Principe de la séparation sur une résine échangeuse d ions

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Arnaud Bonin
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1 Principe de la séparation sur une résine échangeuse d ions La réaction d échange entre la résine et le mélange à séparer dépend de l affinité relative de la résine pour le contre ion qu elle porte et pour l ion qu elle doit fixer. Interviennent dans cette fixation : Charge de la résine. Charge et la taille des ions à fixer. Concentration des ions à séparer. Accessibilité aux groupements ionisés de la résine. Vitesse d écoulement du liquide.

doit fixer. Interviennent dans cette fixation : Charge de la résine. Charge et la taille des ions à fixer.

2 Principe de la séparation sur une résine échangeuse d ions Étapes de la séparation : Conditionnement de la résine. Application du mélange de solutés. Fixation éventuelle des solutés à la résine = la phase stationnaire (interactions ioniques). Élution : entraînement des solutés par la phase stationnaire.

3 Principe de la séparation sur une résine échangeuse d ions Exemple : séparation sur une résine anionique (= échangeur de cations) La résine est conditionnée = mise dans la colonne dans une solution tampon à ph adéquat (Ex : ph acide), chaque groupement fonctionnel est associé à son contre-ion

est conditionnée = mise dans la colonne dans une solution tampon à ph

4 Principe de la séparation sur une résine échangeuse d ions AA - AA2 AA - AA1 AA1 AA - Le mélange de solutés à séparer est déposé sur la résine.

5 Principe de la séparation sur une résine échangeuse d ions AA - AA1 AA - AA2 AA - AA1 Les cations peuvent se fixer à la résine (condition : affinité ) Les anions ne peuvent pas se fixer à la résine. Les solutés migrent dans la résine poreuse.

résine (condition : affinité ) Les anions ne peuvent pas se

6 Principe de la séparation sur une résine échangeuse d ions Tampon de lavage AA1 Les anions (non fixés à la résine) sont emmenés dans le tampon de lavage. AA2 AA1 AA - AA - AA - On effectue le lavage de la colonne avec le même tampon que le conditionnement

7 Principe de la séparation sur une résine échangeuse d ions Tampon d élution Plus le volume de NaOH ajouté augmente et plus le ph augmente. ph G -, AA1 G -, G -, AA2 AA1 V(NaOH) en ml Les cations se décrochent en fonction des conditions de ph : pour ph>phi, l aa passe sous forme d anion Elution : on applique un tampon d élution qui modifient les conditions de fixation. Par exemple : tampon d élution = solution de NaOH à 1 mol.l -1

ph G -, AA1 G -, G -, AA2 AA1 V(NaOH) en ml Les cations se décrochent en fonction des conditions de ph :

8 Principe de la séparation sur une résine échangeuse d ions Tampon de conditionnement = tampon de lavage Régénération de la résine : les contres-ions sont réassociés à leur groupement fonctionnel. La résine est prête à être réutilisée

de la résine : les contres-ions sont réassociés à leur

9 Exemple de support : la résine Amberlite IRC 50, un échangeur de cations Monomères constitutifs : Acide méthacrylique (95%) Divinylbenzène (5%) Structure de la résine : Observation de la résine au MEB :

10 Dowex 50 x 8

11 ECHANGEURS DE CATIONS ECHANGEURS D'ANIONS FORTS FAIBLES

12 Dowex 50x8 ( mesh) -régénérée par l acide acétique 1 mol.l -1, -rincée par de l eau distillée -en suspension dans l acide acétique 10-3 mol.l -1.

14 Rinçage et conditionnement de la colonne MODE OPERATOIRE Avant d utiliser la colonne, vous devez la rincer avec 20 ml d eau distillée. Equilibrer la colonne à ph 7,5 grâce au tampon phosphate. Il faut environ 30 ml de tampon pour obtenir un ph égal à 7,5 en bas de la colonne.

Equilibrer la colonne à ph 7,5 grâce au tampon phosphate.

15 Dépôt et élution Abaisser le niveau du liquide surnageant de manière que le ménisque soit tangent à la surface de la résine (vérifier le ph de l effluent) Déposer délicatement 2 ml de la solution de mélange d acides aminés à la surface de la résine en évitant toute perturbation de la surface de celleci. Faire passer goutte à goutte et recueillir jusqu à ce que le ménisque soit tangent à la surface de la résine. Eluer l acide aminé non retenu par 25 ml de tampon phosphate (ph 7,5). La fraction peut être recueillie dans une éprouvette de 25 ml. Vous obtenez alors la fraction 1. Eluer enfin l acide aminé retenu par 25 ml de soude 2 mol.l -1. La fraction peut être recueillie dans une éprouvette de 25 ml. Vous obtenez alors la fraction 2.

$La fraction peut être recueillie dans une éprouvette de 25 ml. Vous obtenez alors la fraction 1. Eluer enfin l acide aminé retenu par 25 ml de soude 2 mol.l -1.$

16 Régénération de la résine Régénérer la résine par 20 ml d acide acétique 1 mol.l -1 Laver à l eau distillée (environ 30 ml) Puis à nouveau avec environ 20 ml d acide acétique 10-3 mol.l -1.

17 Tryptophane Phenylalanine Proline Arginine phi = 6.30 phi = 5.89 phi = ,99 10,60 2,38 9,39 1,83 9,24 phi = ,17 9,04 12,48

18 Tryptophane: 2,38 A 2,38 A0 9,39 A - COOH COOH COO - COO - NH 3 NH 3 NH 3 NH 2 9,39 Phénylalanine: A 1,8 A0 9,24 A - 1,8 COOH COOH COO - COO - NH 3 NH 3 NH 3 NH 2 9,24

19 Proline: 1,99 A 1,99 A0 10,6 A - COOH COOH COO - COO - 10,6 NH 3 NH 3 NH 3 NH 2 Arginine: 9,04 2,17 A 2,17 A 9,04 A 0 12,48 A - COOH COOH COO - COO - COO - NH 3 NH 3 NH 3 NH 2 NH 2 NH =NH 2 =NH 2 =NH 2 =NH Séparation à ph = 7,5 12,48

20 Dosage à la ninhydrine Ninhydrine Stabilité relative des différents carbonyles

21 Réaction avec tous les acides aminés sauf la proline et l hydroxyproline : Ninhydrine Acide aminé

22 Ninhydrine Coloration violette

23 Réaction la proline et l hydroxyproline : Jaune

24 Faire une gamme étalon avec les acides aminés choisis : Tube n Sol. étalon (ml) Tampon ph 5, Réactif à la ninhydrine (ml)

25 Faire une prise d essai de 1mL de chaque éluât et avec 1 ml du mélange de départ après les avoir ramené à ph 5,5 et faire le dosage avec la ninhydrine par ajout de 1mL de ninhydrine Fermer les tubes avec du parafilm. Porter au bain-marie bouillant (ou à l étuve) pendant 15 min. Refroidir les tubes dans un bain d eau froide, puis ajouter 5 ml du tampon ph 5,5. Placer les tubes 30 min à l obscurité. Lire l absorbance au spectrophotomètre après avoir déterminé le λ max

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