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1 TESTS BIOCHIMIQUES CLASSIQUES POUR L IDENTIFICATION DES PECTOBACTERIUM (ERWINIA PECTINOLYTIQUES) ET DES PSEUDOMONAS FLUORESCENTS Lise Vézina, technicienne de laboratoire Michel Lacroix, agronome-phytopathologiste Direction de l innovation scientifique et technologique Bien que les tests biochimiques constituent une approche classique pour l identification, il n en demeure pas moins qu ils sont particulièrement utiles pour la détermination de certaines espèces et sous-espèces de bactéries phytopathogènes. Grâce à ces tests, il est possible d identifier les bactéries par la connaissance de certaines caractéristiques de leur métabolisme. Les tests biochimiques permettront donc de vérifier si la bactérie a un métabolisme oxydatif ou fermentatif pour l utilisation du glucose, s il y a formation d un acide à la suite de l utilisation d un hydrate de carbone (ex : arginine, lysine, tryptophane ) ou si des molécules complexes sont dégradées (ex : gélatine, amidon ). Au laboratoire de diagnostic en phytoprotection, ces tests sont utilisés pour identifier les Pectobacterium (Erwinia pectinolytiques) et les Pseudomonas fluorescents. Les images suivantes permettent de visualiser des taches et des pourritures molles d origine bactérienne sur diverses plantes cultivées. Taches foliaires causées par Peudomonas syringae sur : Le poivron Le céleri La tomate Le cornouiller - 1 -

2 Pourriture molle causée par : Pectobacterium carotovorum Pseudomonas marginalis et Pseudomonas Pectobacterium sur l endive fluorescent IVb sur la pomme de terre carotovorum subsp. carotovorum sur la tomate Pseudomonas fluorescent IVb Pseudomonas viridiflava Pectobacterium sur le concombre sur la carotte carotovorum subsp. atroseptica sur la pomme de terre ISOLEMENT SUR DES MILIEUX DE CULTURE GÉLOSÉS La première étape consiste à isoler la bactérie des tissus végétaux présentant des symptômes. Les isolements sont réalisés sur des milieux de culture gélosés connus sous les noms de MS (Miller Schroth medium) (Miler et Schroth, 1972) pour les Pectobacterium et de B de King (King et al., 1954) pour les Pseudomonas fluorescents. Les tissus végétaux présentant des symptômes sont lavés à l eau du robinet avant de procéder à l isolement. À la suite du trempage des tissus végétaux dans une solution saline (NaCl 0,85%) pendant 30 minutes, la suspension est étalée par épuisement sur les milieux de culture. Pour les tissus

3 présentant une pourriture molle, il est préférable de diluer 1/10 et 1/100 la suspension initiale avant de l étaler sur les milieux de culture. Les colonies de Pectobacterium sur le milieu MS ont une coloration orangée, un contour nébuleux et elles sont prostrées sur le milieu de culture. Après 48 à 72 heures d incubation, le diamètre des colonies devrait se situer entre 2 et 8 mm et elles sont généralement abondantes. Les colonies de Pseudomonas sur le milieu B de King sont de coloration blanchâtre à crème et produisent un pigment fluorescent dans le milieu, la pyoverdine. Après 48 heures d incubation, le diamètre des colonies devrait se situer entre 1 et 3 mm et sont généralement abondantes. IDENTIFICATION DES PECTOBACTERIUM PAR LES TESTS BIOCHIMIQUES CLASSIQUES Les colonies bactériennes isolées des tissus végétaux et présentant les caractéristiques de Pectobacterium sont mises en culture pure sur le milieu TSA (Tryptic Soy Agar). À partir d une culture pure de 24 heures, les tests à effectuer pour vérifier s il s agit d un Pectobacterium sont les suivants: oxydase, catalase, métabolisme oxydatif/fermentatif et dégradation de la pectine (pectinase). Par la suite, pour différencier les espèces et les sousespèces de Pectobacterium, les tests suivants sont réalisés : transformation du sucrose en substances réductrices, utilisation du α-méthylglucoside, production d indole et croissance à 35 o C. OXYDASE Le test oxydase est basé sur la production bactérienne d une enzyme oxydase intracellulaire en présence d oxygène atmosphérique et de cytochrome C. Sur un papier-filtre stérile, déposer une goutte du réactif oxydase (biomérieux) composé de phénylènediamine et d acide ascorbique (agent réducteur). À l aide d un cure-dent stérile, prélever la bactérie à identifier et la déposer sur le papierfiltre à l endroit où il est humecté du réactif. La réaction est lue dans les 30 secondes suivantes. Une réaction indique + qu il y a eu oxydation du réactif phénylènediamine pour former un composé coloré en violet, l indophénol. Une réaction tardive ou une absence de coloration indiquent une réaction. CATALASE L enzyme catalase est produite en abondance par les bactéries ayant un métabolisme respiratoire qui détruit les peroxydes et libère de l oxygène. Sur une lame, déposer une goutte de peroxyde d hydrogène 3% (H 2 O 2 ). À l aide d un cure-dent stérile prélever la bactérie à identifier et la déposer dans la solution de peroxyde d hydrogène. Attendre environ 2 minutes et lire la réaction obtenue. Présence de bulles Absence de bulle Une réaction indique qu il y a eu destruction du peroxyde d hydrogène et libération d oxygène. PECTINASE Le test pectinase permet d identifier l activité pectinolytique d une bactérie c est-à-dire sa - 3 -

4 capacité à dégrader la pectine contenue dans le milieu de culture. Le substrat utilisé est l acide polygalacturonique. Inoculer le milieu de culture PECTINASE par points en déposant un amas de bactéries à identifier. Incuber à 26 o C pour 24 à 48 heures. Suite à l incubation, ajouter suffisamment d acétate de cuivre 7,5 % pour recouvrir les points d inoculation (environ 5 ml). Attendre 5 minutes et lire la réaction obtenue. : Absence d un halo : Présence d un halo blanc Une réaction indique qu il y a eu dégradation de la pectine du milieu et formation d une zone de précipitation. OXYDATION/FERMENTATION DU GLUCOSE À l aide d un milieu à faible teneur en peptone et à forte concentration en glucose, nous détectons l acide formé soit par l oxydation, soit par la fermentation du glucose. L acidification du milieu fait changer l indicateur, le bleu de bromothymol, qui passe du vert au jaune Aucune acidification du milieu, coloration verte Acidification du milieu, coloration jaune Une réaction indique une acidification du milieu suite à la fermentation du glucose en condition anaérobique. α-méthyl-glucoside Le test α-méthyl-glucoside sert à déterminer si la bactérie peut croître en présence de cette unique source de carbone. Inoculer le milieu de culture α-méthyl-dglucoside (MG) par points en déposant un amas de bactéries à identifier. : Présence de gros points bourgogne. : Présence de petits points bourgogne avec un important contour blanc. Déposer les tubes API OF Medium (biomérieux) dans un bécher et ajouter de l eau. Faire bouillir l eau jusqu à ce que le contenu des tubes soit liquide. Cette étape permet d enlever l oxygène dans le milieu. Casser l extrémité du tube à l aide du capuchon de plastique. Inoculer la bactérie à identifier et ajouter 1 cm d huile minérale stérile puisque la réaction se fait en condition anaérobique. Incuber à 26 o C pour 24 à 48 heures. Une réaction nous indique qu il y a eu une croissance bactérienne sur le milieu contenant du α-méthyl- D-glucoside comme unique source de carbone. TRANSFORMATION DU SUCROSE EN SUBSTANCES RÉDUCTRICES Le test sucrose permet de vérifier si la bactérie transforme le sucrose en substances réductrices. Inoculer le milieu de culture liquide RS. Suite à l incubation, ajouter 2,5 ml du réactif de Bénédict. Déposer les tubes dans un becher et ajouter de l eau

5 Amener l eau à ébullition sur une plaque chauffante. Au changement de couleur du témoin positif (une couleur jaune apparaissant), lire la réaction obtenue. le milieu reste bleu le milieu devient jaune Une réaction indique qu il y a eu transformation du sucrose en substances réductrices. INDOLE Le test indole sert à déterminer si la bactérie produit de l indole à partir de tryptophane (un acide aminé). Inoculer le milieu de culture liquide INDOLE. Suite à l incubation, ajouter 3 gouttes de réactif James (biomérieux). Lire immédiatement la réaction obtenue. Une coloration rosée et diffuse Une coloration bleutée et diffuse Une réaction nous indique qu il y a eu une production d indole à partir de tryptophane. CROISSANCE À 35 o C Inoculer le milieu de culture TSA (Tryptic Soy Agar) par stries. Incuber à 35 o C pour 48 heures. : présence d une croissance bactérienne : absence d une croissance bactérienne Consulter la fiche d identification des Pectobacterium afin d identifier la bactérie (voir le tableau ci-dessous). FICHE D IDENTIFICATION DES PECTOBACTERIUM Tests Oxydase Catalase Fermentation Pectinase α-méthyl- glucoside Production Sucrose d indole Croissance à 35 o C P.c. carotovorum P.c. Atrosepticum P. chrysanthemi Légende: Oxydase: Vérification de la présence de l enzyme cytochrome C oxydase Catalase : Décomposition du peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ) par la catalase Fermentation : Utilisation du glucose en condition anaérobique Pectinase : Vérification de la présence de pectinase (substrat utilisé l acide polygalacturonique) α-méthyl-glucoside : Utilisation du α-méthyl-d-glucoside comme unique source de carbone Sucrose : Transformation du sucrose en substances réductrices Indole : Formation d indole à partir du tryptophane (acide aminé) - 5 -

6 IDENTIFICATION DES PSEUDOMONAS FLUORESCENS PAR LES TESTS BIOCHIMIQUES CLASSIQUES Les colonies bactériennes isolées des tissus végétaux et présentant les caractéristiques d un Pseudomonas fluorescent sont mises en culture pure sur un milieu KB (B de King) (King et al., 1954). À partir d une culture pure de 24 heures, les tests à effectuer pour identifier les espèces de Pseudomonas fluorescents sont: production de levane, présence d oxydase, dégradation de la pectine (pectinase), présence d arginine déshydrogénase et hypersensibilité du tabac. La culture bactérienne doit être observée sous une lumière ultraviolette ayant une longueur d onde de 375 nm afin de noter la présence ou l absence de fluorescence. LEVANE Le test levane sert à vérifier la polymérisation du fructose en polyfructose par la bactérie. Inoculer le milieu LEVANE par stries. Une réaction indique qu il y a eu polymérisation du fructose en polyfructose par la bactérie. OXYDASE Le test oxydase est basé sur la production bactérienne d une enzyme oxydase intracellulaire en présence d oxygène atmosphérique et de cytochrome C. Sur un papier filtre stérile, déposer une goutte du réactif oxydase (biomérieux) composé de phénylènediamine et d acide ascorbique (agent réducteur). À l aide d un cure-dent stérile prélever la bactérie à identifier et la déposer sur le papierfiltre humecté du réactif. Lire la réaction dans les 30 secondes. - + Une réaction indique qu il y a eu oxydation du réactif phénylènediamine pour former un composé coloré en violet, l indophénol. Une réaction tardive ou une absence de couleur indiquent une réaction. PECTINASE Le test pectinase permet d identifier l activité pectinolytique d une bactérie c est-à-dire sa capacité à dégrader la pectine présente dans le milieu de culture. Strie partiellement saillante et luisante (vue du dessus) Présence d une zone opaque et luisante en marge de la strie (vue du dessous) Strie prostrée et non luisante Inoculer le milieu PH (milieu pectine Hildebrand) par points en déposant un amas de bactéries à identifier. : présence d une dépression du milieu entourant le point d inoculation : absence de dépression Une réaction indique qu il y a eu dégradation de la pectine du milieu et formation d une zone de dépression

7 ARGININE DÉSHYDROLASE Le test arginine déshydrolase sert à déterminer si la bactérie transforme l arginine (un acide aminé) à l aide de l enzyme arginine déshydrolase. Inoculer le milieu de culture semi-liquide ARGININE. Ajouter environ 1 cm d huile minérale stérile. La réaction se fait en condition anaérobique. Le milieu demeure rosé Le milieu devient jaune orangé Une réaction indique qu il y a eu transformation de l arginine par l enzyme arginine déshydrolase. HYPERSENSIBILITÉ SUR TABAC Le test d hypersensibilité du tabac met en évidence le pouvoir pathogène d une bactérie suite au dessèchement des zones d inoculation sur les feuilles de tabac. Faire une suspension bactérienne ayant une concentration de 10 8 bactéries/ml (standard McFarland N o 5) dans un tube contenant 2 ml de saline stérile. Utiliser un plant de tabac de la variété White Burley ayant atteint le stade de 5 à 6 feuilles. À l aide d une seringue tuberculine de 1 ml, injecter la suspension bactérienne dans l espace intercellulaire le long de la nervure centrale ou de la nervure secondaire. L inoculation de la suspension bactérienne se fait sur la surface inférieure de la feuille. Laisser le plant à la température de la pièce de 24 à 48 heures. Lire la réaction obtenue. Aucun changeme nt dans la couleur et l aspect du tissu. La zone foliaire inoculée avec la bactérie devient légèrement translucide et a un aspect humide. Par la suite, les tissus s assèchent et prennent une coloration brun clair à beige. Un jaunissement ou un brunissement sans assèchement de la zone foliaire inoculée n est pas une réaction. Une réaction met en évidence le pouvoir pathogène de la bactérie. Consulter la fiche d identification des Pseudomonas fluorescents afin d identifier la bactérie (voir le tableau ci-dessous)

8 FICHE D IDENTIFICATION DES PSEUDOMONAS FLUORESCENTS Espèces et groupes Tests Levane Oxydase Pectinase Arginine déshydrolase Hypersensibilité sur tabac Fluorescence Syringae I a + - -/ Delphini I b Viridiflava II Cichorii III Marginalis IV a Fluorescens IV b Tolaasii V a Fluorescens V b Légende : Levane : Oxydase : Polymérisation du fructose en polyfructose (levane) Vérification de la présence de l enzyme cytochrome C oxydase Pectinase : Vérification de la présence de pectinases (substrat utilisé l acide polygalacturonique) Arginine déshydrolase : Transformation de l arginine (acide aminé) par l arginine déshydrolase Hypersensibilité du tabac : Mise en évidence du pouvoir pathogène d une bactérie par le dessèchement des zones d inoculation sur les feuilles de tabac RÉFÉRENCES fluorescein. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 44, DYE, D.W., A taxonomic study of the genus Erwinia. I. The «amylovora» group. N.Z.J. Sci. 11 : HILDEBRAND, D.C., Pectate and pectin gels for differentiation of Pseudomonas sp. and other bacterial plant pathogens. Phytopathology 12 : KING, E.O., M.K. Ward et D.E. Raney Two simple media for demonstration of pyocyanin and LELLIOTT, R.A., et R.S. Dickey, Genus VII. Erwinia Winslow, Broadhurst, Buchanan, Krumweide, Rogers and Smith 1920, 209. Pages In Noel R. Krieg and John G. Holt (eds.). Bergey s Manual of Systematic Bacteriology. Volume 1. Williams and Wilkins, Baltimore, Md. LELLIOTT R.A. et D.E. Stead Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Methods in Plan Pathology Vol 2. pp. 182, 193 et 194.

9 MILLER, T.D. et M.N. Schroth, Monitoring the epiphytic population of Erwinia amylovora on pear with a selective medium. Phytopathology 62 : THORLNEY, M.J., The differentiation of Pseudomonas from other Gram-negative bacteria on the basis of arginine metabolism. Journal of Applied Bacteriology, 23 : SCHAAD, N.W Laboratory guide for identification of Plant Pathogenic Bacteria, 2nd Edition. Pp Les photos de ce document ont été prises par Chantal Malenfant, technicienne de laboratoire, Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, MAPAQ. Le texte a été corrigé par Cindy Dallaire, agronome-phytopathologiste

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