Programme canadien d adaptation agricole Rapport final Nom du requérant :

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1 Programme canadien d adaptation agricole Rapport final Nom du requérant : Grain Farmers of Ontario (GFO) Titre du projet : Caractérisation moléculaire et physiologique de la résistance partielle du soya à la moisissure blanche Coordonnateur de Gordon Stock programmes de l AAC : Numéro du projet : CAAP 0103 Période visée par le rapport : Rapport final Date de soumission : 21 novembre 2013 Sommaire 1. Résumez brièvement les activités financées dans le cadre de ce projet en mettant l accent sur les réalisations et résultats clés obtenus. Votre sommaire devrait répondre aux questions suivantes : Voici les activités financées dans le cadre de ce projet : Construction et analyse de banques d ADNc pleine longueur, et analyse de séquences d ARN de tissus foliaires confrontés à l isolat n o 1980 de S. sclerotiorum (Ss) dans des variétés partiellement résistantes et vulnérables de soya Analyse des changements physiologiques pendant l infection de Ss 1980 pour déterminer comment le pathogène influe sur différentes réactions physiologiques dans les variétés vulnérables et partiellement résistantes; détermination de l accumulation de lignine Publication de données et caractérisation moléculaire de moisissure blanche du soya pour aider les phytogénéticiens à évaluer leurs souches généalogiques et leurs variétés Caractérisation physiologique du soya Le pathosystème de S. sclerotiorum permettrait de formuler de nouvelles stratégies pour intégrer une résistance partielle à la moisissure blanche dans les variétés commerciales de cultivars de soya et ceci peut également aider à élaborer des stratégies de sélection pour d autres cultures hôtes. (a) Quels sont les réalisations/résultats réels ainsi que toute conséquence imprévue? Résultats Analyse au microscope Des expériences de microscopie photonique toutes les 24 heures pendant une période de 7 jours ont été réalisées. Plusieurs indications de vulnérabilité ont été observées sur OAC Shire (génotype réceptif). Certaines de ces indications sont des détériorations de l épiderme et du cortex de la tige 48 heures après l inoculation (hpi) avec une grande accumulation d amidon sur les couches des cellules en dessous de ces zones, la formation de primordia de sclérotes 7 jours après l inoculation (dpi) et des pores de stomates ouverts dans des zones à proximité d invasions hyphales. Des évaluations de l accumulation du grain d amidon, des dépôts de lignine, de la formation de coussins d infection et des sites de pénétration du pathogène ont été effectuées. Pour OAC Shire, les coussins d infection sont apparus à partir de 48 hpi avec une grosse accumulation d amidon près de ces sites. Une pénétration directe comme point d entrée pour le pathogène était dominante. Toutefois, pour ce génotype particulier, on a remarqué une pénétration en se servant de la base de trichomes. Des évaluations sur OAC Salem (génotype partiellement résistant) ont également été effectuées. Pour cette souche, seule une pénétration directe au point d entrée pour la moisissure blanche a été observée et la détérioration de l épiderme et du cortex a commencé seulement à 72 hpi. Pour ce génotype, il n y a eu aucune différence dans l accumulation d amidon au cours des périodes de temps analysées et les stomates sont restés fermés jusqu à 48 hpi. L analyse au microscope a aussi été effectuée sur les deux génotypes et les résultats montrent que Sclerotinia sclerotiorum (Ss) commence la formation de sclérotes sur les feuilles et les tiges infectées à 9 dpi sur OAC Shire. De plus, des symptômes de flétrissement sont observés sur tout le plant pour ce génotype à ce moment. Pour OAC Salem, on n a observé aucun sclérote à 9 dpi et des symptômes de flétrissement ont atteint seulement le site d inoculation en remontant. Conductance stomatique Des expériences pour mesurer la conductance stomatique ont été conçues et réalisées. Les résultats montrent qu OAC Shire a tendance à accroître la conductance stomatique, et donc les symptômes de flétrissement, avec la progression de l infection la plus grande conductance stomatique se produisant à72 hpi. Pour OAC Salem, la tendance n est pas si claire et pour cette raison, les symptômes de flétrissement pour cette souche apparaissent seulement après 72 hpi et ne sont pas observés dans les premières feuilles trifoliées (en dessous du site de l infection).

2 Mesures physiologiques Le poids frais et le poids sec ont été mesurés à 5 et 12 dpi. Pour les deux génotypes, de petites valeurs ont été signalées à 12 dpi pour le poids frais avec des différences importantes entre les étapes temporelles. Pour le poids sec, aucune différence importante n a été observée entre les contrôles (plants non inoculés) et les traitements respectifs. L aire sous la courbe de développement des chancres (AUCPC) a été calculée en mesurant la longueur des lésions toutes les 24 heures pendant 8 jours. Aucune différence importante n a été observée lorsque les cultivars vulnérables et partiellement résistants ont été comparés. Les symptômes liés à la maladie, comme la gravité du flétrissement et le nombre de jours jusqu au décès du plant, étaient significativement moins graves dans les cultivars partiellement résistants. Caractérisation moléculaire La préparation et le séquençage de la banque d ADNc ont été réalisés pour évaluer les expressions différentielles des gènes entre les cultivars vulnérables et les cultivars partiellement résistants en se servant de techniques de séquençage de la prochaine génération (séquence ARN). Les résultats des séquences d ARN ont montré une différence de base dans l expression des gènes entre OAC Shire et OAC Salem partiellement résistant. Plusieurs gènes liés aux mécanismes de défense des plants ont été régulés de manière positive sur le cultivar partiellement résistant aussi tôt que 1 jour après l inoculation lorsque comparé avec la souche vulnérable (comme la tyrosine-kinase (Glyma01g ), phosphatidyl inositol-kinase (Glyma01g01620)). Au troisième jour après l inoculation, les gènes de chitinase de classe I (Glyma02g ) et de peroxidase (Glyma01g ) ont été régulés de manière positive sur des tissus foliaires partiellement résistants. En général, il a été conclu que les gènes liés aux mécanismes de défense ont été exprimés plus tôt sur les cultivars partiellement résistants lorsque comparé avec la souche vulnérable. Nous continuons d analyser les données de manière plus approfondie car ces données ont été envoyées du laboratoire de Sick Kids Hospital, qui a effectué l analyse des séquences d ARN, seulement en octobre Essais sur le terrain avec des souches et variétés de soya Un total de 30 souches et variétés de soya ont été plantées dans deux emplacements Elora et Harrow (en Ontario). Pour le premier, une inoculation artificielle de S. sclerotiorum a été faite avec la méthode du grain d orge (Auclair et al., 2004). On s attendait à une infection naturelle pour Harrow mais des conditions météorologiques défavorables ont empêché S. sclerotiorum d infecter les plants. Les résultats fournis par l indice de la gravite de l infection à Elora ont indiqué qu OAC Shire était le cultivar le plus vulnérable dans le groupe de souches analysées. OAC Wellington et OAC Belgrave ont été les variétés les plus résistantes et elles seront utilisées lors de futurs programmes de sélection pour développer de nouvelles variétés de soya qui sont partiellement résistantes à la moisissure blanche. (b) Quelles leçons ont été apprises? Cette information est fournie ci-dessus. (c) Quels facteurs ont contribué au succès ou à l échec du projet? La sélection appropriée de matériel végétal, de méthodes et de concepts expérimentaux ont contribué au succès de ce projet. (d) Quelles sont les prochaines étapes? (Ce ne sont pas tous les projets qui auront des étapes subséquentes mais il y a souvent des activités planifiées à la fin du projet qui sont un résultat direct ou indirect du projet.) L utilisation d outils/de marqueurs moléculaires et physiologiques pour faire la sélection de la résistance au pourridié sclérotique du soya (moisissure blanche) sera la prochaine étape du projet. On prévoit que ces nouveaux outils permettront de développer une résistance meilleure et plus durable à la moisissure blanche dans les nouvelles variétés de soya. (e) Est-ce que la solution ou la stratégie sera mise en œuvre plus à fond ou est-ce que le produit, le processus ou la technologie novateur/novatrice sera probablement adopté(e) par le secteur? Si vous avez répondu oui à la question ci-dessus, décrivez les prochaines activités prévues. Si vous avez répondu non, expliquez pourquoi.

3 Oui. Ceci est déjà expliqué dans (d). Objectifs et activités 2. Fournissez une mise à jour sur tous les objectifs du projet énumérés à l annexe B Partie I de l entente. Si certains objectifs n ont pas pu être réalisés, veuillez expliquer pourquoi. Objectifs : 1. Identifier, à l aide de techniques de génétique moléculaire, quels gènes sont exprimés dans une variété partiellement résistante et lesquels sont exprimés dans la variété vulnérable lorsque la moisissure blanche est présente. Atteint 2. Pour déterminer les changements physiologiques qui peuvent se produire pendant l infection, étudier les symptômes de flétrissure et la fermeture des stomates. Atteint 3. Fournissez une mise à jour sur toutes les activités énumérées dans le plan de travail du projet à l annexe B Partie II de l entente dans le tableau ci-dessous (ajoutez d autres lignes au besoin). Si certaines des activités n ont pas pu être achevées, veuillez décrire tout défi ou risque posé par l activité qui a influé sur la réalisation de l activité. Décrivez comment vous avez atténué ces défis ou risques ou comment vous prévoyez les traiter à l avenir. Activités Activité 1 : Construction de banques d ADNc pleine longueur, et dépistage par microréseau avec des tissus foliaires pour comparer les changements dans l expression des gènes entre des génotypes de soya partiellement résistants (comme OAC Kent) et vulnérables (comme OAC Shire) 8, 16, 24 et 48 heures après l incubation en se servant de l isolat no 1980 de S. sclerotiorum. Activité 2 : Données à analyser et à normaliser à l aide du progiciel R-MAANOVA. Activité 3 : Détermination des changements physiologiques pendant l infection de Sclerotinia sclerotiorum (Ss). Des feuilles de plantes partiellement résistantes et vulnérables seront inoculées avec le pathogène et les plantes seront infectées avec Mise à jour finale sur les résultats ainsi que sur les défis et risques posés La construction de banques d ADNc pleine longueur a été achevée et le séquençage d échantillons a été réalisé en se servant d un séquençage de prochaine génération (séquences d ARN). Les données ont été prétraitées pour enlever les adaptateurs Illumina et contrôler la qualité. La méthode Bowtie a été utilisée pour cartographier les données sur le génome de référence (génome GMAX-189, Phytozome). Des échantillons ont été prélevés et les résultats ont fait l objet d analyses statistiques. Date d achèvement (réelle ou prévue) Degré de réalisation de l activité (%) 15/09/ % 15/10/ % 30/09/ %

4 des isolats marqués de protéines vertes fluorescentes (GFP) de Ss pour identifier comment le pathogène empêche les stomates de fermer. Activité 4 : Détermination de l accumulation de lignine avec une méthode utilisant l extraction de lignine et un acide thioglycolique (Doster et Bostock, 1988) et en faisant un examen histochimique des plantes inoculées et non inoculées avec le Ss à différents points dans le temps. Activité 5 : Essais sur le terrain de souches partiellement résistantes (OAC Kent) et vulnérables (OAC Shire) qui sont utilisées dans la caractérisation moléculaire contre une gamme de souches généalogiques et de variétés de soya dans deux champs du Sud-Ouest de l Ontario qui ont connu des infections de moisissure blanche. Activité 6 : Publication de données et caractérisation moléculaire de moisissure blanche du soya pour aider les phytogénéticiens à évaluer leurs souches généalogiques et leurs variétés. Des échantillons ont été prélevés et analysés. 30/09/ % Les taux de maladie ont été mesurés dans 30 souches et variétés de soya pour déterminer le degré de résistance ou la vulnérabilité à S. sclerotiorum. Les données de toutes les activités seront publiées une fois que les résultats auront fait l objet d analyses statistiques. Des données de caractérisation physiologique ont été présentées lors des assemblées annuelles internationales d ASA/CSSA/SSSA, du 3 au 6 novembre 2013, à Tampa, Floride, É.-U. 30/08/ % 04/11/ % parce que certaines des données n ont pas été obtenues rapidement et que nous sommes encore en train de les analyser. Nous planifions de les publier dans un journal en mai Identifiez les intrants du projet utilisés pour réaliser les activités (y compris les contributions financières, d autres types de financement gouvernemental, les ressources en personnel, d autres ressources, etc.). Si vous n avez pas eu accès à tous les fonds du PCAA, ou si votre budget actuel est différent du budget approuvé, expliquez pourquoi et décrivez les raisons de ces variations. Toutes les catégories qui sont en dessous du budget ou qui dépassent le budget prévu devraient être discutées. Nous avons utilisé les fonds fournis par l AAC et GFO en tant que requérant et partenaire de l industrie depuis le début du projet. De plus, Evelyn a utilisé sa bourse d études HQP du MAAO/MAR. Aucune autre aide financière n a été obtenue pour le projet de tierces parties car les fonds du PCAA étaient suffisants.

5 Portée et communication/transfert de technologie 5. Identifiez le principal groupe cible de ce projet et comment ceci l a aidé à s adapter ou à rester concurrentiel : Le principal groupe cible de ce projet comprend les producteurs de soya à l échelle du Canada. Jusqu à date, peu de variétés de soya offrent un degré important de résistance à la moisissure blanche, ce qui est surtout dû au manque de connaissances sur la résistance génétique à cette maladie; c est ce que nous proposons d obtenir. Avec les nouvelles connaissances offertes aux phytogénéticiens, l industrie deviendra plus concurrentielle, spécialement puisque cette maladie affecte une vaste superficie du Canada et du Nord des États-Unis. En se servant d outils physiologiques et moléculaires développés dans le cadre de ce projet, les phytogénéticiens du soya pourront développer des variétés résistant à la moisissure blanche, ce qui accroîtra le rendement et la qualité des semences dans ces nouvelles variétés. 6. Indiquez le nombre total de personnes rejointes par ce projet (p. ex. : producteurs avec un bulletin électronique; 450 participants à une conférence; abonnés à une revue, etc.) : Un article a été rédigé dans le magazine de GFO qui peut avoir rejoint jusqu à producteurs de soya en Ontario. Assemblées annuelles internationales d ASA/CSSA/SSSA, Tampa, Floride. Une affiche montrant les résultats de la caractérisation physiologique de la maladie sur les cultivars vulnérables et partiellement résistants a été présentée lors de ces conférences auxquelles participaient environ personnes. 7. Décrivez brièvement le matériel de communication/transfert de technologie qui a été élaboré pour le projet. Incluez le nombre et la description d initiatives particulières qui ont été entreprises pour partager de l information et faire connaître les progrès du projet au public, spécialement la communauté agricole et agroalimentaire de l Ontario (comme des rapports de recherche, des présentations de l industrie, des conférences, des ateliers, des trousses d information, des dépliants, etc.) : Le matériel de communication est énuméré ci-dessus au n o 6 et ci-dessous au n o Indiquez quand vous avez reconnu officiellement les fonds fournis dans le cadre du PCAA, conformément à l annexe E de l entente du PCAA. Présentation lors d un séminaire (département de phytoagriculture de l université de Guelph) Présentation au comité consultatif (département de phytoagriculture de l université de Guelph) «Tackling white mould in a new way», article par Nicole Yada publié dans le magazine de Grain Farmers of Ontario (GFO) en avril 2011; Présentation d une affiche lors des assemblées annuelles internationales de l ASA/CSSA/SSSA, Tampa, Floride, du 3 au 6 novembre 2013 Conclusion 9. Le cas échéant, décrivez brièvement comment cette initiative pourra être viable du point de vue économique et se poursuivre de façon autonome à l avenir. Quelles sont les prochaines étapes de cette initiative? Ce projet a fourni de nouveaux renseignements importants pour mieux comprendre les principes et les fondements génétiques, moléculaires et physiologiques du pourridié sclérotique du soya (moisissure blanche). Avec l identification des changements dans les tissus au cours de l épidémiologie de la maladie et des changements dans l expression des gènes lors de l inoculation, de nouveaux objectifs ont été dévoilés pour les phytogénéticiens. Compte tenu que la moisissure blanche a été une des maladies les plus difficiles à résister pour le soya et plusieurs autres cultures hôtes, tout progrès à ce sujet est très utile. Le développement de nouvelles variétés de soya qui posséderaient une meilleure résistance partielle à la moisissure blanche sera un résultat direct des connaissances acquises pendant le projet. Toutefois, il faudra compter plusieurs années pour mettre en œuvre les outils développés lors du projet et offrir de nouveaux cultivars car la phytogénétique est un processus assez lent.

6 10. Décrivez toute répercussion environnementale et économique réelle ou prévue du projet (en termes quantitatifs, tel que décrit dans la demande du projet). En ce qui concerne les répercussions environnementales de notre projet, nous pourrons réduire les intrants agricoles de l utilisation de pesticides pour contrôler les maladies fongiques, comme la moisissure blanche du soya, et réduire le gaspillage lors de l application d engrais et de la gestion de cultures qui ne devraient pas survivre en raison de cette maladie. Avec les nouvelles connaissances acquises dans le cadre de ce projet, nous pourrons développer de nouvelles variétés de soya qui résistent à la moisissure blanche; ceci permettra de mieux utiliser les ressources, y compris le sol et les engrais. Ceci se traduira par un rendement élevé et durable pour les producteurs canadiens de soya. En ce qui concerne les répercussions économiques, des variétés résistantes à plus fort rendement, qui ne connaissent pas autant de pertes dues aux maladies, seront plus rentables. 11. Discutez des leçons apprises, de recommandations et de la perception globale du succès du projet. En plus de ce que nous avons déjà mentionné ci-haut, nous aimerions ajouter que nous avons beaucoup appris au sujet des facteurs impliqués dans la résistance partielle au pourridié sclérotique du soya (moisissure blanche) en étudiant les facteurs physiologiques et morphologiques ainsi que l expression des gènes. Nous recommandons que les chercheurs qui veulent développer de nouvelles variétés de soya avec une meilleure résistance à la moisissure blanche analysent les plants pour déceler toute détérioration tardive de l épiderme et du cortex dans les tissus infectés, ce qui serait un indicateur (marqueur) d une plus grande résistance dans une variété de soya. De plus, nous avons découvert que les stomates étaient fermés dans les tissus affectés pendant une plus longue période dans la variété résistante par rapport à la variété vulnérable jusqu à 48 heures après l infection. Nous alléguons que ces traits permettent aux plants résistants de mieux combattre l infection fongique que les plants vulnérables, bien que des études ultérieures soient nécessaires pour déterminer exactement comment ceci se produit. L étude de l expression des gènes a indiqué que plusieurs gènes clés chargés de la défense sont régulés de manière positive (ont une plus grande expression) dans les premiers stades d infection de variétés partiellement résistantes comparativement aux variétés vulnérables. Nous croyons que le projet a été réussi puisque nous avons pu atteindre tous nos objectifs. Couverture médiatique (ajoutez des lignes supplémentaires au besoin)* Date Source Titre Portée Reconnaissance du PCAA (Oui/Non) Avril 2011 Magazine de Grain Tackling white mould in a Oui Farmers of Ontario new way agriculteurs 5 novembre participants aux conférences Oui Affiche présentée lors des assemblées annuelles de l American Society of Agronomy, Crop Science Society of America et Soil Science Society of America à Tampa, FL, É.-U. Physiological Characterization of Partial Resistance of Soybean to Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary (affiche) * Si c est possible, veuillez fournir un exemplaire du matériel médiatique pour nos dossiers. Agriculture et Agroalimentaire Canada s est engagé à collaborer avec ses partenaires de l industrie. Les opinions exprimées dans ce document sont celles du requérant et pas nécessairement celles d Agriculture et Agroalimentaire Canada.