LES HORLOGES CIRCADIENNES

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1 LES HORLOGES CIRCADIENNES Ces horloges sont très anciennes puisqu on les trouve déjà chez les cyanobactéries. On les trouve aussi chez Neurospora, chez les plantes supérieures, la drosophile, les poissons, mammifères. Chez presque tous les organismes vivants on va pouvoir identifier un rythme d horloge circadien. I- Le concept d anticipation adaptative Face à une perturbation on va avoir des mécanismes qui vont permettre à l organisme de s adapter (les poissons qui sont capables de s adapter à la fois à l eau de mer et à l eau douce) ou pas (les poissons qui ne peuvent vivre qu en eau douce ou salée). On parle ici de perturbation imprévisible. On a d'autres types de perturbations dites récurrentes : elles vont se reproduire régulièrement. L organisme qui est exposé régulièrement peut utiliser la prévision pour s adapter = préadaptation ou adaptation anticipative. L organisme sait que la perturbation se reproduit régulièrement et il a développé un système permettant de répondre à cette perturbation. Exemple : les saisons, le cycle jour/nuit (luminosité, température, ) beaucoup de paramètres environnementaux vont être modifiés. II- Les rythmes circadiens Quand on parle d horloge biologique, on parle d un système qui peut fonctionner indépendamment d un repère temporel externe. Circadien < Circa diem = à peu près le jour = à peu près 24h rythmes qui ont une périodicité de 24h. Ils résultent de la rotation terrestre qui impose à presque tous les organismes terrestres cette variation régulière de toute une série de paramètres biotiques et chimiques. Quand les premiers organismes sont apparus sur la Terre, elle tournait déjà pression évolutive. - Chez bactéries : rythme de bioluminescence - Chez les plantes : rythmes jour/nuit de la photosynthèse - Chez la drosophile : rythme locomoteur - Chez les vertébrés : rythme veille/sommeille, température corporelle, sécrétion hormonale, métabolisme, division cellulaire Expérience : On a pris chez des poulets (vertébrés) des glandes pinéales (= glandes endocrines qui sécrètent une hormone : la mélatonine qui a un rôle dans le sommeil et la reproduction, et qui est sécrétée principalement pendant la nuit) qui se trouvent généralement au-dessus du cerveau chez les oiseaux, poissons directement photosensibles. la fois le rythme circadien et le rythme saisonnier. Hormones dont la sécrétion est circadienne : - ACTH - GH = hormone de croissance - Prolactine - Mélatonine - Cortisol - Testostérone On a un rythme circadien LD 12 : 12 (Light Dark 12 : 12). Si jour court (période hivernale) : la mélatonine va être sécrétée en période plus longue et inversement en période estivale. La mélatonine est un moyen pour l organisme de savoir l heure qu il est. Elle sert également d indicateur du moment de la nuit puisque sa concentration varie. C est une hormone traduisant à

2 Le cortisol est aussi une hormone importante : variation circadienne, avec augmentation pendant la deuxième partie de la nuit. Elle est au maximum avant le réveil. Caractéristiques des rythmes circadiens - Période d environ 24h : il y a un petit mystère ce n est jamais vraiment 24h - Fonctionnement en libre-cours : on a un organisme chez lequel on observe un rythme, ensuite on prive cet organisme de repère temporel (cycle jour/nuit) et l on va continuer à observer le rythme. On met un organisme en cycle nuit/jour de 24h synchronisé avec oscillation du paramètre. Puis nuit à nouveau et ensuite jour subjectif libre-cours, mais l oscillation persiste mécanisme endogène, ce n est pas le cycle jour/nuit qui commande directement la suppression du paramètre. Il va juste servir à ajuster la position du rythme. La capacité de fonctionner en libre-cours est une caractéristique essentielle. Par exemple au moment du passage à l heure d hiver : on a resynchronisé notre horloge. - Synchronisé par le cycle lumineux - Processus cellulaire autonome : on a un système qui s intègre du niveau moléculaire jusqu à l organisme entier, voir la population. - Compensation thermique : Q 10 (= de combien augmente une réaction pour un écart de 10 C) proche de 1 Le mécanisme de l horloge circadienne échappe un peu à cette loi : si on fait varier la température de 10 C, on ne note pas un changement d activité : il n y a aucun effet de la température. Cela permet à l organisme de rester synchronisé avec l environnement quelque soit la température. Les paramètres d un cycle circadien - Tous les rythmes circadiens se modélisent par une oscillation sinusoïdale - La fenêtre de temps entre 2 maximums ou 2 minimums = la période «τ» - Si on prend toutes les valeurs et qu on fait la moyenne, on obtient le niveau moyen appelé mesor - On a l acrophase = position du pic par rapport à une référence temporelle (appelé ZTX) - L amplitude est l écart entre le niveau maximal et l axe des abscisses Quand on étudie le rythme circadien on parle d heure ZT (< Zeitgeber = synchroniseur). Au début de la phase lumineuse on a ZT0. Le début de cette phase lumineuse est TOUJOURS la référence. Au début de la nuit on a ZT12. Puis a nouveau ZT0 lorsque la lumière revient. Classement des rythmes en fonction de leur période - CIRCADIEN = 20h < τ < 28h - ULTRADIEN = τ < 20h - INFRADIEN = τ > 28h (rythme de reproduction, rythme de 7 jours) Comment mesure-t-on les rythmes circadiens? Rythme de l activité locomotrice : un des plus simples à utiliser Modèle le plus simple : la drosophile - On place une mouche dans un petit tube en verre, installé dans un système ou un rayon infrarouge passe à travers le tube. La mouche va passer son temps à marcher. L enregistrement dure 7 jours. - Si on a une alternance lumière/obscurité, la mouche va avoir de l activité principalement pendant la phase lumineuse et particulièrement au début et à la fin les mouches font la sieste. - A partir de la flèche rouge : on coupe l alternance jour/nuit : on met les animaux en libre-cours. On s aperçoit alors que tous les jours on va un peu

3 plus «vers la gauche» elle va se mettre à marcher un petit peu plus tôt tous les jours. Cela est dû au fait que la période est d environ 24h (un peu inférieur pour la mouche) c est l horloge endogène qui gère le cycle. En libre-cours o Un organisme qui a une période d un peu moins de 24h va avancer son cycle o Un organisme d une période un peu plus supérieur à 24h va retarder son cycle - Chez les rongeurs on peut utiliser l activité volontaire ou spontanée. Ici on utilise l'activé volontaire. - On place l animal dans une roue métallique et à chaque fois que la roue fait un tour, l ordinateur enregistre. - On parle d activité volontaire, car l animal va dans la roue que lorsqu il en a envie. - On obtient un actogramme : chaque blanc est un vide, et le noir = nombre de tour par unité de temps - La souris ne fait pas la sieste : l activité est très concentrée - Cette souris a une activité nocturne : à ZT12 les souris vont s amuser dans la roue (pendant une grande partie de la nuit). - A partir du 5 ème jour on laisse la lumière éteinte on va garder la rythmicité activité/repos. Mais on va observer un glissement «vers la gauche» car sa période est inférieure à 24h. Si on rallume la lumière, l activité va à nouveau se resynchroniser. III- L horloge centrale Où est-elle? - Chez drosophile (invertébrés) o On a des neurones éparpillés tout le long de la zone céphalique o Ces neurones sont responsables et spécialisés dans les rythmes - Chez les mammifères o zone ventrale de l hypothalamus regroupements de neurones appelés noyaux (1000 neurones par noyaux), qui sont juste au-dessus du chiasma optique = Suprachiasmatiques. o Chez mammifères les informations arrivent par le tractus rétinohypothalamique o La rétine a donc 2 fonctions : transmission de l information visuelle et de l information photique non-visuelle qui est utilisée pour la remise à l heure de l horloge biologique. o Cellules ganglionnaires : ce sont ces cellules qui sont spécifiquement impliquées dans les sensations non-visuelles photiques On a pris des souris que l on a mises en obscurité constante temps CT On regarde à CT10 et CT22 : on a un signal très fort de l expression de Per 2 o La production de signaux électriques par des neurones o Ces neurones sont les seuls à pouvoir avoir une activité électrique régulière o On a une horloge centrale dans l hypothalamus qui va contrôler Le rythme de la mélatonine L ANS (= Système Nerveux Autonome) qui va gérer la température Des glandes endocrines comme la surrénale (production de cortisol) La lumière qui entre dans la rétine et va permettre par l intermédiaire du tractus la synchronisation On a démontré qu il existait des horloges dans les organes périphériques également! - Des chercheurs californiens ont construit des mouches artificielles avec des gènes horloges qui contrôlent la synthèse de la GFP et ils se sont aperçu que la mouche est entièrement verte alors que l on s attendait à ce qu elle n ait que des points verts au niveau du cerveau.

4 - On enregistre l expression de la GFP au cours du temps. La GFP est un indicateur de l activité de l horloge - Ces chercheurs ont pris la mouche et ont mit les ailes, la tête et les pattes dans des boîtes différentes on continue à avoir une fluctuation de la fluorescence l horloge fonctionne toujours! Notion d HORLOGES PERIPHERIQUES Le mécanisme d horloge est présent dans le SNC, mais aussi dans la périphérie. On regarde l expression d un gène : le signal est-il plus ou moins fort au cours du temps? - On utilise des cellules en culture (isolées depuis plus de 30 ans) - On détecte une activité de l horloge sur 24h Une horloge circadienne comprend trois composants principaux - Composant central = l oscillateur : permet l oscillation régulière de 24h, indépendamment du cycle externe jour/nuit - Il y a une synchronisation de cet oscillateur par rapport au rythme externe jour/nuit - Ce système synchronisé doit avoir une fonction biologique : il doit donc contrôler des fonctions biologiques/physiologique ce sont les voies sortantes. Quand se met en route cette horloge? - Cela va dépendre des organismes, des groupes o Mammifères : pendant les trois premières semaines de la vie post-natale (jusqu à P21), la neurogenèse va avoir lieu. On ne parvient donc pas à remarquer des rythmes de 24h avec une amplitude assez forte et répondant aux caractéristiques. On a donc une mise en place tardive o Chez les poissons (poisson zèbre) : on a pu mettre en évidence une rythmicité très précoce et très forte (bien avant qu il ne commence à s alimenter, pendant le développement embryonnaire). La glande pinéale, endocrine, sécrète la mélatonine qui joue un rôle dans l adaptation aux saisons et est sécrétée pendant la nuit quand les nuits sont courtes elle est sécrétée moins longtemps : indique à l organisme que c est l été, et inversement pour l hiver important pour les organismes à reproduction saisonnière. La rétine et la glande pinéale sont très impliquées dans l horloge circadienne chez les vertébrés. Expérience : étude sur le rythme d éclosion (qui se fait à une heure relativement précise) - On prend des mouches sauvages et on réalise une mutagénèse - On essaye de trouver des mutants capables de transmettre génétiquement des défauts dans l horloge - Chez WT : on a un maximum d éclosion en début de phase lumineuse, avec des pics périodiques de 24h - Per 0 : on ne peut pas détecter de pic à un moment précis de la journée - Per S (short): la période se raccourci elle est inférieure à 24h - Per l (long) : les pics s écartent allongement de la période Les propriétés de l horloge biologique sont donc contrôlées génétiquement

5 Expérience sur la locomotion: Quand les Per 0 sont en rythme jour/nuit : tout va bien, mais en absence de repères temporels il n y a plus de rythmicité. Il a fallu presque 10 ans pour comprendre ce qu il y avait derrière Per 0 - Identification du gène Période = Per, puis transcription en ARNm - ARNm = bilan entre synthèse et dégradation de l ADN - Transcription = vitesse à laquelle l'adn polymérase fonctionne rythmique - Analyse de 3 paramètres de ce gène o Point noir = transcription : on voit que la transcription du gène est rythmique avec une acrophase vers ZT14 o Ronds blancs = ARNm Per : acrophase décalée de 2 ZT ZT16 o Petits points = protéines PER : l expression de la protéine est rythmique - Avec une telle cinétique, on a la signature possible d un feed-back négatif o Le gène Per produit une protéine PER qui va rétrocontrôler sa propre production On a ensuite identifié un autre gène avec la même approche : Timeless = Tim - Les mutations per et tim donnent le même phénotype - Les deux protéines PER et TIM forment un complexe - Les gènes Per et Tim sont contrôlés de la même manière Il y a des domaines et en particulier 2 domaines d'interaction. On fait la même approche chez les mammifères (souris) - On met chaque souris dans une cage avec une roue et on analyse l activité locomotrice - Il a fallu analyser souris pour en trouver 1 qui avait l actogramme «Clock/Clock» - La mutation est sur une seule base : A T qui se trouve juste sur le site d'épissage, ce qui fait qu'il manque un exon, la protéine est tronquée.

6 - La protéine Clock est un facteur de transcription car dans la protéine on trouve un petit domaine qui reconnait l ADN pour réguler les gènes (la transcription) - Une fois que le gène et la protéine Clock ont été découverts on a remarqué que Clock ne fonctionnait pas tout seul mais qu il avait un partenaire : BMAL - Clock et BMAL forment un complexe transcriptionnel activateur (= il augmente la transcription) qui est capable de reconnaitre l ADN : il va donc reconnaître des éléments de réponses (E-box) présent dans les régions régulatrices des gènes périodes. On en a 3 sur 1kb - Quand on a un gène chez les invertébrés, on a plusieurs équivalents chez les vertébrés appelés des PARALOGUES, qui sont ORTHOLOGUES de l équivalent chez les invertébrés. Chez les mammifères on a donc trouvé 3 gènes périodes équivalents d un point de vue structural et fonctionnel. - Clock et BMAL activent la transcription de Per1 - On a comme protéines o Clock o BMAL o PER 1/2/3 o CRY ½ - On regarde la transcription de Per1 : o Clock/BMAL + CRY 1 absence de transcription - Quand il y a peu de protéine PER : elle est dégradée - Quand il y en a assez elle peut aller dans le noyau - La boucle doit intégrer un retard/un délai dans l inhibition. La boucle Per est celle qui régule l horloge de 24h Chez les mammifères on a un système un peu plus complexe : une autre protéine intervient Il y a un orthologue chez la drosophile pour Clock et BMAL. Expression avec 2 pics chez la drosophile. Souvent dans des groupes différents, pour résoudre une même question on va utiliser des gènes et des protéines différentes. La transcription utilise différents éléments du promoteur per. Ceux qui possèdent la b-box peuvent activer PER.

7 Quels sont les effets de cet oscillateur moléculaire? - Soleil = synchronisation externe - Horloge jaune = oscillateur central (SNC) - Flèche entre grosse et petites horloges = synchronisation interne - Petites horloges = oscillateurs périphériques - Rythmic biological processus = physiologie Dans chaque organe les gènes exprimés rythmiquement sont spécifiques. Le synchroniseur central va synchroniser les horloges internes. On a un système hiérarchique à 2 étages. Quand on analyse l'expression rythmique des gènes, dans chaque organe plusieurs centaines de gènes sont exprimées avec un rythme de 24h. (par exemple dans le foie on trouve au moins 500 gènes exprimés de façon rythmique). Chez les mammifères, la synchronisation lumineuse se fait UNIQUEMENT par la rétine. Chez les invertébrés, au moins chez le poisson zèbre, il y a une photoréception périphérique. Il y a beaucoup de conditions qui vont affecter ce système circadien: - Décalage horaire chronique (équipage naviguant) - Le travail de nuit - Alimentation surchargée en graisse - Le stress - Le vieillissement Il y a de plus en plus d arguments qui relient les rythmes circadiens à des pathologies: - Maladie du sommeil - Maladie cardiaque - Cancer - Dépression Le sommeil 2 composantes - Homéostasique

8 - Circadienne : on va plus facilement s endormir la nuit que le jour Exemple de l avance de phase : 1 er travail qui a permit de mettre en avant une mutation de gène chez l Homme - Analyse d une famille dans laquelle des membres avaient un syndrome de phase o Une mutation dans le gène Per2 humain est la cause d une maladie du sommeil FASPS o Per2 ne peut pas être phosphorylée, elle est donc moins dégradée et elle se rend ainsi plus vite dans le noyau on avance l horloge.