétrospective portant sur les cas d IM répertoriés au laboratoire de Biochimie de l HMIMV de Rabat sur une période de 9 ans, depuis l an 2000 jusqu à fin décembre 2008, et pour lesquels un dossier médical était exploitable. A- Patients inclus Les registres de l immunotypage (IF et IS) du laboratoire de biochimie de l'hmimv ont été utilisés pour identifier les cas d IM répertoriés dans l ensemble des services depuis l an Les patients, pris en charge au moins une fois dans ces services à l occasion d une consultation ou d une hospitalisation, ont été enregistrés (n=300), mais nous n avons pu inclure dans la présente étude que 214 parmi eux, dont les dossiers médicaux étaient archivés et exploitables. Les patients inclus, sont originaires pour la grande majorité d'entre eux de Rabat, Casa et les environs. Certains sont pris en charge suite à l apparition d un signe évocateur d une IM. Pour d autres, la découverte de la maladie, était fortuite, à l'occasion d un bilan de routine (NFS, VS, Calcémie,...) ou d'un bilan d'extension d'une autre pathologie. Dans tous les cas, chaque patient présentant, à l'électrophorèse des protéines sériques et/ou urinaires, une anomalie évoquant une IM (pic monoclonal, hypogammaglobulinémie, hypoprotidémie, ), a fait l objet d'une exploration biochimique complémentaire. 78

79 B- Caractéristiques étudiées Une fiche d exploitation (cf. annexe) a été renseignée pour chaque patient lors de l analyse de son dossier médical. Cette fiche permet d identifier les caractéristiques épidémiologiques (nom, âge, sexe, origine) ainsi que les résultats des analyses biologiques, objet de l étude : protidémie, EPP sérique (zone de migration, taux du composant monoclonal), recherche et/ou dosage de la protéinurie, immunotypage sérique et urinaire, dosage pondéral des Ig, calcémie corrigée/pt, bilan rénal, β 2 -microglobuline, CRP, VS, hémogramme, myélogramme). C- Démarche diagnostique au laboratoire Il semble intéressant de rappeler ici les étapes d'investigation d une IM suivant la démarche adoptée au laboratoire de biochimie de l HMIMV. Cela constitue la base analytique de notre travail. L exploration biochimique, comme cela a déjà été souligné auparavant, a lieu aussi bien dans le sang que dans les urines avec une démarche similaire. Pour chaque patient, sont réalisés, un prélèvement sanguin effectué sur tube sec (sans anticoagulant) et un recueil des urines dans un tube sans conservateur. Ces échantillons sanguins et urinaires sont acheminés au laboratoire puis centrifugés avant d'être techniqués. Une détermination de la protidémie, de même qu une électrophorèse des protéines sériques, est réalisée. L interprétation du protéinogramme obtenu après validation analytique, est ensuite effectuée par le biologiste. Celui ci décidera 79

80 alors s'il serait nécessaire ou non d'ajouter une exploration complémentaire (figure1). En cas d anomalie évoquant une IM, le jour suivant seront effectués, le dosage pondéral des Ig concomitamment à l F ou IS sur le même échantillon de sérum conservé à +4 C. L analyse des urines suit la même démarche que celle du prélèvement sanguin (recherche et dosage éventuel de la protéinurie, électrophorèse des protéines urinaires et typage du composant monoclonal par IF) (figure 2). 80

81 Présence ou non de signes clinico-biologiques évocateurs (AEG, signes osseux, VS accélérée, hypercalcémie, anémie, syndrome tumoral, IR, ) Dosage de la protidémie (Taux de protides sériques augmenté, hypoprotidémie) Electrophorèse des protéines sériques (Hydrasys/Capillarys) Interprétation visuelle (Gel+tracé) Aspect normal Aucun pic en γ, β ou α Absence d hypogammaglobulinèmie Interprétation GGGGGGFGREWGW visuelle Aspect douteux Anomalie de la zone γ ou zone β augmentée Patient inconnu IF ou IS sérique Aspect anormal Pic bien visible en zone β, γ ou α Patient connu (Suivi) Arrêt des investigations Dosage des IgG, IgA, IgM, κ, λ Commentaires Si suspicion d IM exploration Densitométrie = quantification du pic selon la protidémie Départ du dossier Figure 1: Schéma illustrant la démarche diagnostique dans l exploration d une Igm dans le sérum (Laboratoire de Biochimie, HMIMV) 81

82 Présence ou non de signes clinico-biologiques évocateurs (pic monoclonal sérique, hypogammaglobulinemie ou hypoprotidemie) Recherche et Dosage de la protéinurie Electrophorèse des protéines urinaires (si réactifs disponibles/hydrasys) Interprétation visuelle (Gel+tracé) Aspect normal Aspect normal Aucune bande en β, γ Aucune ne bande en ou α, β, γ ou α, Aspect douteux Bande peu importante ou superposition a d autres protéines Aspect anormal Bande bien visible en zone β, γ ou α Patient inconnu Patient connu Arrêt d investigations IF des urines (Hydragel Bence Jones) Simple densitométrie : quantification de la PBJ selon % protéinurie Commentaires Comparaison avec l exploration du sérum Départ du dossier Figure 2 : Schéma illustrant la démarche diagnostique dans l exploration d une Igm dans les urines (Laboratoire de Biochimie, HMIMV) 82

83 II. METHODES UTILISEES L ensemble des dossiers-patients analysés ont été conservés dans les archives des services concernés sous format papiers, d où la difficulté de les consulter convenablement. A- Paramètres biochimiques analysés Les résultats biochimiques relevés à partir de ces dossiers concernent les paramètres suivants : Le taux des protides totaux sériques, Les données du protidogramme sérique, Le dosage pondéral des Ig associé au rapport kappa/lambda, lorsqu il est calculé, ainsi que d autres tests explorant : - la fonction rénale notamment la créatininémie et l azotémie, - le syndrome inflammatoire avec la CRP, - la β 2 microglobuline pour l évaluation du pronostic. Il est à rappeler que le dosage de ces paramètres en particulier la β 2- microglobuline n a pas été toujours disponible. Dans des situations précises, une recherche de cryoglobulinémie était indiquée. Dès lors, l acheminement du prélèvement au laboratoire et son prétraitement, ont été effectués selon les recommandations requises, déjà évoquées dans la partie théorique. La recherche de la cryoglobulinémie et son typage éventuel sont réalisés au laboratoire selon une démarche bien définie (Figure 3). L envoi au laboratoire d un échantillon d urine obtenu à partir d un recueil de 24h, en même temps que le sérum est exigé mais n a pas été toujours respecté. 83

84 Prélèvement (tube sec) apporté au laboratoire à 37 ºC Coagulation et centrifugation à 37ºC Séparation et conservation du sérum à 4º C et à 37ºC Observation pendant une semaine Apparition progressive d un précipité, d un gel, de cristaux à 4ºC Absence Presence Recherche négative non Soluble à 37 ºC Recherche positive Isolement après lavage Typage immunologique Figure 3 : Schéma illustrant la démarche suivie pour la recherche et le typage des cryoglobulines (Laboratoire de Biochimie, HMIMV) biuret. B- Techniques analytiques Le dosage de la protidémie a été réalisé par technique colorimétrique de Concernant les techniques électrophorétiques utilisées au laboratoire, elles ont connu une évolution durant la période de l étude quant à la nature du support employé, comme cela a été précisé dans la partie théorique : 84

85 85

86 : L acétate de cellulose a été utilisé comme support, Juin 2008: Le gel d agarose a été introduit au laboratoire grâce a l acquisition de l Hydrasys de chez Sebia (Figure 4), Depuis juin 2008 : La technique d EC est employée sur le Capillarys de la même société (Figure 5). Le typage des immunoglobulines monoclonales, initialement effectué par immunoélectrophorèse, a été réalisé par IF sur l Hydrasys. En Juin 2008, la technique d IS adaptée sur le Capillarys a été introduite. Elle est pratiquée particulièrement dans les cas typiques, ne posant pas de problème d interprétation. Nous avons procédé à la détermination du taux du composant monoclonal à partir du tracé électrophorétique. Le dosage pondéral des Ig sériques G, A, M, des chaines légères κ et λ ainsi que la détermination de la concentration de la β 2- microglobuline sérique, ont été réalisés par Immunonéphélémétrie d abord sur BN-100 puis ensuite sur BNprospec de chez Behring (Figure 6). Les dosages de l urée et la créatinine ont été pratiqués sur l Intégra 400 de Roche (Figure 7) et à partir de 2007 sur le Dimension RXL de chez Behring (Figure 8). Dans le tableau I, sont reportés, les noms des trousses de réactifs ainsi que les principes analytiques des différents paramètres biochimiques étudiés 86

87 Figure 4: Automate Hydrasys de chez Sébia (Laboratoire de biochimie et de toxicologie, HMIMV). 87

88 88

89 Figure 5: Automate Capillarys de chez Sébia (Laboratoire de biochimie et de toxicologie, HMIMV). 89

90 Figure 6: Auto-analyseur BN ProSpec de la Société Dade Behring (Laboratoire de biochimie et de toxicologie, HMIMV) 90

91 Figure 7: Auto-analyseur COBAS Interga 400 de la Société ROCHE (Laboratoire de biochimie et de toxicologie, HMIMV) 91

92 92

93 Figure 8 : Auto-analyseur RXL Dimension de la Société Dade Behring (Laboratoire de biochimie et de toxicologie, HMIMV) 93

94 Tableau I : Noms des trousses des réactifs ainsi que les principes analytiques Analyse biochimique Principe analytique Valeurs usuelles Nom de la trousse Fabriquant Protidémie Colorimétrie (réaction de biuret) [64-82g/l] Flex PT Dade Behring EPP Electrophorèse Sur gel d agarose Fig. 9 (A) Kit Hydrazys Sébia EPP Electrophorèse capillaire Fig. 9 (B) Kit Cappilarys protein 5 β1/β2 Sébia Immuno-typage IF Fig. 10 (A) Immuno-typage IS Fig. 10 (B) Hydragel IF Kit cappilarys Sébia Sébia PBJ UIF Fig. 11 Hydragel Bence Sébia Jones Dosage pondéral des Ig Immunonéphélémétrie Tableau II N- Antisérum anti-ig humaines Dade Behring Protéinurie Bandelette réactive Absence Uricheck Test Reactifs Dosage de la protéinurie Colorimétrie (rouge de pyrogallol) <0,15g/24h UCFP Flex Dade Behring Créatinine Colorimétrie (réaction de Jaffé) [6-13mg/l] Flex CREA Dade Behring Calcium Complexométrie [85-101mg/l] Flex CA Dade Behring CRP β 2- M Immunoturbidimétrie Immunonéphélémétrie 3 mg/l Flex CPR Dade Behring [0,7-1,8mg/l] N latex β2m Dade Behring 94

95 des différents paramètres biochimiques étudiés. 95

96 Fractions Albumine Alpha-1 Alpha-2 Beta1 Beta2 Gamma Normes en% ,4-2, ,1-18,8 Normes en g/l Fractions Albumine Alpha-1 Alpha-2 Beta1 Beta2 Gamma Normes en% 55,8-66,1 2,9-4,9 7,1-11,8 4,7-7,2 3,2-6,5 11,1-18,8 Normes en g/l 40,2-47,6 2,1-3,5 5,1-8,5 3,4-5,2 2,3-4,7 8,0-13,5 A B Figure 9: Protidogramme normal (EPP/Hydrasys : A, EPP/Capillarys : B) 96

97 IF (A) IS (B) Figure 10 : Résultat normal de l immunotypage par IF sérique/ Hydrasys (A) et par IS/Capillarys (B) 97

98 Figure 11: Résultat d une recherche négative de la PBJ/IF Tableau II : Normes du dosage pondéral des Ig polyclonales selon la pratique du laboratoire de biochimie de l HMIMV Ig CL G A M κ λ Taux en (g/l)

99 C- Diagnostic étiologique Le diagnostic étiologique repose sur des investigations différentes selon l orientation diagnostique initiale. Nous rappelons ici les critères retenus pour le diagnostic des IM dans la présente étude. En ce qui concerne les MGUS, les critères sont ceux définis par Kyle [106] : - gammapathie monoclonale isolée sans argument clinique ou biologique caractérisant une hémopathie maligne, - taux du composant monoclonal inferieur à 30 g/l, - protéinurie de Bence-Jonces négative ou inferieure à 1g/24h, - hémogramme, taux de calcémie et de créatininémie normaux. Les critères diagnostiques de myélome utilisés sont ceux définis par le groupe international de myélome [54]. Dans les cas de myélome à plasmocytes non excrétant, l étude immunohistochimique des plasmocytes médullaires a permis d objectiver l Igm dans leur cytoplasme et prouver ainsi le caractère monoclonal. Le diagnostic de la maladie de Waldenstrôm est basé sur la présence d une IgM monoclonale supérieure à 5g/l associée à une infiltration médullaire lymphoplasmocytaire. Celui du lymphome repose sur les données histologiques (biopsie ganglionnaire ou ostéomédullaires). Quant aux leucémies à plasmocytes, les critères retenus sont ceux de l OMS et des papiers de référence sur cette pathologie [59]: présence dans le sang périphérique de plus de 2G/L de plasmocytes ou un pourcentage de plasmocyte 99

100 >20% des leucocytes circulants [107]. Le diagnostic de leucémie lymphoïde chronique (LLC) est basé sur l existence d une hyperlymphocytose sanguine et sur les données de l immunophénotypage sanguin. D- Analyse et traitement des données Les données ont été saisies et traitées par les logiciels Excel 2007 et SPSS10.0 pour Windows. Les résultats ont été exprimés par la moyenne ± écart type pour les variables continues et par pourcentage (effectif) pour les variables discontinues. Ils sont reportés dans des tableaux, ou représentés sous formes d'histogrammes, de secteurs ou de barres, La distribution normale des variables continues a été vérifiée par le test Kolmogorov-Smirnov. L analyse de la variance (ANOVA) et le test post hoc ont été utilisés pour la comparaison des variables continues entre groupes, alors que pour la comparaison des variables discontinues on a utilisé un test non paramétrique, le khi-deux. Les résultats sont considérés statistiquement significatifs à partir d une valeur de p

101 Résultats 101

102 I.DIAGNOSTIC ETIOLOGIQUE A- Répartition des cas d IM Les 214 observations de notre cohorte se répartissent, comme l illustre bien le graphique 1, en 2 grandes catégories de populations : Les immunoglobulinopathies monoclonales malignes (IMM) : 133 cas (62%), Les gammapathies monoclonales de signification indéterminées (MGUS) : 81 cas (38%). B- Répartition étiologique des IMM Le graphique 2 et le tableau III représentent la répartition des cas d IMM selon le type d hémopathie maligne en cause. On note la plus forte prédominance du MM, stricto sensu, qui représente à lui seul près de 80% des cas (n=106) répartis en : 75 cas (70.75%) de MM à Ig complète, 27 cas (25.47 %) de MCL, 3 cas (2.83%) de MNE, 1 seule observation de MNS (<1%). La MGW et le lymphome occupent la seconde position avec près de 13 % des cas. Afin de pouvoir mieux exploiter les résultats de la présente étude, nous avons sérié la population des IMM en 3 groupes : 102

103 Le groupe des MM au sens large (n=113), auquel nous avons rattaché les cas de leucémie à plasmocytes (n=3), de plasmocytome (n=2) et de syndrome de POEMS (n=2), La MGW (n=8), Les autres syndromes lymphoprolifératifs (n=12). Aucun cas d IM à chaîne lourde sans association de chaîne légère n a été retrouvé dans cette série. 103

104 Graphique 1 : Répartition de la population selon le type d IM. Graphique 2 : Répartition étiologique des IMM 104

105 Tableau III : Répartition étiologique des IMM Etiologie n % dans IMM % dans IM MM MGW Lymphomes LLC Leucémie à plasmocytes Plasmocytome POEMS Total % MM : Myélome Multiple. MGW : Macroglobulinémie de Waldenstrom. LLC : Leucémie Lymphoïde Chronique. 105

106 II. DONNEES DEMOGRAPHIQUES ET CLINIQUES A- Répartition des IM selon le sexe La série étudiée comprend 153 sujets de sexe masculin et 61 de sexe féminin, soit respectivement 71.5% et 28.5 % de l ensemble des cas. Le sexratio global (H/F) est de Ce ratio H/F est de 2.91 (99 Hommes et 34 Femmes) dans le groupe des IMM, alors qu il est de 2 dans le groupe des MGUS (54 Hommes et 27 Femmes). Les graphiques 3 et 4 montrent la répartition des cas d IM de notre cohorte respectivement selon le sexe puis selon le sexe et le groupe étiologique. Graphique 3 : Répartition de la population selon le sexe. 106