P l a n Q u a l i t é B i o l o g i e m o l é c u l a i r e / V i r o l o g i e. Gestion des échantillons

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1 1. Technique PCR 1.1 Recommandations générales : Précautions : les prélèvements, quels qu ils soient, sont du matériel biologique, susceptible de contenir des germes éventuellement transmissibles à l homme. Quel que soit l échantillon, manipulez-le avec des gants et une protection appropriée, sous un poste PSM, jusqu à ce que le matériel biologique soit désactivé. Conservation : Les lyses enzymatiques et bactériologiques sont ralenties avec le froid. N importe quel prélèvement pour analyse nécessite une conservation à 4 C environ. Les prélèvements doivent être envoyés le plus rapidement possible au laboratoire, dans un délai qui de préférence n excède pas 48H et sous régime du froid. Prélèvement : La PCR est une technique visant à rechercher la présence du pathogène en question et non les conséquences de son passage. Le prélèvement doit donc être effectué au niveau des tissus ou liquides biologiques où le microorganisme est présent, ou se multiplie. 1.2 Quel prélèvement pour quel pathogène? Recherche Prélèvement demandé PPC BVD Tissus : amygdales, ganglions, rate Sang total Sang sur anti-coagulant Sérum non centrifugé et non congelé Tissus : rate, placenta Coxiella burnetti (fièvre Q) Tissus : placenta Lait Fèces Chlamydophila abortus Néospora caninum Toxopasma gondii Tissus : placenta Lait Tissus : encéphale, cœur, rein, foie, poumon, placenta Attention : fort risque d inhibition de la PCR sur placenta (prélèvement déconseillé) Tissus : encéphale, cœur, rein, foie, poumon, placenta BMV_ECH.doc rév. 2 mis en application le 27/08/12 1/3

2 Mycobacterium paratuberculosis leptospirose FCO Grippe aviaire Fèces Sang total Urine Tissus : rein, foie, avorton Sang total sur anticoagulant EDTA Ecouvillon trachéal et cloacal avec milieu de transport 1.3 Quantité, conservation et délai avant analyse Sang : Le volume minimal à envoyer au laboratoire est 2 ml. Les anticoagulants de type EDTA n interfère pas avec la PCR Il ne faut pas congeler Conservation jusqu à 15 jours à 4 C Le volume minimal à envoyer au laboratoire est 2 ml. Conservation 4 jours à 4 C Dans certains cas particuliers (BVD, leptospirose), il ne faut jamais congeler ni centrifuger les sérums Urine : Le volume minimal à envoyer au laboratoire est 15 ml. Il ne faut pas congeler Les leptospiroses sont très rapidement dégradées, il faut toujours envoyer le prélèvement le plus rapidement possible à 4 C. L analyse doit être réalisée le plus rapidement possible. Fèces : Le volume minimal à envoyer au laboratoire est 5 grammes. Prélever dans des flacons pour coproculture. Conservation à 4 C pendant 48h sinon congeler Pour la recherche de paratuberculose, conservation 7 jours à 4 C Lait : Le lait est un prélèvement qui supporte très mal les excès de température, il ne faut pas le congeler et le placer dès que possible à 4 C. L ajout de Bronopol n interfère pas avec la PCR. Conservation 48H à 4 C si le lait ne contient pas de Bronopol sinon 1 semaine. Tissus : Le poids minimal pour une analyse est de 1g Lorsque cela est possible, prélever une partie nécrosée ou qui semble atteint par le pathogène. BMV_ECH.doc rév. 2 mis en application le 27/08/12 2/3

3 Conservation 48H à 4 C sinon congélation à 20 C Concernant les placentas : lors de pathologies abortives, les placentas peuvent être extrêmement chargés en bactéries ou virus. Il faut donc considérer chaque échantillon comme positif pour d une part protéger le manipulateur et d autre part ne pas risquer une contamination du laboratoire. Ecouvillon : Ecouvillon prélevé avec milieu de transport. Conservation 24H à 4 C sinon congélation à <-65 C 2. Technique de séroneutralisation virale La qualité physico-chimique du sérum doit être compatible avec l analyse Il est recommandé de décomplémenter le sérum à 56 C +/-1 C pendant 30 min avant analyse Conservation 72h maximum à 5 C +/- 3 C centrifugé et sans caillot. Sinon congélation à -16 C (sans caillot) 3. Technique d inhibition de l hémagglutination pour la recherche d anticorps H5/H7 La qualité physico-chimique du sérum doit être compatible avec l analyse. Le sérum doit être limpide. Il est conseillé de décomplémenter le sérum à 56 C +/-1 C pendant 30 min avant analyse Il n est pas souhaitable que le sérum ait été décongelé plus de deux fois avant analyse. Conservation 72h maximum à 5 C +/- 3 C centrifugé et sans caillot. Sinon congélation à -16 C (sans caillot) Rédaction Validation Vérification BMV_ECH.doc rév. 2 mis en application le 27/08/12 3/3

4 P l a n q u a l i t é Planning et délai des analyses par PCR ANALYSE_PCR.doc NATURE DE L ANALYSE NATURE DU PRELEVEMENT DELAI MOYEN JOUR D EXECUTION PPC rate 24h lundi et mercredi BVD individuel sérum, fèces, lait 24h BVD mélange sérum 24h Chlamydiose lait, fèces, placenta 24h mardi Fièvre Q lait, fèces, placenta 24h mardi Néosporose placenta, cœur, poumon, rein, foie 24h mardi Leptospirose urine, cœur, rate 24h mardi Toxoplasmose encéphale, placenta 24h mardi Paratuberculose fèces 24h (pour 50) 48h (pour>50) jeudi et Tuberculose poumon, foie, rate, ganglion 24h mardi et jeudi FCO sang EDTA 24h Influenza aviaire écouvillon 12h RSV 24h variable (en fonction de la demande) Urgence : analyse urgente en dehors des jours d exécution. ANALYSE_PCR.doc rév 1 mis en application le 16/03/09 p 1/1

5 BIOLOGIE MOLECULAIRE : Méthode PCR (temps réel) CODE PRESTATIONS Méthode FILIERE RUMINANTS BVD : BVDPCR Individuel AES Paramètre accrédité COFRAC Agrément ministériel Mélange de 10 maxi sur boucles AES BVDMPCR Mélange de 20 maxi AES Plan BVD en introduction (adhérents GDS) BVDMPCR Analyse BVD sur mélange de 5,10 ou 20 AES AVT3 AVT4 Plan AVORTEMENT 3 analyses 4 analyses Analyses individuelles : AES/LSI AES/LSI CHLAPCR Chlamydiae Individuel LSI PQPCR Fièvre Q Individuel LSI NEOPCR Neospora Individuel LSI LEPTOPCR Leptospirose individuel LSI ERHLPCR Erhlichiose individuel LSI TOXOPCR Toxoplamose Individuel LSI SCHMA Schmallenberg individuel AES X Virus respiratoires RSV RSV (Virus Respiratoire Syncytial) LSI PI3 PI3 LSI RSVPI3 RSV (Virus Respiratoire Syncytial) / PI3 LSI FCOPCR FCOPCR3 Autres analyses FCO individuel AES X FCOPCR4 FCO individuel type 1 AES X FCOPCR5 FCO individuel type 8 AES X PARAPCR Paratuberculose Individuel Paratuberculose Individuel (projet paradigm) LSI/AES AES TUBPCR Tuberculose Individuel LSI X TUL Tularémie individuel Protocole ANSES MYBOV Mycoplasma bovis individuel LSI FILIERE PORCINE PCR Peste Porcine Classique AES X AUJPCR Aujeszky AES X SIVM Influenza porcine A Gène M AES SIVH1 Influenza porcine A Gène A/H1N AES FILIERE AVIAIRE IA Influenza aviaire Protocole ANSES X AUTRES FILIERE EHV1 Herpès virus équin 1 par PCR ind Méthode interne EHV4 Herpès virus équin 4 par PCR ind Méthode interne ANIMAUX DE COMPAGNIE LEPTOPCR Leptospirose individuel LSI Prestations /1