ESTIMATION DES TITRES VIRAUX : UNE PROGRAMMATION PRATIQUE ET FIABLE SUR CALCULATRICE DE POCHE, ET ACCESSIBLE PAR l INTERNET

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1 ESTIMATIO DES TITRES VIRAUX : UE PROGRAMMATIO PRATIQUE ET FIABLE SUR CALCULATRICE DE POCHE, ET ACCESSIBLE PAR l ITERET Jocelyne Husson van Vlet et Ph. Roussel Insttut de la Santé Publque, Brussels, Belgum, jocelyne.husson@ph.gov.be IMEC, SPDT Dvson, Heverlee, Belgum, Phlppe.Roussel@mec.be RÉSUMÉ Les auteurs proposent une méthode basée sur la procédure tératve de ewton-raphson pour estmer la concentraton des suspensons vrales à partr des résultats des essas par eet cytopathque «tout-ou-ren» lés à la courbe dose-réponse. La procédure de calcul ournt l estmaton du maxmum de vrasemblance avec ses lmtes de conance à 95% et détermne la valeur de χ pour tester la qualté de l ajustement. Un programme est présenté (calculatrces HP des séres 4 et 48). Il convent pour les condtons expérmentales les plus varées et est également à présent accessble lbrement sur le ste Internet créé. Estmaton des concentratons vrales; ttre vral cytopathque tout-ou-ren; Maxmum de vrasemblance; lo de Posson, essa de dénombrement par la méthode des dlutons, estmaton du nombre le plus probable ABSTRACT A method or estmaton o vral suspenson concentratons rom the dose-response data yelded by cytopathc eect assays s presented. The maxmum lkelhood equaton vald or such data s solved usng a robust mplementaton o the ewton- Raphson teratve procedure. The method also provdes 95% Revue MODULAD, uméro 34

2 condence bounds on the concentraton and the χ statstc or testng the goodness o t. Programs or the HP4 and HP48 seres handheld scentc calculators sutable to most expermental stuatons are proposed. The sotware s now also reely downloadable rom an Internet webpage. ITRODUCTIO Dans le contexte de la producton de vaccns vraux et de leur contrôle, l est essentel d estmer de manère able le pouvor necteux (et, partant, mmunsant) des suspensons vrales. On peut obtenr une estmaton du ttre necteux d une suspenson de vrons sot par la méthode énumératve (dénombrement des lésons produtes dans des cultures cellulares), sot en utlsant des ttrages dts tout-ou-ren (présence ou absence d eet cytopathque), lés à la courbe de réponse dose-eet. Grâce au développement ntens des mcrométhodes pour la culture cellulare, les essas tout-ou-ren l emportent aujourd hu largement en ttrage de routne (rapdté lée à la mnatursaton et l automatsaton mportantes des équpements, gan en matérel) : dluton en séres d échantllons de la suspenson, noculaton de mcrocultures, relevé du nombre de mcrocultures nectées pour chaque dluton. Ce relevé peut se are par examen sous le mcroscope, ce qu, pour de grandes cadences d essas est long, astdeux et partculèrement éprouvant pour l opérateur du at de l utlsaton réquente d équpements optques tradtonnels encore beaucoup trop rarement adaptés aux exgences ergonomques [Elas, 984, Lee et al, 988, Sllanpaa et al, 003]. Il est également possble de xer et colorer les mcrocultures avant la lecture. La technque de xaton classque utlse une soluton de ormaldéhyde, mas le classement récent de ce composé chmque comme cancérogène pour l homme (groupe ) [IERIS, 004, A.R.Co.P., 004] mpose en vertu des légslatons en matère de sécurté au traval [Réglementaton du ben-être au traval, 004] d applquer au maxmum des technques de xaton al- Revue MODULAD, uméro 34

3 ternatves : la technque de xaton par mcro-ondes a été décrte précédemment [Husson van Vlet, 99 ; 005]. Quel que sot le type d essa chos, la détermnaton d une estmaton able du ttre nal lé à la concentraton vrale nécesste une procédure de calcul adaptée. Ben que de nombreuses méthodes aent été proposées, l est acqus de longue date que les courbes dose-réponse lée à ce type de ttrage se ondent sur la lo de probablté de Posson, et que par conséquent seules les méthodes de calcul basées sur cette hypothèse ournssent des estmatons exactes non entachées de bas [Lauer et al, 945 ; Meynell, 957 ; Ma et al, 963 ; Stellmann et al, 97 ; Husson van Vlet, 986]. Touteos, les procédures publées mplquent d abord la transormaton des données brutes an de lnéarser la relaton dose-eet ce qu ne va pas sans l utlsaton de tables statstques pour approcher la soluton la plus exacte. Il s ensut que la plupart des vrologues accordent dès lors la préérence à des méthodes mons ables, mas d utlsaton élémentare et rapde, au méprs de l exacttude des estmatons. La grande majorté d entre eux néglgent en plus de prendre en compte que l mprécson technque des volumes utlsés dans la procédure de dluton se répercute sur le ttre sous orme d une erreur statstque qu est ben dstncte de celle lée à la dstrbuton aléatore des partcules. Une mprécson technque même able entraîne orcément, de dluton en dluton, une erreur nale non néglgeable [Lorentz, 96 et 96 ; Chase et al., 975 ; Husson van Vlet et al, 988 ; Husson van Vlet et al, 005]. Pourtant, les développements crossants dans les systèmes de programmaton sur les calculatrces dtes «de poche» et la possblté à présent généralsée d accès à l Internet va les ordnateurs personnels ont rendu à l heure actuelle le scentque de laboratore, même novce en la matère, à même de réalser les tratements les plus élaborés et les meux adaptés à ses résultats expérmentaux. Revue MODULAD, uméro 34

4 ous présentons c une soluton exacte pour calculer la concentraton d une suspenson vrale au départ des résultats obtenus par un essa de ttrage par eet cytopathque lé à la courbe de réponse quantale dose-eet. La méthode ournt l estmaton du maxmum de vrasemblance de la concentraton vrale (MLE) ans qu une estmaton de ses lmtes de conance à 95%, et elle détermne la valeur de χ et le nveau de sgncaton correspondant pour tester la qualté de l ajustement. On propose également un programme ntalement prévu pour la HP4C mas à présent adapté pour toutes les calculatrces de la sére HP48. ous avons rendu nos logcels concernant la vrologe accessbles lbrement sur le réseau Internet, après nstallaton et lancement d un «émulateur» HP48G (nstallaton vrtuelle de la calculatrce avec son tableau de bord : Cec permet d exécuter toutes les procédures de calcul que nous avons développées sur calculatrce, mas à l écran du PC, et 0 os plus vte que sur la machne réelle [Husson van Vlet and Roussel, 985, 988 ; Roussel and Husson van Vlet, 988, 99, 99, 005]. FODEMET THÉORIQUE DE LA MÉTHODE DE CALCUL Dans le modèle de la courbe de réponse quantale, conormément à la théore de la partcule unque, on admet que les probabltés de posts (p ) et de négats (q ) à la dluton de nveau c sont donnés par les équatons : cm cm p e q e où m est la concentraton ntale nconnue (dstrbuton type Posson pour de petts nombres) [Dagnele, 973]. La probablté P de la réquence de posts est donc donnée par : n P C p q ( ) ( ) n où n est le nombre total de sujets (dans notre cas, mcrocupules) utlsés au nveau de dluton c. En utlsant s n, cette dernère probablté devent, pour nveaux de dluton : Revue MODULAD, uméro 34

5 ( ) s n q p C & & P L (s l on admet l ndépendance stochastque des ). La probablté condtonnelle de m est alors donnée par : ( ) ( ) ( ) s m c m c 0 s n s n e e dm q p C q p C & & P m L En nous conormant à la méthode du maxmum de vrasemblance [Mather, 965], nous maxmalsons cette oncton en termes de m, ou de manère équvalente, son logarthme naturel : ( ) ( ) 0 e e ln m s m c m c On obtent alors l équaton : ( ) 0 e c n c F m m c () Dérents auteurs ont proposé une soluton approchée de l équaton () par le recours à des tables convenant aux méthodes de régresson pondérées [Fsher et al., 957 ; Wyshak et al., 97]. ous avons prééré approcher la soluton exacte c'est-à-dre la valeur la plus probable de m en utlsant la méthode de ewton-raphson [Steel, 967]. Cette procédure tératve très répandue (connue également sous l appellaton de «méthode de la tangente») utlse une convergence quadratque pour approcher une racne de l équaton en recourant à l algorthme récurs suvant : ( ) 0 x F ( ) ( ) j j j j x F F x x x + Revue MODULAD, uméro 34

6 Pour la soluton de l équaton (), F ( m) devent : F ( m) c e c m c m ( e ) Comme crtère de convergence, les estmatons successves de m sont comparées pour un nombre donné de dgts sgncats. Les calculatrces de la sére HP48 orent un logcel spécque sous le menu SOLVE pour résoudre des équatons comme () en tant que tel à l ade d un algorthme avancé : Pour démarrer le processus térat, nous ne donnons la préérence à aucune des réquences observée comme d autres l ont at : ln( n ) m0 c où n est la proporton la plus proche de 0,8. De telles valeurs de départ sont souvent trop dstantes de la racne de l équaton () pour assurer que la convergence reste stable lorsqu on utlse la méthode de ewton-raphson. Pour obtenr une premère valeur approchée de m auss proche que possble de la racne, on applque une régresson lnéare pondérée par mondres carrés en utlsant les pods W de sorte que la valeur de départ est vrament très proche de la soluton de l équaton (). Il est connu que les relatons dose-réponse vrales sont lnéares dans le système d untés [ ln( c ) ln( ln( s n ))], de sorte que dans ce cas, cette méthode a prouvé être tout à at propre à ournr des valeurs de m ables [Husson van Vlet, 986]. C est en at une méthode accélérée pour obtenr une valeur de m la Revue MODULAD, uméro 34

7 plus exacte possble, surtout s les dstrbutons des résultats des ttrages sont susamment homogènes. S on utlse une calculatrce d une sére orant un set de programmes statstques (comme celles des séres HP 48 par exemple), les résultats sont partculèrement smples à ntrodure. En premer l aut exprmer les données d entrée dans le bon système d untés : [ x ln( c ) y ln( ln( s n ))]. otons que les proportons zéro et un ournssent des résultats en dehors du domane d applcaton. Ce genre de données dot être écarté lorsque l on détermne m 0 par cette méthode. La valeur de m 0 ourne par les mondres carrés est donc détermnée au départ des moyennes pondérées des valeurs y et des x : ln ( m ) 0 W y W W x, où les pods calculés W pour chaque nveau de dluton sont donnés par [Lellouch et al., 968] : W q p ln s ( q ) n ln n s n Cependant, les relatons dose-réponse obtenues expérmentalement peuvent présenter exceptonnellement des anomales telles que des répéttons ou même des nversons dans les proportons n (en cas d ntervalle de dluton trop able par exemple). Dans de tels cas, même la valeur m 0 des mondres carrés pondérés peut être ort élognée de la racne de l équaton (). Du at de la orme de la oncton F ( m), F ( m) dmnue très rapdement au prot des valeurs de m plus grandes que la racne de F (m). C est pourquo, lorsque m0 est trop grand, la procédure tératve de ewton-raphson peut condure à une valeur de traval négatve (Fg.) m j + Revue MODULAD, uméro 34

8 Une soluton adéquate et ort smple de ce problème consste à remplacer m j + par m j (sot la moté de la valeur de traval précédente) chaque os qu elle est négatve. Une autre açon de stablser la procédure est de détermner la racne de F ( m) en tant que oncton de ln ( m) (aucune valeur négatve de m possble), ben que la convergence sot ralente par cette technque, de sorte que nous préérons nettement la premère açon de procéder (notons que dans la plupart des cas, ce problème ne se présente touteos pas!). La méthode décrte permet de détermner une bonne approxmaton de la valeur la plus probable de m, et ce malgré l hétérogénété des données. éanmons, le nombre d tératons devrat être lmté à une valeur maxmum (nous avons chos 30 pour la verson HP4C), an de prévenr des tératons rrégulères et mprévsbles dans les cas expérmentaux les plus déavorables. Le logcel codé dans la HP48 décèle et ntercepte ces cas pathologques. Dans l équaton (), F (m) est exprmé comme la dérence de deux sommes, dont l une n est pas une oncton de m (c'est-àdre la somme de gauche). La procédure de ewton-raphson requert l évaluaton de F ( m) pour dérentes valeurs de m. An d accélérer la vtesse d exécuton de la procédure de calcul (ce qu est un acteur lmtat mportant lorsque l on mplémente des processus térats sur de telles calculatrces), l est possble de calculer le terme constant avant de mettre en applcaton le processus d tératon et de le mémorser pour ensute l utlser lors de chaque estmaton de F ( m) : celle-c consste alors en la soustracton au terme constant de la somme de drote dans l équaton (). Touteos, cec accroît l eet de perte de chres sgncats, surtout quand chacun des termes c n dans la somme de gauche est presque contrebalancé par le terme correspondant dans la somme de drote. ous préérons donc calculer F (m) de la manère suvante : c e ( ) c n 0 F m c m Revue MODULAD, uméro 34

9 Suvant la méthode du maxmum de vrasemblance décrte plus haut, les lmtes de conance de l estmaton de m pourrat être obtenues par la résoluton de : P mˆ Δm < m < mˆ + Δm & & L ( ) m c m c m ( e ) ( e ) Δm c m c m s ( e ) ( e ) mˆ +Δ mˆ 0, qu nous donne la probablté condtonnelle en termes de Δ m. L utlsaton de la soluton exacte pour détermner les lmtes de conance de m n est pas envsageable sur la calculatrce de poche HP4C du at que cela requert des temps de calcul trop longs. Dans la verson HP4C, nous avons donc prééré utlser une ormule approchée et détermner la varance de ln (m) en utlsant [Wyshak et al., 97]: σmˆ W Dans la verson HP48, l équaton () est eectvement résolue en utlsant à nouveau le logcel sous le menu SOLVE, en partant de la valeur Δ m0, 96 σmˆ. Le programme ournt en normaton nale la valeur du χ pour vérer la bonne qualté de l ajustement, avec les degrés de lberté correspondants. Ces valeurs sont calculées à l ade de la ormule classque comparant les données observées et celles calculées : ( ) n qˆ s ( n pˆ ) χ + n qˆ n pˆ avec degrés de lberté. La verson HP48 calcule auss le nveau de sgncaton correspondant. DISCUSSIO On a proposé de nombreuses méthodes permettant d estmer le pouvor necteux d une suspenson de partcules vrales, au Revue MODULAD, uméro 34 s dm dm ()

10 départ d un ttrage par eet cytopathque. Certanes d entre elles sont graphques, d autres ont appel à une nterpolaton assez élémentare, et d autres encore requèrent des transormatons mathématques qu nécesstent les tratements les plus sophstqués. Toutes ces méthodes ont été dscutées en proondeur tant en termes de ben-ondé théorque, de leurs condtons d applcaton, leur ecacté, leur sûreté, leur précson, etc [Halvorson et al., 933 ; Cochran, 950 ; Irwn, 950 ; Armtage et al., 950 ; Fnney, 957 ; Stellman et al., 965], et la concluson essentelle d mportance pratque est que les varatons entre les estmatons obtenues par ces dérentes méthodes sont généralement ables [Bross, 950 ; Berkson, 950]. Cette concluson a évdemment encouragé de nombreux vrologues à utlser en routne les procédures de calcul les plus élémentares, et à gnorer les autres possbltés plus élaborées. Cette tendance est partculèrement dangereuse et ore largement le lanc à la crtque. Tout d abord, réérons-nous à Jerne [949] qu a rappelé les hypothèses essentelles à la mse en applcaton de n mporte quelle procédure de calcul. Une os l assurance acquse que ces condtons sont ben remples, l approche scentque est évdemment l utlsaton de méthodes compatbles avec la lo de Posson qu régt la dstrbuton des partcules vrales dans les suspensons et est donc la seule qu convenne aux ttrages vraux. Même en consdérant que des procédés de calcul smples débouchent sur des estmatons approxmatvement équvalentes, leur possblté de mse en applcaton est sévèrement rédute s l on souhate évter tout rsque d obtenton de résultats basés. On a montré que la condton sne qua non d utlsaton de ces procédures élémentares est que les condtons d applcaton strctes nécessares à leur ablté soent rgoureusement remples. Une des méthodes les plus réquemment utlsées est le recours à l estmateur dt de Spearman-Kärber [Kärber, 93 ; Johnson et al, 96]. An de pouvor l applquer, les dlutons Revue MODULAD, uméro 34

11 dovent cependant être également espacées sur une échelle logarthmque, avec un nombre égal de sujets par nveau de dluton, et la gamme de dlutons utlsée dot contenr les proportons de réponses extrêmes de 0 et 00%. Or, du at de acteurs expérmentaux déavorables varés, l arrve réquemment que l une (vore plus) de ces condtons n est pas satsate ce qu rend l utlsaton de l estmateur très dangereuse. Plus grave encore, l n est pas mpossble que se présente une varablté très mportante dans les proportons observées ce qu condut névtablement également à des bas regrettables dans les estmatons de ttre et d erreur [Husson van Vlet, 986]. En eet, l applcaton de la ormule de Spearman-Kärber a pour base la somme globale des sujets posts relevés dans le domane de dluton adéquat et ne prend nullement en compte les varatons possbles dans leur dstrbuton de par les dérentes dlutons. Cec peut être llustré par l exemple suvant. Dans un essa qu utlse des étapes de dluton log-décmales de -3 à -6, chacune comptant 0 cupules (ou sujets) noculées, nous obtenons une somme de 6 cupules postves qu peuvent se dstrbuer déremment sur les quatre nveaux de dluton tout en ournssant systématquement la même estmaton de ttre 0 5,0, alors que les estmatons du maxmum de vrasemblance peuvent quant à elles varer de 0 4,63 à 0 5,5 du at des dérentes possbltés de dstrbuton de ces réponses postves le long du domane de dluton envsagé. C est pour cela qu l est vvement recommandé d utlser les procédures de calcul les plus ables qu restent valdes quelles que soent les varatons dans les résultats expérmentaux. La méthode que nous proposons c est paratement compatble avec la lo de dstrbuton possonnenne. Elle utlse une procédure d approxmaton exacte, rapde, sans recours à aucune table. Les condtons de son applcaton ont été choses susamment larges pour englober le nombre maxmum possble de condtons expérmentales : l ntervalle de dluton peut varer en ampltude, les dérentes dlutons peuvent être exprmées sous orme entère ou sous orme logarthmque, et Revue MODULAD, uméro 34

12 même le nombre de sujets peut présenter des varatons suvant les dlutons. Depus la premère valeur approchée jusqu à la soluton nale, l est également possble de présenter en achage au cours des tératons les valeurs successvement estmées de m. Cette dernère opton, qu s ajoute aux lmtes de conance de l estmaton de la concentraton et à la valeur du χ mesurant la qualté de l ajustement, rend la méthode présente largement plus avantageuse que les programmes présentés précédemment [Koch, 98 ; Mac Donell, 983 ; Russel et al, 983] en orant ans au scentque l opportunté de se rendre compte par lu-même de la conance qu l peut accorder à ses résultats expérmentaux. Même le plus modeste des laboratores de vrologe peut de nos jours acquérr une machne programmable adéquate, ou meux encore, nstaller sur son PC va l Internet l émulateur qu lu permet d accéder sans problème à la calculatrce vrtuelle et à toutes ses applcatons. Il dsposera ans d un outl de traval ndspensable et remarquablement perormant. En eet, la prolératon des ordnateurs type PC, portables ou non, équpés des logcels statstques les plus courants très smplement utlsables même par des novces en cette matère, et d autre part l accès à présent généralsé au réseau Internet nous a ncté à grouper nos logcels concernant la vrologe et à les rendre accessbles lbrement sur le réseau Internet, après nstallaton et lancement d un «émulateur» HP48G (nstallaton vrtuelle de la calculatrce du modèle actuel avec son tableau de bord : Cec permet d exécuter toutes les procédures de calcul que nous avons développées précédemment sur la calculatrce, mas à l écran du PC, et 0 os plus vte que sur la machne réelle [Husson van Vlet and Roussel, 985, 988 ; Roussel and Husson van Vlet, 988, 99, 99]. Des rensegnements complémentares y relats peuvent être obtenus auprès des auteurs. Pour l applcaton présente, le lstng complet du programme de calcul peut être obtenu auprès des auteurs, dont l un d eux Revue MODULAD, uméro 34

13 (Ph.J.Roussel) a développé par alleurs un projet dans le domane des composants électronques et dspose également d un programme en RMB-UX réalsé pour ordnateur dans le contexte d analyse de test de ablté et de données de rodage. Les technques utlsées pour la maxmalsaton des onctons de maxmum de vrasemblance sont touteos quelque peu plus complquées dans ce cas, mas les statstques utlsées à la base suvent la même lgne de rélexon que celles dscutées présentement. Les présentes consdératons ne sont nullement à caractère publctare dès lors qu l ne s agt pas dans le cas présent de logcels commercalsés. APPEDICE : EXEMPLE Dluton (d) Log(d) n s ΣDAT nput data matrx Callng the MLE program Revue MODULAD, uméro 34

14 FIGURE Screen output F (m) Fgure. Graphque de llustrant la dvergence de la méthode de ewton-raphson quand m0 est trop large. Revue MODULAD, uméro 34

15 RÉFÉRECES A.R.Co.P news (004) Lettre d normaton de l Assocaton Royale des Consellers en Préventon, Le ormaldéhyde : cancérogène pour l homme, 4, p.6. Armtage, P. and Allen, I. (950) Methods o estmatng the LD50 n quantal response data, J. Hyg. 48, Berkson, J. (950) Some observatons wth respect to the error o bo-assay, Bometrcs, 6, Bross, I. (950) Estmates o the LD50: a crtque, Bometrcs, 6, Chase, G.R. and Hoel, D.G. (975) Seral dlutons : error eects and optmal desgns, Bometrka 6, Cochran, W.G. (950) Estmaton o bacteral denstes by means o the most probable number, Bometrcs, 6, Dagnele, P. (973) Théore et Méthodes Statstques, pp.94-00, Presse Agronomques de Gembloux, Belgum. Elas, R. (984) Traval sous bnoculares. Astrentes vsuelles et posturales, Cahers de notes documentares, n 7-4ème trmestre, Fnney, D.J. (957) Statstcal method n bologcal assay, p. 54. Grn, London. Fsher, R.A. and Yates, F., (957) Statstcal Tables or Bologcal Agrcultural and Medcal Research, pp , Olver and Boyd, London. Revue MODULAD, uméro 34

16 Halvorson, H.O. and Zegler,.R. (933) Applcaton o statstcs to problems n bacterology. I. A means o determnng bacteral populaton by the dluton method. Journal o Bacterology, XXV (), 0-. Husson van Vlet, J. and Roussel, P. (985) Estmatng vral concentratons : a relable computaton method programmed on a pocket calculator, Computers Methods and Programs n Bomedcne,, Husson van Vlet, J. (986) Ttraton o polovaccnes : mprovement o end-pont mcroassays by means o doseresponse curves. Journal o Vrologcal Methods, 3, 9-0. Husson van Vlet, J. and Roussel P. (988) Ppettng errors n vral ttratons : a useul approach, Journal o Vrologcal Methods,, Husson van Vlet, J. (99) Mcrowave radaton : a useul xaton method n vral vaccne quanttaton, Journal o Vrologcal Methods, 3, Husson van Vlet, J. (005) Le ormaldéhyde, cancérogène pour l homme! Alternatve avantageuse à la xaton par ormalne : utlsaton des mcro-ondes, Revue de l assocaton belge des technologues de laboratore ABTL/BVLT, Vol 3, 3, Husson van Vlet, J. and Roussel, P. (005) Comment évaluer de manère pratque et able les erreurs de ppettage dans les ttrages vraux? Revue de l assocaton belge des technologues de laboratore ABTL/BVLT, Vol 3, 4, IERIS (004) Seuls de toxcté agüe, Formaldéhyde (CH O), rapport nal, IERIS-DRC ETSC-BDon 03DR0, 38 p. Revue MODULAD, uméro 34

17 Irwn, J.O. (950) Bologcal assays wth specal reerence to bologcal standarts, J. Hyg. 48, Jerne,.K. and Wood, E.C. (949) The valdty and meanng o the results o bologcal assays, Bometrcs, 5, Johnson, E.A. and Brown Jr. B.W. (96) The Spearman estmator or seral dluton assays, Bometrcs, 7, Kärber, G. (93) Betrag zur kollektven Behandlung pharmakologsher Rehenversuche, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 6, Koch, A.L. (98) Estmaton o the most probable number wth a programmable pocket calculator, Appled and Envronmental Mcrobology, Lauer, M.A. and Prce, W.C. (945) Inecton by vruses, Arch. Bochem Lee, K.S., Wakar, A.M., Wu, L. (988) Physcal stress evaluaton o mcroscope work usng objectve and subjectve methods, Internatonal Journal o ndustral ergonomcs,, 3, Lellouch, J. and Lazar, P. (968) Cours pour le certcat d études statstques applquées à la médecne (opton D), Faculté des Scences, Pars. Lorentz, R.J. (96) Über den Enluss des Ppetterehler au de Genaugket be der Konzentratonsmessung von Vruslösungen, Arch. Ges. Vrusorsch. 0, Lorentz, R.J. (96) Über de expermentellen Fehler be der Volumenabmessung mt Ppetten, Arch. Ges. Vrusorsch. 0, Revue MODULAD, uméro 34

18 MacDonell, M.T. (983) Rapd estmaton o most probable number wth a hand-held calculator, Canadan Journal o Mcrobology, 9, Ma, K. and Bontz, K. (963) Statstcal varaton ound at pock and plaque countng o vaccna vrus, ature Mather, K. (965) Analyse statstque en bologe, pp Gauther-Vllars, Pars. Meynell, G.G. (957) Inherentely low precson o nectvty ttratons usng a quantal response, Bometrcs Réglementaton du ben-être au traval (004) : la lo et le code sur le ben-être au traval et extrats du règlement général pour la protecton du traval, Publcaton du Servce publc édéral Emplo, Traval et Concertaton socale, 496 p. Roussel, P. and Husson van Vlet, J. (988) Estmatng vral concentratons rom dluton counts : weghted least squares estmate o densty, takng nto account both Possonan varaton on the mean counts and s-normal errors on the dlutons, Bométre-Praxmétre, 8, 9-4. Roussel, P. and Husson van Vlet, (99) Estmatng vral concentratons rom dluton counts, Journal o Vrologcal Methods, 34, Roussel, P. and Husson van Vlet, (99) Estmatng vral concentratons rom dluton counts: an mproved HP48SX verson o the 'MLE' program, Journal o Vrologcal Methods, 37, Russel, E. and Colwell, R.R. (983) Computaton o most probable numbers, Appled and Envronmental Mcrobology, 45(5), Revue MODULAD, uméro 34

19 Sllanpaa, J., yberg, M., Lappala, P. (003) A new table or work wth a mcroscope, a soluton to ergonomc problems, Appled ergonomcs, 34, Stellmann, C. and Terre, J. (965) Chox d une méthode de calculs statstques en vue des contrôles d actvtés des produts bologques sur anmaux, Bull. Soc. Sc. Vét. Méd. Comparée, 67, Steel, E. (967) Introducton à la mathématque numérque, Dunod, Pars, 967. Wyshak, G. and Detre, K. (97), Estmatng the umber o Organsms n Quantal Assays. Appled Mcrobology, p (n Appendx). Revue MODULAD, uméro 34