RAPPORT DE STAGE. Etude de la protéine ZraP

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1 Université Joseph Fourier Département Licence Sciences & Technologie RAPPORT DE STAGE Etue e la protéine ZraP RODÀ Mélanie Laboratoire accueil : Institut e Biologie Structurale Directeur u laboratoire : Eva PEBAY PEROULA Responsable u stage : Eve DE ROSNY Licence Sciences et Technologies 1 ère année Chimie-Biologie Année Universitaire

2 SOMMAIRE Remerciements. 2 Présentation e l IBS... 3 Présentation u sujet e recherche... 4 I. Organigramme récapitulatif es ifférentes étapes. 5 II. Principes et protocoles es méthoes utilisées Transformation e bactéries (en conitions stériles) Surexpression e ZraP Nter : inuction (en conitions stériles) Electrophorèse sur gel e polyacrylamie en présence e SDS 7 4. Précipitation au sulfate ammonium Chromatographie exclusion 8 6. Chromatographie échangeuse anions Concentration Décontamination par la ferrozine Dialyse Métallation Dosage Brafor Dosage PAR 13 III. Résultats Surexpression e ZraP Nter (en conitions stériles) Purification par chromatographie exclusion Purification par chromatographie échangeuse anions Décontamination par la ferrozine Métallation au cuivre Dosage Brafor Dosage PAR.. 20 Conclusion. 21 Activités annexes

3 REMERCIEMENTS Je tiens à exprimer toute ma gratitue envers Eve DE ROSNY, mon maître e stage, qui a accepté e me prenre en stage, et m a ainsi permis e pouvoir écouvrir ce que signifie réellement faire e la Recherche. Je la remercie énormément pour la confiance qu elle m a accorée, me permettant ainsi e maniper en autonomie malgré mon manque expérience. Je lui suis très reconnaissante pour tous les enseignements, les conseils et les méthoes qu elle m a onnés. Cela m a permis enrichir mes connaissances, e progresser rapiement et surtout avoir avantage confiance en moi. Un gran merci à Isabelle PETIT HARTLEIN pour m avoir guié et soutenue urant ce stage, pour sa isponibilité et pour tous les conseils qu elle m a onné, notamment en ce qui concerne mon parcours scolaire et mes projets avenir. Je remercie aussi tous les membres e l équipe pour leur accueil, leur gentillesse et leurs conseils. Ils ont su faire e ce stage une expérience magnifique et inoubliable. Enfin, merci à l Université Joseph Fourier pour m avoir onné l opportunité e faire ce stage par le biais u ispositif stage excellence. 2

4 PRESENTATION DE L IBS J ai effectué mon stage excellence, une urée e un mois au sein e l IBS (Institut e Biologie Structurale), situé sur le site u Polygone Scientifique à Grenoble. L IBS est géré par trois grans organismes : le CEA, l Université Joseph Fourier et le CNRS. Cet institut a pour vocation la compréhension es mécanismes biologiques fonamentaux, utilisant une approche multiisciplinaire qui associe la Biologie, la Chimie et la Physique. Il est sous la irection Eva PEBAY PEROULA et regroupe environ 230 personnes réparties en 9 groupes e recherche. Pour ma part, j ai travaillé au sein u groupe Métalloprotéines ans l équipe Métaux Lours et Signalisation, ont le responsable est Jacques Covès. L équipe s intéresse à es processus e transuction e signaux transmembranaires, ainsi qu à la prise en charge es métaux par es protéines ans le périplasme es bactéries à Gram négatif. 3

5 PRESENTATION DU SUJET DE STAGE Certaines bactéries à Gram négatif sont capables e résister à une concentration très élevée en métal e leur environnement grâce à es protéines que l on appelle métalloprotéines. Ce stage porte sur l étue e ZraP (Zinc resistance-associate Protein), une métallo-protéine périplasmique composée 8 unités e 12,4 kda organisées en tétramère e imère. Lorsque certaines bactéries comme Escherichia coli sont soumises à une quantité trop élevée en zinc, elles prouisent une grane quantité e protéine ZraP qui fixe les métaux et leur permettent e survivre ans un environnement riche en métal. L expression e ZraP est régulée grâce à un système à eux composants appelé ZraSR. ZraS est une protéine senseur transmembranaire posséant à l une e ses extrémités située ans le cytoplasme un omaine histiine kinase. Une fois activé (par un processus qui n a pas encore été élucié) ZraS s auto phosphoryle et le groupement phosphate est transféré sur ZraR, protéine qui régule la transcription ayant lieu ans le cytoplasme, qui est alors activée. ZraR se fixe sur le promoteur u gène zrap et la protéine ZraP est transcrite, puis trauite et sécrétée ans le périplasme pour pouvoir fixer les métaux. Il a été proposé que ZraP fixe le métal grâce à ses extrémités N- et C-terminales car elles possèent es histiines, acie aminé en général impliqué ans la fixation es métaux. Le but u stage est e éterminer si les sites e fixation sont bien situés sur la partie N- terminale e la protéine. Pour cela, nous avons utilisé urant toutes les manipulations un mutant e ZraP auquel nous avons enlevé les 4 premiers acies aminés (His-Gly-Gly- His) e la partie N-terminale. Ce mutant est appelé ZraP Nter. 4

6 ORGANIGRAMME RECAPITULATIF DES DIFFERENTES ETAPES TRANSFORMATION SUREXPRESSION DE ZRAP DANS E. COLI BL21(DE3) Préculture Inuction / Contrôle négatif expression Test expression PURIFICATION Lyse es bactéries Précipitation au sulfate ammonium Chromatographie exclusion Chromatographie échangeuse anions CONCENTRATION DE LA PROTEINE DECONTAMINATION DU FER PAR LA FERROZINE DIALYSE CONCENTRATION DE LA PROTEINE METALLATION Au cuivre et au zinc Au cuivre Au zinc II DOSAGE BRADFORD DOSAGE DES METAUX AVEC DU PAR 5

7 II. PRINCIPES ET PROTOCOLES DES METHODES UTILISEES 1. Transformation e bactéries (en conitions stériles) La transformation consiste en l insertion un plasmie recombinant ans es bactéries pour que suite à la ivision bactérienne, on obtienne une grane quantité e ce plasmie. On met en présence es bactéries, préalablement traitées avec u CaCl 2, avec le plasmie recombinant, puis on effectue un choc thermique afin que les bactéries insèrent le plasmie. On ajoute ensuite u milieu e culture (LB) et on incube 1h à 37 sous agitation pour que les bactéries commencent à assimiler les nutriments e leur milieu, et à se évelopper et à prouire la protéine e résistance à l antibiotique, puis on étale sur une boite e pétri contenant u LB et un antibiotique auquel les bactéries contenant le plasmie recombinant sont résistantes, et on incube à 37 sous agitation une nuit. Nous avons utilisé es bactéries Escherichia coli Bl21 (DE3) compétentes : elles ont été traitées afin être perméable, onc e pouvoir insérer le plasmie recombinant, elles possèent onc une très grane efficacité e transformation. 1µL e plasmie ans Escherichia coli Bl21 (DE3), 30 minutes ans la glace. Choc thermique : 90 secones à 42 C, 2 minutes ans la glace. Ajout e 500µL e LB. Incubation 1h à 37 C sous agitation. 100µL sur boite AGAR/LB/AMP. Incubation une nuit à 37 C sous agitation. 2. Surexpression e ZraP Nter : inuction (en conitions stériles) Il s agit e éclencher l expression un gène spécifique, ici zrap, pour prouire en grane quantité la protéine ZraP. Le génome e la bactérie Escherichia coli Bl21 (DE3) a été artificiellement moifié par l ajout u gène e l ARN polymérase T7 sous e contrôle un promoteur lac I. Ce promoteur lie le répresseur Lac qui empêche la transcription. L ajout IPTG va provoquer la issociation u répresseur Lac et permettre la transcription, puis la trauction. Le gène e ZraP est lui sous le contrôle un promoteur T7, il est transcrit par l ARN polymérase T7 et possèe aussi une séquence lac I. Ainsi l ajout IPTG permet inuire l expression e l ARN polymérase T7, et permet la transcription e zrap en issociant le répresseur Lac u promoteur. 6

8 Préculture : Préparation e 100mL e LB avec Ampicilline 1000X (antibiotique, Cfinale=50 µg/ml). Mise en culture une colonie s étant éveloppée sur la boite urant la nuit. Inuction : Préparation e 2L e LB/Amp ans un erlenmeyer. Ajout e 50mL e préculture. Mise en culture à 37 C sous agitation. À DO600nm=1,0 prélèvement e 1mL ans un tube (contrôle négatif expression). Dans l erlenmeyer, ajout e 800µL IPTG 1M. Remise en culture à 37 C sous agitation penant 3h30. Prélèvement e 1mL e milieu ans un tube Eppenorf (test expression). Centrifugation u milieu 10 minutes à 5500 rpm à 4 C et élimination u surnageant. Reprise u culot avec 40mL e Tampon A : Hepes (ph8) à 50mM et NaCl à 100mM. Congélation à -80 C. Contrôle négatif expression et test expression : Centrifugation es tubes Eppenorf 5 minutes à rpm, élimination u surnageant. Reprise u culot avec 50µL eau. Ajout e 12,5µL e bleu e épôt pour SDS-page. Dépôt ans es gels Tris-Glycine 15% et migration, avec u tampon SDS-page. Révélation es protéines au bleu e Coomassie. 3. Electrophorèse sur gel e polyacrylamie en présence e SDS On fait migrer es protéines sur un gel sous l effet un champ électrique suivant e leur masse molaire. En présence e SDS, les protéines sont énaturées et chargées négativement. Elles migrent onc e la cathoe (-) vers l anoe (+) à travers les réticulations u gel. Les protéines avec un pois moléculaire plus faible migreront plus rapiement et onc plus loin sur le gel. Grâce à un marqueur e taille, on peut éterminer la masse molaire une protéine, ou étecter sa présence après sa masse molaire après révélation par un colorant. 7

9 4. Précipitation au sulfate ammonium Quan on ajoute une grane quantité e sel à une solution e protéines, les ions salins attirent l eau grâce à leurs charges, présentes en plus grane quantité par rapport aux protéines. Ainsi, ces ernières vont interagir entre elles et s agréger. Nous utilisons u sulfate ammonium à 80% car ZraP précipite à 80%. Lyse es bactéries : Décongélation u tube contenant les bactéries à température ambiante. Ajout e CLAPA 1X (antiprotéases pour empêcher la lyse es protéines). Ajout e RNAse (pour égraer l ARN). Sonication 2 minutes : 2 sec ON, 14 sec OFF (pour étruire les membranes es bactéries et libérer le matériel cellulaire). Centrifugation 30 minutes à rpm à 4 C. Récupération u surnageant : Vsurnageant = 45mL Précipitation au sulfate ammonium 80% 4X : Ajout e 180mL e sulfate ammonium : Vfinal = 225mL. Incubation 3h à 4 C sous agitation. Centrifugation 15 minutes à rpm à 4 C. Elimination u surnageant. Reprise u culot ans 10mL e Tampon B : Hepes (ph8,5) à 50mM et NaCl à 10mM. 5. Chromatographie exclusion Il s agit e purifier es protéines en fonction e leur masse moléculaire apparente. On fait passer les protéines ans une colonne contenant es billes avec es pores. Les plus grosses protéines vont passer entre les billes et sortir plus rapiement que les petites protéines qui vont passer à travers les pores et mettre plus e temps à sortir. On a utilisé pour cette purification une colonne superex 75. 8

10 Chromatographie exclusion : Lavage e la colonne avec un volume eau, puis un volume e Tampon B. Injection e 2mL e protéine sur la colonne e volume 125mL. Run : collecte e 11 tubes à 4mL puis 18 tubes à 1,3mL. Récupération es fractions où s éten le pic Absorbance. Prélèvement e 10µL e chaque fraction ans es tubes Eppenorf pour vérifier par électrophorèse la présence e protéine. Au final, 6 Run ont été effectués, on a poolé les fractions 13E à 3E e chaque run. Vérification e la présence e protéine ans les fractions récupérées : Ajout e 3µL e bleu e épôt ans les tubes Eppenorf. 5 minutes à 95 C. Centrifugation 1 minute à rpm. Electrophorèse et révélation es protéines au bleu e Coomassie. 6. Chromatographie échangeuse anions On purifie es protéines en fonction e leur charge. On fait passer les protéines ans une colonne composée e billes en résine chargées positivement. Les particules négatives se fixent sur la résine et le reste est élué avec le tampon. Si besoin, on utilise un compétiteur (les ions Cl- par exemple) qui va se fixer à la place es particules négatives que l on va pouvoir récupérer ensuite. Ici, on purifie par chromatographie échangeuse anions car on souhaite se ébarrasser es contaminants comme les acies nucléiques et les autres protéines qui sont chargés négativement. On pool ensemble tous les pools : V=72mL. Prélèvement e 10µL ans un tube Eppenorf pour faire le spectre avant purification. Rinçage e la colonne à l eau, puis avec NaCl 5M, puis avec le Tampon B. Lancement e la chromatographie. Après, prélèvement e 10µL ans un tube pour faire le spectre après purification. 9

11 7. Concentration On cherche à concentrer une protéine qui est trop iluée. On a un système avec un tube collecteur au-essus uquel on place une membrane qui possèe es pores. On verse sur la membrane le tampon contenant la protéine, puis on centrifuge : la protéine trop grosse ne passe pas au travers es pores e la membrane tanis que le tampon la traverse et tombe ans le tube. On peut répéter l opération ainsi jusqu à l obtention e la concentration voulue pour la protéine. On met la protéine ans le concentrateur. Centrifugation 30 minutes à rpm plusieurs fois jusqu à un volume environ 2mL. Vfinal=2,3mL e ZraP Nter ans Tampon B à une concentration Cfinale=28,8mg/mL. 8. Décontamination u fer lié à ZraP par la ferrozine On utilise u Dithionite qui permet la réuction u Fer III en Fer II, puis e la ferrozine qui se lie avec le Fer II pour former un complexe. La réaction se fait en présence e Guaniine pour énaturer ZraP afin e renre le fer accessible. Quan le Fer II se complexe à la ferrozine, la solution evient violette. Pour séparer ZraP u complexe fer II-ferrozine, on fait passer la solution sur une colonne PD10 lavée à la Guaniine et on récupère es fractions. Au ébut elles sont très pures, puis e moins en moins pures. Complexation u fer : 650µL e ZraP Nter ans Tampon B à 28,8mg/mL. 650µL e Guaniine 8M. 7mg e Dithionite. 140µL e ferrozine 5mM. Incubation 30 minutes. Décontamination sur colonne PD10 Lavage e la colonne avec 25mL e Tampon C : Guaniine 4M et Hepes ph8,5 50mM. Chargement e la protéine sur la colonne Vprot=1,5mL. Le volume total e chargement oit être e 2,5mL, onc ajout e 1mL e Tampon C. Collecte e 7 tubes en éluant par fractions e 500µL. Re-écontamination si nécessaire sur une colonne propre équilibrée ans le Tampon C. 10

12 9. Dialyse On purifie une molécule grâce à un mécanisme équilibration es concentrations entre eux milieux : ici, cela permet e re-naturer ZraP en éliminant la Guaniine. On place le tampon contenant la protéine ans un tube e ialyse : c est un tube avec une membrane ans laquelle on retrouve es pores, plus ou moins grans suivant la taille e la molécule à purifier. On place ce tube ans un gran bain contenant le même tampon que celui se trouvant avec la protéine, mais à une concentration plus faible. Ainsi, la concentration entre le bain et le tube va s équilibrer, et u tampon va sortir, l échantillon va onc être plus pur et ZraP aura retrouvé sa structure tertiaire (repliement) et quaternaire (tétramère e imère). Dialyse sur la nuit es 6 fractions récoltées (Vtotal=3mL) ans Tampon D : Hepes ph8,5 50mM / NaCl 100mM. Concentration e la protéine à 0,83mM. 10. Métallation On met u métal qui va se fixer sur les sites e liaison e la protéine. Puis on rajoute e l EGTA, une molécule qui fixe les ions métalliques. On va ainsi éliminer les ions métalliques restés en solution ainsi que ceux qui sont liés à ZraP e manière non spécifique. On effectue ensuite une ialyse pour éliminer le métal qui n est pas fixé à la protéine, c est-à-ire le métal lié à l EGTA et s il y en a, u métal resté libre en solution. Préparation es solutions : ZraP Nter à 0,25mM : 33µL e ZraP Nter + 76,8µL e Tampon D CuCl2 à 25mM : 60,34mg ans 7,07mL eau puis ilution par 2. ZnSO4 à 25mM : 65,5mg ans 7,3mL eau, puis ilution par 2. 11

13 Métallation : Pour le cuivre, mesure es spectres e 800nm à 240nm, blanc avec le Tampon D : On rajoute entre chaque spectre 1 équivalent e cuivre à 0,25mM : 1équiv : 110µL ZraP Nter + 1,1µL CuCl2 (Vfinal=111,1µL) 2équiv : 111,1µL ZraP Nter + 1,12µL CuCl2 (Vfinal=112,2µL) 3équiv : 112,2µL ZraP Nter + 1,13µL CuCl2 (Vfinal=113,3µL) 4équiv : 113,3µL ZraP Nter + 1,14µL CuCl2 (Vfinal=114,4µL) 2,3µL EGTA 100 mm, ph7,5 Dialyse sur la nuit à 4 C avec u Tampon D pour enlever l excès e cuivre, et le cuivre lié à l EGTA. Au zinc : On suit le même protocole que pour le cuivre, mais on ne peut pas observer e spectre avec le Zinc, onc on met 4 équivalents e Zinc (4,49µL) + 2,3µL EGTA, puis ialyse sur la nuit à 4 C avec u Tampon D. Au cuivre et au zinc : On suit le même protocole mais avec 2 équivalents e cuivre (2,25µL) + 2 équivalents e Zinc (2,25µL) + 2,3µL EGTA, puis ialyse sur la nuit à 4 C avec u Tampon D. 11. Dosage Brafor On cherche à connaitre la concentration e protéine ans es échantillons. On utilise pour ce osage u bleu e Coomassie qui pour propriétés e se fixer aux acies aminés aromatiques ou basiques et e changer e couleur, et onc absorbance (qui passe e 465nm à 595nm après fixation avec la protéine). On effectue une gamme étalon avec une protéine e concentration connue à 595nm afin e éterminer le coefficient e proportionnalité Ɛλl permettant e passer e l Absorbance à la Concentration en utilisant la loi e Beer-Lambert Aλ=ƐλlC. Puis, on pren les valeurs Absorbance e nos échantillons e protéines et on étermine grâce à la valeur e la pente e la courbe Abs=f(conc) la concentration es échantillons e ZraP. Préparation e la gamme étalon : Avec e la BSA commerciale à 1mg/mL et le colorant ilué 5 fois à l eau istillée. Volume e BSA (µl) Volume Tampon D (µl) Volume colorant 5X (µl)

14 Préparation es solutions : Métal Cuivre Zinc Cuivre/Zinc Volume protéine (µl) Volume e Tampon D (µl) Volume e colorant 5X (µl) 900 Incubation entre 5 minutes et 1 heure. Mesure es Absorbances à 595nm. 12. Dosage es métaux au PAR On cherche à éterminer le nombre e molécules e métal fixé sur la protéine. On utilise pour cela e la Guaniine HCl qui va énaturer la protéine et ainsi libérer en solution tout le métal qui était fixé. Quan on met en présence la Protéine/Guaniine HCl et la solution e PAR, le PAR fixe les métaux libres et l absorbance à 514,06nm augmente. On peut ainsi éterminer le nombre e molécule e métal sachant que la DO augmente e 0,032 par µm e métal fixé au PAR. Préparation es solutions : Solution e PAR (4-(2-Pyriylazo)resorcinol) à 10 mg/ml ilué ans u NaOH 0,1M, puis ilution 115 fois ans 50mM Hepes ph7,5 traité au Chelex : Cfinale e PAR=0,4mM. Dilution e la protéine ans e la Guaniine HCl à 8M pour Cfinale Guaniine HCl=4M. Réalisation es spectres : Blanc avec 490µl e Tampon Hepes ph7,5 traité au Chelex + 10µl e PAR 0,4mM (Cfinale=8µM), puis spectre entre 220nm et 700nm. Ajout un volume α e protéine tel que Cfinale protéine= 0,5µM, puis spectre. Ajout un volume α e protéine : Cfinale protéine= 1µM, puis spectre. Et ainsi e suite jusqu à l ajout e 5µM e protéine. 13

15 III. RESULTATS 1. Surexpression e ZraP Nter (en conitions stériles) 1 : Marqueur e PM 2 : 10µL avant IPTG 3 : 10µL après IPTG 4 : 5µL avant IPTG 5 : 5µL après IPTG 6 : 10µL avant IPTG 7 : 10µL après IPTG 8 : 5µL avant IPTG 9 : 5µL après IPTG L expression e ZraP a été testée ans eux Erlens e culture (puits 2 à 5 et 6 à 9). Deux volumes ifférents ont été éposés pour s assurer obtenir es résultats lisibles (quan une trop grane quantité e protéines est éposée on ne étecte plus e banes isolées). On observe ans les puits 3, 5, 7 et 9 u gel es banes très épaisses ont la masse molaire est située entre 10 et 15 kda, ce qui correspon à la taille e ZraP Nter (12,1 kda), onc la protéine est bien présente ans l échantillon. De plus, on constate que l épaisseur es banes corresponant à l échantillon après ajout IPTG est beaucoup plus importante que pour l échantillon avant ajout IPTG, onc il y a bien eu inuction e la surexpression e ZraP Nter par l IPTG. 2. Purification par chromatographie exclusion Run 1 : lysat cellulaire après précipitation au sulfate ammonium 14

16 Analyse es fractions 13F à 3E où s éten le pic Absorbance par électrophorèse sur gel Tris-Tricine.15%. 1/9/14 : Marqueurs e PM 7 : Fraction 14E 15 : Fraction 8E 2 : Surnageant e culture 8 : Fraction 13E 16 : Fraction 7E 3 : Fraction 13F 10 : Fraction 12E 17 : Fraction 6E 4 : Fraction 14F 11 : Fraction 11E 18 : Fraction 5E 5 : Fraction 15F 12 : Fraction 10E 19 : Fraction 4E 6 : Fraction 15E 13 : Fraction 9E 20 : Fraction 3E On voit es banes plus épaisses que les autres, ont la masse molaire correspon à la taille e ZraP Nter, onc la protéine est bien présente ans ces fractions. L intensité e la bane corresponant à ZraP Nter n est pas ifférenciable es autres au niveau es fractions 13F et 14F, ce qui signifie qu il n y a pas suffisamment e protéines ans ces fractions, nous ne les avons onc pas garées. Run 2 : 15

17 Analyse es fractions 15F à 3E où s éten le pic Absorbance par électrophorèse sur gel Tris-Glycine 15%. 1/10 : Marqueurs e PM 6 : Fraction 12E 12 : Fraction 7E 2 : Fraction 15F 7 : Fraction 11E 13 : Fraction 6E 3 : Fraction 15E 8 : Fraction 10E 14 : Fraction 5E 4 : Fraction 14E 9 : Fraction 9E 15 : Fraction 4E 5 : Fraction 13E 11 : Fraction 8E 16 : Fraction 3E Comme pour le run 1, on voit sur le gel es banes plus épaisses que les autres, ont la masse molaire correspon à la taille e ZraP Nter, qui est onc bien présente ans les fractions mises sur gel. 3. Purification par chromatographie échangeuse anions Les fractions récupérées après la chromatographie exclusion sont éposées sur une colonne échangeuse ion (Qtrap e 1 ml). Cette étape est effectuée manuellement. Spectres absorption avant et après purification avec une ilution 13 : Mesures Absorbances avant et après purification avec une ilution 13 (10µL e solution ans 120µL e Tampon B, blanc avec le Tampon B) : Avant : DO280nm=0,644 et DO260nm=0,934 pour 72mL Après : DO280nm=0,245 pour 80mL Conc = (0,245x13)/1,8 = 1,76 mg/ml. 16

18 Avant purification, on observe un pic absorbance avec un maximum à 260nm une valeur e 0,934nm. Après purification, on observe un pic absorbance avec un maximum à 280nm une valeur e 0,245nm. Le pic absorbance étant passé e 260nm à 280nm après la purification, on peut onc ire qu on s est ébarrassé es acies nucléiques, qui sont restés accrochée à la colonne. 4. Elimination u fer contaminant par la ferrozine Suite à l étape e chromatographie échangeuse ion, ZraP présente toujours un pic absorbance autour e 430 nm qui provient e la présence e fer contaminant. Il est éliminé par ajout e ferrozine en conition énaturante. Le fer et la ferrozine sont ensuite séparés e ZraP en passant l échantillon plusieurs fois sur colonne PD10. 17

19 Pour la colonne PD10 1 : Pour la fraction 1, on obtient une absorbance à 566nm e 0, onc il n y a pas e complexe fer II-ferrozine, ce qui signifie que l échantillon est bien écontaminé. Cepenant, pour les fractions 2 à 4, on obtient es valeurs absorbance à 566nm et on observe un pic absorbance bien visible, ce qui signifie qu il y a encore beaucoup e complexe fer II-ferrozine, il faut onc re-écontaminer ces fractions. Pour la colonne PD10 2 : Pour les fractions 1 et 2, on obtient une valeur absorbance à 566nm très faible et on n observe aucun pic, onc il y a très peu e complexe fer II-ferrozine : ces fractions sont suffisamment écontaminées. Mais, pour les fractions 3 à 5, un pic absorbance à 566nm est nettement observable, onc il y a encore beaucoup e complexe fer II-ferrozine : ces fractions sont à reécontaminer. Pour la colonne PD10 3 : Pour les fractions 1 à 3, aucun pic absorbance à 566nm n est observable et les valeurs absorbance sont extrêmement faibles : il y a onc très peu e complexe fer IIferrozine : ces fractions sont suffisamment écontaminées. Néanmoins, on observe un petit pic à 566nm pour la fraction 4, onc il reste u complexe fer II-ferrozine. Comme presque toute la protéine a été écontaminée, il n est pas nécessaire e refaire une quatrième écontamination. 5. Métallation au cuivre La protéine ZraP, maintenant écontaminée u fer qu elle contenait, est utilisée pour étuier la fixation u cuivre. 18

20 On voit que l absorbance augmente e manière uniforme après l ajout un équivalent e cuivre, puis elle iminue brutalement après l ajout EGTA. Cela signifie que le cuivre s est lié à ZraP (augmentation e l absorbance) mais avec une affinité plus faible que celle e l EGTA pour le cuivre car l ajout EGTA a conuit au épart u cuivre probablement lié au niveau e sites non spécifiques. Cela pourrait signifier qu il n y a pas e sites e fixation au métal sur ZraP Nter. 6. Dosage Brafor Courbe étalonnage : Volume e BSA (µl) Volume Tampon D (µl) Volume colorant 5X (µl) 900 DO595nm 0 0,1518 0,245 0,27 0,629 0,876 Mesure es absorbances es solutions : Métal Cuivre Zinc Cuivre/Zinc Volume protéine (µl) Volume e Tampon D (µl) Volume e colorant 5X (µl) 900 DO595nm 0,137 0,15 0,237 0,257 0,173 0,164 0,29 0,309 0,142 0,148 0,21 0,216 Détermination es concentrations : D après la courbe, C = (A-0,0755)/0,0544 ainsi : ZraP Nter /Cuivre : 1,25µg pour 1µl et 3,15µg pour 2µl = 1,4mg/ml ZraP Nter /Zinc : 1,7µg pour 1µl et 4µg pour 2µl = 1,85mg/ml ZraP Nter /Cuivre/Zn : 1,3µg pour 1µl et 2,46µg pour 2µl = 1,25mg/ml 19

21 7. Dosage es métaux liés à ZraP par le PAR Pour confirmer l absence e métal sur ZraP Nter après traitement avec u cuivre et/ou u zinc puis ajout EDTA, la protéine ialysée (pour éliminer l EDTA-métal) est traitée avec u PAR. À 514,06nm, on remarque que l absorbance n augmente pas quan on rajoute la protéine. Donc, aucune molécule e métal ne s est fixé au PAR : cela signifie qu aucune molécule e métal n a été fixée par la protéine ZraP Nter. Cela confirme qu il n y a pas e sites e fixation sur ZraP Nter, onc il semblerait que les sites e fixations soient situés sur la partie N terminale e la protéine ZraP. 20

22 CONCLUSION Sur le projet ZraP ZraP est une métalloprotéine prouite par les bactéries lorsque celles-ci se retrouvent ans un environnement où il y a une quantité très importante en métaux. Elle fixe les métaux et permet ainsi aux bactéries e survivre ans un tel environnement. Au cours e ce stage, nous avons montré que les sites e fixation aux métaux impliquent la partie N terminale e ZraP en effectuant es expériences e métallation sur la protéine, à laquelle nous avons enlevé la partie N terminale. Afin e confirmer les résultats obtenus suite aux manipulations effectuées, ces ernières vont être répétées sur ZraP Nter une secone fois. Nos expériences montrent que l extrémité N-terminale est nécessaire à la fixation es métaux, mais pas qu elle est suffisante. En effet, il est possible que l extrémité C-terminale joue aussi un rôle car elle porte aussi es histiines. Des expériences vont onc être réalisées sur la protéine à laquelle la partie C terminale sera enlevée, ainsi qu à la protéine où les eux extrémités N terminale et C terminale seront enlevées. Les essais e mutagenèse sont en cours. Sur le stage Ce mois e stage a été une expérience formiable qui m a permis à la fois e onner plus e réalité aux cours e Biochimie en L1, mais qui m a également permis acquérir une expérience et une certaine aisance, ainsi que certains gestes pour le bon éroulement es manipulations ; qui me seront très utiles pour mes projets e formation. Grâce au stage, j ai pu me faire une vraie iée u mone e la Recherche : j ai pu parler avec e nombreuses personnes qui m ont raconté ce qu elles faisaient m ont onné énormément e conseils, en rapport avec le stage, mais aussi mes projets étue. Sur le ispositif stage excellence Je trouve que c est une très bonne initiative e la part e l Université, autant que l on m a it qu il était rare pour une personne étant en première année e faire un stage. À ce stae e notre formation, on ne sait pas forcément ce que l on veut faire plus tar, onc ce stage permet avoir un premier contact avec le mone e la Recherche. Par ailleurs, il nous permet explorer ifférents omaines ont on a pu entenre parler qui pourraient nous intéresser pour notre projet avenir (biochimie, neurosciences, génétique, immunologie ), mais que l on n a pas l occasion approfonir en cours. 21

23 ACTIVITES ANNEXES 1. Projet CnrX Au cours e mon stage, je me suis intéressé à un projet concernant la protéine CnrX présente ans la bactérie Cupriavius metalliurans CH34, une autre bactérie ayant la capacité e résister aux métaux. CnrX est une protéine senseur périplasmique faisant partie u complexe tri-protéique CnrYXH, qui permet la régulation e l expression es gènes impliqués ans la résistance aux métaux (Nickel, Cobalt). En réponse à la présence e métaux, CnrYX libère CnrH, un facteur sigma e fonction extracytoplasmique qui permet la résistance. L équipe cherche à comprenre comment le omaine senseur e CnrX étecte les ions métalliques, comment se fait la sélection spécifique u Nickel ou u Cobalt, et quelle est la nature u signal permettant cela. Plusieurs hypothèses ont été faites, et afin e les vérifier, j ai effectué quatre mutagénèses : il s agit introuire une mutation ans la séquence u gène coant pour la protéine intérêt permettant e moifier la séquence e la protéine afin e éterminer si la partie remplacée jouait bien un rôle ans sa fonction. J ai ainsi pu réaliser une PCR, une transformation et amplification e bactéries, ainsi qu une miniprep (purification ADN) afin envoyer l ADN au séquençage pour vérifier si la mutation a fonctionné. Malheureusement, la transformation n a pas fonctionné pour trois mutations, je n ai onc pas obtenu e colonies en présence e l antibiotique e sélection, et je n ai pas eu le temps e refaire les manipulations avant e partir. Mais la quatrième a fonctionné et les résultats u séquençage ont montré que la mutation avait bien marché. 2. Réunions accueil à l IBS J ai participé à la réunion accueil e l IBS : on nous a fait visiter les salles où nous étions susceptibles e travailler, les lieux où trouver les ifférents types e prouits, et on nous a expliqué certaines règles, notamment concernant le tri es échets. On nous a aussi montré comment retirer e l azote liquie et expliqué les angers liés à ce prouit. J ai aussi participé à une conférence et à une réunion e sécurité concernant les ispositifs mis en place nous permettant e travailler ans es conitions optimales e sécurité, ainsi que sur les gestes et comportements à avoir ans certaines situations. 22