Marqueurs biologiques des hépatites auto-immunes

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1 Marqueurs biologiques des hépatites auto-immunes Autoimmune hepatitis : serologic markers Y. Calmus* P O I N T S F O R T S P O I N T S F O R T S La présence, dans cette maladie, d autoanticorps mutuellement exclusifs a permis de définir trois types d hépatite auto-immune. On dispose d un score de l International Autoimmune Group permettant de poser le diagnostic avec un bon degré de certitude. Le traitement d'attaque permet d obtenir une disparition ou une diminution significative des anticorps dans 80 % des cas des HAI en un à trois mois. TOUTES les HAI ont des caractéristiques cliniques, biologiques et histologiques similaires (1, 2). La présence dans cette maladie d autoanticorps (AA) mutuellement exclusifs a permis de définir plusieurs types d'hai (tableau I). Les AA détectés lors d'une HAI sont principalement les anticorps (Ac) antinucléaires (AAN), les anti-lkm1 (ALKM1), les Ac anticytosol hépatique (ALC1), et les Ac antimuscle lisse de type anti-actine (AML). Bien que les cibles antigéniques de ces AA ne soient pas spécifiques du foie, les trois derniers sont des marqueurs sensibles et spécifiques des HAI. Ils peuvent, cependant, apparaître dans les autres hépatopathies non auto-immunes, en particulier l hépatite C et les hépatites médicamenteuses (tableau II) (3, 4). La présence d AA ne permet donc pas de se soustraire à la recherche d'autres diagnostics. CLASSIFICATION DES HAI À L'AIDE DES AUTOANTICORPS La présence dans cette maladie d AA mutuellement exclusifs a permis de définir plusieurs types d HAI (tableau I) (5, 6). Le type 1 est caractérisé par la présence d'aan et/ou d AML. * Clinique chirurgicale, hôpital Cochin, Paris. L HAI de type 2 est caractérisée par la présence d ALKM1, alors que les AAN et le AML y sont habituellement absents. Un troisième type d HAI serait caractérisé par la présence d Ac dirigés contre un antigène soluble du foie (ASLA) (6,7). Enfin, un quatrième type d HAI, caractérisé par l absence d AA, peut être décrit (8). Cependant, dans le type 3 et dans l HAI sans AA, les patients ont les mêmes caractéristiques cliniques et biologiques que ceux de l HAI de type 1 (9). HAI de type 1 Dans l HAI de type 1, les AAN sont les anticorps le plus fréquemment retrouvés. Ils sont homogènes dans 35 % cas et moucheté dans 35 % des cas (10). La présence d AAN de type moucheté serait pour certains associée à un pronostic plus défavorable (10). Dans certains cas, il existe des Ac anti-centromères ou anti-ro. Les AML sont présents dans environ 80 % des cas, mais ils peuvent être isolés dans au moins 25 % des cas (11). Ces AML sont des Ac anti F-actine. La détection des Ac antiactine peut se faire directement par un test Elisa ou par un test d immunofluorescence sur des cellules Hep2 (lire infra). La présence d Ac antimitochondries à titre faible est observée dans 20 % des cas, et ne doit pas faire remettre le diagnostic en cause. HAI de type 2 Les ALKM1 sont caractéristiques de l HAI de type 2 (12, 13). Présents dans 85 % des cas, ils sont associés dans 30 % des cas aux ALC1. Dix pour cent des HAI-2 ont un ALC1 isolé (14). Tableau I. Caractéristiques des trois types d HAI. Type I II III AA AAN, AML ALKM1 ASLA A-actine (A-LC1) Femme 70 % 90 % 90 % Âge adulte 2-14 ans ans Maladie AI associée < 40 % 40 % 50 % Cirrhose 25 % 50 % 25 % La lettre de l hépato-gastroentérologue - n 5 - vol. VI - septembre-octobre

2 Tableau II. Autoanticorps et maladies du foie (D après Clifford. Hepatology 1995). HAI de type 3 Les ASLA sont caractéristiques de l HAI de type 3 (7). Ils sont classiquement dirigés contre les cytokératines 8 et 18. L analyse protéomique permet d en déterminer les cibles précises. Cette HAI de type 3 n est pour certains qu une forme particulière d HAI de type 1 (9). Pour d autres, les ASLA sont associés aussi bien à l HAI de type 2 qu à l HAI de type 1. Les ASLA pourraient être associés à un risque de rechute plus élevé après réduction des corticoïdes. Autres AA D autres AA ont été décrits au cours des HAI, mais leur intérêt n est pas encore clairement déterminé. C est en particulier le cas des Ac anti-asialoglycoprotéine, des Ac anti-cytoplasme de polynucléaires neutrophiles (ANCA) et des Ac anti-histones. HAI sans AA Dans un pourcentage de cas difficile à préciser, il n existe pas d autoanticorps (8). Ces formes d HAI s apparentent aux HAI de type 1. MÉTHODES DE RECHERCHE DES AA ANA + AML + Hépatite C chronique 15 % 34 % Hépatite B chronique 14 % 9 % HAI 69 % 80 % Maladie alcoolique 5 % 13 % Témoins (sans hépatopathie) 6 % 3 % Immunofluorescence indirecte (IFI) sur coupes de foie/rein/estomac de rat La plupart des AA importants pour le diagnostic des pathologies hépatiques auto-immunes, mis à part les Ac anti-sla, peuvent être mis en évidence par cette technique. Les coupes de tissus utilisées peuvent être commerciales ou fabriquées au laboratoire. Les différents Ac sont identifiés d après leur localisation et leur aspect de fluorescence au niveau des trois organes. L association de plusieurs tissus est indispensable pour pouvoir identifier correctement les AA. AML. Ils sont ainsi dénommés en raison de leur marquage des fibres musculaires lisses, sur l estomac (marquage homogène des fibres musculaires de la musculaire muqueuse et de la musculeuse), le foie (marquage de la membrane des hépatocytes donnant un aspect polygonal), le rein (fluorescence au niveau des glomérules ainsi que dans l espace péritubulaire), et la couche moyenne des artères au niveau des trois organes. L identification des Ac anti-actine peut être confirmée par IFI sur cellules Hep2. ALKM1. Ils sont ainsi dénommés car ils réagissent avec le cytoplasme des hépatocytes et de la troisième portion des tubules proximaux (fluorescence de type granulaire). Il n y a pas de marquage au niveau de l estomac. ALC1. Ils donnent une fluorescence cytoplasmique du foie, épargnant les hépatocytes autour des veines hépatiques. L AA identifié par l aspect de fluorescence est ensuite titré. Le seuil de positivité correspond au titre de 1/40 pour les ALKM1 et anti-lc1 de 1/80 pour les AML. Détection des Ac anti-actine : IFI sur cellules Hep2 Les lames utilisées peuvent être commerciales ou réalisées avec des cellules cultivées au laboratoire. Les cellules sont directement cultivées sur lame dans un milieu contenant de la colchicine. Après lavage et fixation à l acétone, les lames sont séchées et conservées à - 80 C. Les sérums sont testés au 1/20. En présence d AML anti-actine, l ensemble de la cellule est traversé et déformé par de longs câbles droits d actine. D autres AA donnant une réactivité avec le muscle lisse peuvent être identifiés sur cellules en culture, notamment les Ac anti-vimentine qui montrent une positivité de la vimentine rétractée par la colchicine autour du noyau. Ces Ac, qui ne sont pas spécifiques, sont décrits dans de nombreuses pathologies (notamment hépatites virales A et B, maladies parasitaires, maladies de système). Détection des ALKM1 et des ALC1 Plusieurs techniques existent. Elles utilisent soit des extraits solubles de microsome ou de cytosol hépatique, soit les protéines antigéniques : CYP2D6 ou formiminotransférase cyclodésaminase. La technique de base est l immunodiffusion double en gélose d Ouchterlony. Des fractions microsomales et cytosoliques sont obtenues par fractionnement cellulaire. La contamination possible d une fraction par une autre nécessite une réaction d identité avec des sérums de référence (ALKM1 isolé et ALC1 isolé). La détection des Ac anti-lkm1 et anti- LC1 par immunoempreinte (western-blot) utilise les mêmes fractions antigéniques. En immunoempreinte, les ALKM1 correspondent le plus souvent à une bande de 50 kda qui s est avérée correspondre au cytochrome P450 IID6. Cette technique est peu utilisée pour le diagnostic médical. Des études plus précises ont permis de déterminer que les ALKM1 étaient, dans la majorité des cas, dirigés contre une région très précise de cette molécule située au niveau des acides aminés 254 à 271 (13). Des dosages immuno-enzymatiques Elisa permettent la détection des ALKM1. Des antigènes différents peuvent être utilisés : CYP2D6 recombinant exprimé dans des cellules eucaryotes ou dans E. coli, peptide synthétique correspondant à la séquence d AA L Elisa utilisant le peptide synthétique est moins sensible que les techniques utilisant un CYP2D6 recombinant. Les dot-blots associant la recherche d ALKM1/Ac anti-m2 ou 184 La lettre de l hépato-gastroentérologue -n 5 - vol. VI - septembre-octobre 2003

3 d ALKM1/ALC1/Ac anti-m2 se développent du fait de leur intérêt en seconde intention. Les Ag les plus utilisés sont le CYP2D6 recombinant, la fraction cytosolique et la PDH (pour le diagnostic de la cirrhose biliaire primitive). Détection des ASLA La détection des ASLA nécessite un test Elisa d inhibition utilisant la fraction cytosolique de foie de rat, ces Ac n étant pas détectables par IFI. Les résultats sont calculés en pourcentage d inhibition de la fixation du sérum de référence sur l antigène par les ASLA. Un sérum est considéré comme positif à partir d un pourcentage d inhibition supérieur ou égal à 40 %. Spécificité de la détection des AA La présence des ALKM1, ALC1 et ASLA en IFI est exceptionnelle chez les sujets sains (incidence de l ordre de 0,1-0,3 %). Seuls les AML non anti-actine sont mis en évidence à titre bas chez plus de 10 % des sujets sains. Les AML non anti-actine sont également retrouvés dans de nombreuses pathologies : infections virales, maladies systémiques auto-immunes, cancers. Les AML de type actine peuvent aussi être rencontrés dans d autres pathologies : hépatites virales B, C, hépatites médicamenteuses, cirrhose biliaire primitive et cholangite sclérosante primitive (formes mixtes). Sous traitement médical, la disparition des Ac anti-actine fait partie des critères diagnostiques de guérison. La présence des ALKM1 et ALC1 est spécifique de l HAI de type 2. Le titre de ces AA varie selon le stade de la maladie et le traitement utilisé. Les ASLA sont très spécifiques de l HAI (spécificité > 99 %). Ces AA sont particulièrement intéressants à rechercher lorsque l IFI sur triple substrat est négative. L IFI est la méthode de détection la plus utilisée. Elle a pour avantage de permettre la détection globale de l ensemble des marqueurs, mais elle nécessite l utilisation d une technique de confirmation. L immunodiffusion est apparue plus sensible que l IFI pour la détection des ALKM1 et ALC1. De plus, les ALC1 peuvent être difficiles à mettre en évidence par IFI en cas d association aux ALKM1. Le western-blot détecte mal les Ac anti-cyp2d6 conformationnels (surtout hépatite C). AUTRES MARQUEURS L origine de l HAI est inconnue. L hypothèse la plus couramment admise fait appel à la présence d un terrain génétique prédisposant sur lequel un événement de l environnement pourrait avoir un rôle déclenchant. La notion de prédisposition génétique repose sur la présence d allèles HLA plus fréquemment constatés en cas d HAI. Il s agit, en particulier, de l haplotype A1-B8-DR3, dont la présence s accompagne d un risque relatif d HAI de type 1 de 2. Chez les sujets DR3-, l allèle DR4 est alors un facteur prédisposant indépendant. Cette prédisposition génétique a été retrouvée au niveau génique et il a alors été montré qu une séquence particulière de la chaîne DRß (séquence LLEQKR) était fortement associée à la survenue d une HAI de type 1. Cette association d une séquence particulière d une molécule HLA-DR avec une maladie auto-immune suggère que cette molécule pourrait être un bon présentoir pour des antigènes particuliers capables de déclencher la maladie. Outre son rôle prédisposant, l haplotype HLA A1-B8-DR3, et plus précisément les allèles B8 et DR3, ont un rôle pronostique. Chez les sujets B8+ et DR3+, l HAI débute habituellement plus tôt, s accompagne de lésions histologiques plus sévères et de rechutes plus fréquentes. En revanche, l allèle DR4 est associé à une maladie biologiquement et histologiquement moins sévère, mais à la présence de marqueurs fréquents d autoimmunité (titre élevé d autoanticorps, hypergammaglobulinémie élevée, maladies auto-immunes fréquentes). L événement déclenchant est inconnu. Un médicament pourrait jouer ce rôle. L hypothèse d un virus déclenchant est actuellement l hypothèse la plus fréquemment retenue. Ce virus pourrait agir par mimétisme, une séquence d un épitope viral étant commune avec une séquence d une molécule autologue. L association la plus connue entre HAI et virus est celle existant entre l HAI de type 2 et le virus de l hépatite C. Dès la découverte du virus C, il a en effet été constaté une fréquente positivité de la sérologie virale C parmi les patients atteints d HAI de type 2. Cependant, un grand nombre de ces cas se sont avérés être de fausses réactions positives de l Elisa. Le diagnostic d hépatite virale ne peut reposer, dans ce cas, que sur la positivité de la PCR du virus C. Dans la majorité des cas, la coexistence d une PCR positive et d anticorps anti-lkm1 correspond à la présence de titres faibles d ALKM1au cours d une véritable hépatite C. Dans ces formes, l antigène cible des ALKM1 s avère d ailleurs différent de la cible des ALKM1 présents au cours des HAI de type 2. Dans de rares cas, hépatite C et HAI semblent pouvoir être associées. SCORE DE L INTERNATIONAL AUTOIMMUNE HEPATITIS GROUP (IAIHG) Dans certains cas, le diagnostic d HAI est difficile. En 1992, un comité international (International Autoimmune Group) a établi un score permettant de poser le diagnostic d HAI avec un bon degré de certitude. Ce score tient compte des principaux éléments du diagnostic positif, mais également des diagnostics à éliminer. De plus, il tient éventuellement compte de la sensibilité aux corticoïdes, de sorte qu il existe un score avant traitement, mais aussi un score après traitement, voire après rechute en cas d arrêt du traitement, ce qui est un argument important en faveur d une HAI. Ce score a été validé sur un total de près de 600 patients atteints d HAI. La spécificité du test a également été appréciée en appliquant le score à 242 patients atteints d hépatite C et à 143 patients atteints de maladies cholestatiques diverses. Lorsque les formes certaines étaient considérées (score avant La lettre de l hépato-gastroentérologue - n 5 - vol. VI - septembre-octobre

4 traitement > 15), la sensibilité du score n était que de 54,8 à 81,8 % ; en revanche, la spécificité du score était de 100 % lorsqu on considérait un groupe de patients atteints d hépatite C, et de 96,6 à 98,2 % lorsqu on considérait le groupe des patients atteints de maladies cholestatiques. Lorsque les formes probables étaient considérées (score 10 et < 15), la spécificité du score n était que de 87 à 92 % pour le diagnostic d hépatite C, et de 45 % à 65 % pour les maladies biliaires (CBP, CSP, CAI). Dans les cas litigieux, les faux-positifs ne reposaient généralement que sur des scores ne dépassant que d un ou deux points la limite inférieure de l intervalle (10 points). Les éléments conduisant à ces faux diagnostics étaient essentiellement la présence d autoanticorps, un rapport PAL (phosphatases alcalines)/transaminases anormalement faible, une augmentation Tableau III. Score clinico-biologique de l International Autoimmune Hepatitis Group. Sexe Auto-Ac (AAN, AML, ALKM) (5) masculin 0 > 1/ féminin + 2 1/ M. auto-immune associée (1) + 2 1/ Prise de médicament (2) < 1/40 0 oui - 4 Anticorps anti-mitochondries + histologie - 4 non + 1 Alcool Nécrose parcellaire + 3 < 25 g/j + 2 Infil. lymphoplasmocytaires + 1 > 60 g/j - 2 Rosettes + 1 Marqueurs viraux (3) Aucun de ces signes - 5 absents + 3 Signes biliaires (6) -3 positifs - 3 Autres signes (7) -3 G-globulines > 20 g/l + 3 Autres marqueurs (8) g/l + 2 Autre autoanticorps g/l + 1 HLA DR3 ou DR4 + 1 <10 g/l 0 Pal/ALAT ou ASAT (4) Dg certain > 15 < 1,5 N + 2 Probable : 10 à 15 1,5-3 N 0 > 3 N - 2 Traitement Réponse complète + 2 Rechute à l arrêt + 3 Dg certain > 17 Probable : 12 à Présence d une autre maladie auto-immune chez le patient ou chez un parent du premier degré (voir tableau I). 2. Prise récente ou en cours d un médicament connu comme étant hépatotoxique. 3. Marqueurs des virus A, B et C. En cas de doute, les marqueurs des virus EBV et CMV doivent être réalisés. 4. PAL et transaminases ALAT ou ASAT exprimées en multiples de la valeur supérieure de la normale. 5. Titres déterminés par immunofluorescence indirecte sur coupes tissulaires de rongeurs, ou sur cellules Hep2 pour les AAN. 6. Signes biliaires : signes évidents de CSP ou de CBP, prolifération néoductulaire, cholangiolite ou dépôts de cuivre. 7. Autre marqueur histologique évoquant une autre étiologie que l HAI. 8. Les points pour la présence d un autre autoanticorps connu pour être associé à l HAI (2 points) ou celle du marqueur HLA DR3 ou DR4 (si ce marqueur est disponible) (1 point) ne sont attribués qu'en cas de négativité des autoanticorps conventionnels. Ces anticorps comportent les panca, anti-lc1, anti-sla, anti-asialoglycoprotéines, anti-lp et anti-sulfatide. Un point peut être attribué pour un autre groupe HLA de classe II connu comme étant associé à l HAI dans des ethnies particulières. 186 La lettre de l hépato-gastroentérologue -n 5 - vol. VI - septembre-octobre 2003

5 modérée des immunoglobulines. La sensibilité était alors de 97,3 à 100 %. Depuis la première réunion de l IAIHG, d autres ont eu lieu, lors de congrès internationaux. Une deuxième mouture du score de l IAIHG a été publiée en 1999 (tableau III) (15). Cette dernière publication a apporté quelques modifications substantielles, ayant pour but d augmenter la spécificité du score. Les principales ont porté sur la discrimination avec les maladies cholestatiques (CBP, CSP) ; pour cela, un poids plus grand a été donné à la biologie (rapport PAL/transaminases), à la présence ou non d anticorps anti-mitochondries, et surtout à l histologie : les marqueurs classiques d HAI (nécrose parcellaire, infiltrat lymphoplasmocytaire, hépatocytes en rosettes) ont acquis un poids important et, en contrepartie, ceux des maladies cholestatiques un poids négatif important. Les modifications introduites n ont cependant été testées que chez 114 patients atteints de CSP. De plus, les critères utilisés pour affirmer le diagnostic d HAI dans ces cas n ont pas toujours été communiqués. Les chiffres de spécificité (89,5 % en considérant les diagnostics probables ) sont donc donnés sous toute réserve. L intérêt affiché de ce test est diagnostique. Il a pour but de permettre le diagnostic dans les formes atypiques ou incomplètes, et d uniformiser les critères diagnostiques dans les futures études contrôlées. Il n aborde cependant pas certains problèmes diagnostiques difficiles : hépatites virales avec présence d autoanticorps, et formes intriquées (overlap syndromes). EFFET DES TRAITEMENTS SUR LES PARAMÈTRES BIOLOGIQUES Les AA (AAN, AML, ALKM1) sont corrélés au degré de réponse immunitaire et aux transaminases, au cours des HAI (16). La corrélation avec les lésions histologiques n a pas été établie. Le traitement d attaque par les corticoïdes permet d obtenir une rémission (avec disparition des anomalies biologiques) dans 80 % des cas des HAI, en un à trois mois (1, 2). Les anomalies biologiques associées à l HAI disparaissent habituellement après TH : l augmentation des gammaglobulines et la présence d AAN dans un délai de 3 mois, les AML un peu plus tardivement. La possibilité d une récidive de l HAI a été décrite en Pour certains, cette récidive atteint 10 à 40 % des cas. La détection de cette récidive repose surtout sur la réalisation de biopsies systématiques. La réapparition des anomalies biologiques, notamment la présence d AA, peut être plus tardive que les signes histologiques. L hépatite auto-immune de novo (HAIDN) est caractérisée par l apparition d une dysfonction du greffon, associée à des signes évocateurs d HAI. L HAIDN peut être associée à des AAN, des AML, des ALKM1 et des ASLA. Les patients atteints d HAIDN ont un pronostic spontané défavorable à court terme. La corticothérapie améliore considérablement le pronostic, comme dans les HAI spontanées. Dans une série, les patients non traités ont perdu leur greffon en 6 mois après l apparition de l HAIDN. En revanche, les patients traités par corticoïdes étaient vivants avec leur greffon après un délai de 4 ans. Il existe un risque de rechute à l arrêt ou à la réduction du traitement, et une nouvelle rémission peut être obtenue après réintroduction des doses antérieures de corticoïdes. Deux formes d HAIDN semblent individualisables : une forme à début aigu, d évolution rapidement défavorable, associée à des titres élevés d ALKM1 et des transaminases élevées (> 500), et une forme plus progressive, associée à des titres faibles ( 1/80) d AAN et AML. Mots clés. Antinucléaires - Anti-LKM1 (ALKM1) - Anti- LC1 - Anti-SLA - Ac anti-muscle lisse de type anti-actine (AML). Antinuclear - Anti liver-kidney microsomal - Anti liver-cytosolic antigen 1 - Anti soluble liver antigen - Anti smooth muscle targeting actin. R É F É R E N C E S B I B L I O G R A P H I Q U E S 1. Czaja AJ, Freese DK. Diagnosis and treatment of autoimmune hepatitis. Hepatology 2002 ; 36 : Krawitt EL. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med 1996 ; 334 : Clifford BD, Donahue D, Smith L et al. High prevalence of serological markers of autoimmunity in patients with chronic hepatitis C. Hepatology 1995 ; 21 : Homberg JC, Abuaf N, Helmy-Khalil S et al. Drug-induced hepatitis associated with anticytoplasmic organelle autoantibodies. Hepatology 1985 ; 5 : Manns MP, Kruger M. Immunogenetics of chronic liver diseases. Gastroenterology 1994 ; 106 : Strassburg CP, Manns MP. Autoantibodies and autoantigens in autoimmune hepatitis. Semin Liver Dis 2002 ; 22 : Manns M, Gerken G, Kyriatsoulis A, Meyer zum Büschenfelde KH. Characterization of a new subgroup of autoimmune chronic active hepatitis by autoantibodies against a soluble liver antigen. Lancet 1987 ; 1 : Czaja AJ, Carpenter H, Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen, P450IID6, and mitochondrial complexes in chronic hepatitis. Gastroenterology 1993 ; 105 : Czaja AJ. Chronic active hepatitis : the challenge of a new nomenclature. Ann Intern Med 1993 ; 119 : Czaja AJ, Nishioka M, Morshed SA, Hachiya T. Patterns of nuclear immunofluorescence and reactivities to recombinant nuclear antigens in autoimmune hepatitis. Gastroenterology 1994 ; 107 : Fusconi M, Cassani F, Zauli D et al. Anti-actin antibodies : a new test for an old problem. J Immunol Methods 1990 ; 130 : Homberg JC, Abuaf N, Bernard O et al. Chronic active hepatitis associated with anti-liver/kidney microsome antibody type 1 : a second type of autoimmune hepatitis. Hepatology 1987 ; 7 : Manns MP, Griffin KJ et al. 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