Eco-toxicologie et normes de qualité

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1 Les substances dangereuses Eco-toxicologie et normes de qualité Formation pour l Agence de l Eau Loire-Bretagne Orléans, 22/11/2007

2 Objectifs pour la qualité de l eau Concentration dans le milieu Mesures de réduction de la pollution nécessaires NQ Objectif de non détérioration Zéro ou concentration de fond Temps

3 Détermination d une norme de qualité (NQ) = Quality Standard Selon le bruit de fond dans le milieu Par rapport à la limite de quantification analytique Selon des critères de toxicité / écotoxicité Seuls critères retenus pour la Dir. 76/464/CEE et la Directive Cadre sur l Eau Les critères socio-économiques ne sont normalement pas pris en compte pour la fixation d une NQ. Mais l art. 4 ( 4 to 8) de la DCE donne la liste des exemptions pouvant justifier un dépassement des NQ.

4 Normes de Qualité pour l eau (NQ) Normes de Qualité Environnementale (NQE) (=EQS, Environmental Quality Standard) NQE = critère le plus sensible NQ Ecotoxicité pour les organismes aquatiques Ecotoxicité pour les organismes benthiques (sédiments) Bioaccumulation et données de toxicité orale (empoisonnement secondaire des prédateurs) Normes pour la potabilisation de l eau (Dir. 98/83/CE) Valeurs limites dans les poissons, mollusques, crustacés, destinés à la consommation humaine

5 Ecotoxicité aquatique

6 Principe d un test d écotoxicité Après une durée d, on compte le nombre d individus affectés dans chaque récipient Réplicats Effets observés: mortalité, croissance, reproduction C 0 (témoins) C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 Concentrations croissantes en toxique

7 Essais aigus / essais chroniques Toxicité aiguë : quelques heures à quelques jours mortalité inhibition de la mobilité Toxicité chronique : quelques jours à plusieurs semaines inhibition de la croissance inhibition de la reproduction

8 Types d échantillons testés Substances chimiques, pharmaceutiques, cosmétiques, pesticides, etc. Effluents : naturels, rejets industriels, entrée et sortie de station d épuration Sols pollués : sol + éluat Déchets : déchet brut + éluat Boues : boues brutes + éluat Sédiments : sédiment brut + éluat

9 Essais Microtox (Vibrio fischeri) Inhibition de la luminescence d une bactérie marine Mesure de la luminescence à T0 dans du milieu d essai Mesure de la luminescence à T30 min en présence du polluant Détermination de l inhibition de la luminescence de la bactérie par rapport au témoin

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11 Essais sur Pseudomonas putidas Inhibition de la croissance d une population bactérienne Détermination de la concentration cellulaire par opacimétrie après 16 heures de contact avec le polluant Détermination de l inhibition de cette croissance par rapport au témoin

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13 Essais sur algues unicellulaires Inhibition de la croissance des algues Détermination de la concentration cellulaire toutes les 24 heures pendant 72 heures Détermination de l inhibition de cette croissance par rapport au témoin

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16 Essais sur lentilles d eau (e.g. Lemna minor) Inhibition de la croissance des lentilles Détermination du nombre de frondes toutes les 24 heures pendant 96 heures Détermination de l inhibition de cette croissance par rapport au témoin

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18 Essais sur daphnies (e.g. Daphnia magna) Essai aigu : inhibition de la mobilité détermination du nombre de daphnies immobiles par concentration après 24 ou 48 heures d essai Essai chronique : inhibition de la reproduction détermination du nombre de pontes par daphnies pendant 21 jours détermination de l inhibition par rapport au témoin

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22 Essais sur Ceriodaphnies (e.g Ceriodaphnia dubia) Inhibition de la reproduction Détermination du nombre de pontes par cériodaphnies pendant 7 jours Détermination de l inhibition par rapport au témoin

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24 Essais sur rotifères (e.g Brachionus caliciflorus) Inhibition de la reproduction Détermination du nombre de pontes par adulte pendant 48 heures Détermination de l inhibition par rapport au témoin

25 Brachionus caliciflorus

26 Essais sur poissons Test de toxicité aigüe (mortalité à 96 heures) Test de toxicité prolongée (mortalité et effets sub-létaux sur 14 jours) Test de toxicité du stade de l'embryon à l'alevin (des oeufs fécondés aux alevins (i.e. présence du sac vitellin), 5 à 20 jours depuis l éclosion) Test de toxicité aux premiers stades de la vie (des oeufs fécondés aux juvéniles s alimentant, 30 à 60 jours depuis l éclosion) Test de croissance des juvéniles (masse des poissons, 28 jours)

27 Brachydanio rerio

28 Exemples d espèces de poissons couramment utilisées Eau douce Oncorhynchus mykiss (Truite arc-en-ciel) Pimephales promelas (Tête-de-boule) Brachydanio rerio (Danio zébré) Oryzias latipes (Modaka) Oncorhynchus kisutch (Saumon coho) Onchorhynchus tshawytscha (Saumon chinook) Salmo trutta (Truite de rivière) Salmo salar (Saumon de l'atlantique) Salvelinus fontinalis (Saumon de fontaine) Salvelinus namaycush (Truite de lac d'amérique) Esox lucius (Brochet) Catostomus commersoni (Meunier noir) Lepomis macrochirus (Crapet arlequin) Ictalurus punctatus (Barbue de rivière) Jordanella floridae (Fondule de Floride) Gasterosterus aculeatus (Epinoche) Cyprinus carpio (Carpe commune) Eau salée Cyprinodon variegatus ("Sheepshead minnow") Menidia menidia (Capucette) Menidia peninsulae (Athérine américaine)

29 Les protocoles d essais sont standardisés Lignes directrices de l OCDE Accès libre : Normes ISO Payantes Autres normes (US-EPA, ASTM, DIN, MITI, etc.)

30 Principe d un test d écotoxicité Après une durée d, on compte le nombre d individus affectés dans chaque récipient Réplicats Effets observés: mortalité, croissance, reproduction C 0 (témoins) C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 Concentrations croissantes en toxique

31 Relation dose-réponse et détermination des critères d écotoxicité Pourcentage d effets 100% Courbe d ajustement aux résultats expérimentaux (e.g. probit, logit, Hill, ) Variabilité statistique due aux réplicats 50% x% 0% Témoins NOEC EC x EC 50 Concentrations en toxique (échelle log) NOEC: Plus forte concentration testée pour laquelle les effets observés ne sont pas significativement différents de 0 EC50: concentration modélisée pour laquelle on s attend à observer des effets sur 50% d une population d une espèce

32 Toxicité chronique / toxicité aiguë Toxicité aiguë : quelques heures à quelques jours effets létaux à court terme : mortalité / inhibition de la mobilité Concentration dans le milieu Seuil de toxicité aiguë (EC50) Toxicité chronique : quelques jours à plusieurs semaines effets à long terme : - inhibition de la croissance - inhibition de la reproduction Seuil de toxicité chronique (NOEC ou EC10) Temps

33 Validité d un test: pertinence et fiabilité du protocole expérimental Propriété de la substance testée - type de contamination : statique, renouvellement? - flacons bouchés, espace de tête? - utilisation d un solvant? - suivi analytique? Volatilisation Biologie des organismes testés e.g.: - physico-chimie du milieu d essai - durée de l essai - ages / taille / poids origine des organismes - densité de la population Adsorption sur les parois Concentration dans le milieu d essai? Mauvaise solubilisation Témoins?

34 Au moins 3 niveaux trophiques doivent être testés Consommateurs secondaires Poissons Consommateurs primaires Zooplancton (e.g. daphnies) Phytoplancton (algues unicellulaires) Producteurs primaires

35 Les écosystèmes sont bien plus complexes!

36 Extrapolation d une NQ à partir des critères d écotoxicité (1) Une méthodologie européenne Principes fondamentaux dans l Annexe V de la Directive Cadre sur l Eau Principes détaillés dans Lepper (2005) D après le guide technique en support à la directive 93/67/CEE concernant l évaluation des risques de substances nouvelles et au règlement (CE) No 1488/94 concernant l évaluation des risques pour les substances existantes (= TGD) La NQ est basée sur une PNEC (= Predicted No-Effect-Concentration)

37 Extrapolation d une NQ à partir des critères d écotoxicité (2) Hypothèses et principes EC50 : effet médian court terme pour quelques espèces en laboratoire NOEC : faible effet chronique pour quelques espèces en laboratoire effet médian pas d effet court terme long terme quelques espèces ensemble des espèces laboratoire milieu naturel quelques espèces ensemble des espèces laboratoire milieu naturel NQ = PNEC : pas d effets prédits pour l écosystème

38 Facteurs d extrapolation (= Assessment Factors, AF) = Facteurs de sécurité. Prendre en compte les incertitudes et la variabilité des données PNEC = Min (données) AF Facteurs préconisés en Europe pour l eau douce : Données disponibles 3 données de toxicité aiguë (EC50) (poissons, daphnies et algues) 3 données de toxicité aiguë + 1 donnée de toxicité chronique (NOEC) (poissons ou daphnies) 3 données de toxicité aiguë + 2 données de toxicité chronique (NOEC) (poissons et/ou daphnies et/ou algues) 3 données de toxicité aiguë + 3 données de toxicité chronique (NOEC) (poissons et daphnies et algues) Données de terrains ou mésocosmes AF Au cas par cas Meilleure connaissance sur la toxicité de la substance = baisse de l incertitude Les sensibilités des espèces sont conditionnées par leur taxonomie?

39 Particularités pour le milieu marin Il est admis que le milieu marin accueille un nombre importants de taxons (plus grande biodiversité). Le réseaux trophique est plus grand et plus complexe. De plus, certaines espèces sont spécifiques au milieu marin. D où l emploi de facteurs d extrapolation plus importants. Les données d écotoxicité disponibles pour les eaux douces et les eaux marines peuvent être utilisés conjointement (les premières devant toutefois être jugées pertinentes pour le milieu marin).

40 Species Sensitivity Distribution (SSD) Plus de 10 (préférentiellement 15) NOECs long terme pour des espèces différentes couvrant au moins 8 groupes taxonomiques d.d.p 0.4 Distribution statistique: empirique ou modélisée (e.g. loi Normale, logistique, Weibull, etc.) PNEC = HC5% (données) AF x% avec AF pouvant aller de 5 à 1 (nombre d espèces et représentativité, qualité de l ajustement, intervalle de confiance, etc.) Parce qu il existe toujours des incertitudes! 0.0 x ème percentile concentration affectant x% des espèces testées (HCx%) NOECs long terme Les sensibilités des espèces sont indépendantes de leur taxonomie?

41 Species Sensitivity Distribution (SSD) Fonction de répartition : i.e. probabilités cumulées SSD x% Algues Crustacés Poissons Insecte Plantes supérieure Mollusque loi normale l o g NOE C ( µg / l ) x ème percentile

42 La biodégradabilité

43 Biodégradabilité primaire / biodégradabilité ultime Biodégradabilité primaire : dégradation de la molécule en métabolites Biodégradabilité ultime : dégradation complète de la molécule et formation produits ultimes : Dégradation aérobie : Substance (COD) + O2 CO 2 + H 2 O + Biomasse bactérienne Dégradation anaérobie Substance (COD) CH 4 + H 2 O + Biomasse bactérienne

44 Exemple du glyphosate

45 Principes des essais de biodégradabilité Dosage de la molécule Dosage du carbone organique dissous (COD) Dosage de la consommation en oxygène Dosage de la production de dioxyde de carbone Dosage du méthane

46 Exemple : essai de dégagement du CO 2 (Sturm) Mise en présence de la substance à étudier et de microorganismes provenant de STEP Mesure de la quantité de CO 2 produite en 28 jours et comparaison avec la quantité théorique de CO 2 (fonction de la concentration de la substance à tester) Substance considérée comme facilement dégradable si la dégradation est supérieure à 60 % en 28 jours

47 Dispositif du Sturm Air comprimé Régulateur de débit Piégeage CO 2 et H 2 O Dégagement de CO 2 Pompe Flacon d'essai Solutions d'hydroxyde de baryum Ba(OH) 2 + CO 2 BaCO 3 + H 2 O Dosage du Ba(OH) 2 résiduel par titrimétrie à l HCl

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49 La bioaccumulation

50 Determination du facteur de bioconcentration (BCF) C env Suivi de la concentration en polluant dans l eau et le poisson pendant au moins 28 jours k 1 k 2 C in C in (t ) dc dt Cin in = k Cenv k C 1 2 in k1 k t = 1 2 ( ) k Cenv 2 e BCF. C env. BCF = C in k 1 = C env k 2 t

51 Bioconcentration, bioaccumulation, biomagnification bioconcentration (BCF) : concentration directe par voie aqueuse (branchies et épiderme) Bioaccumulation (BAF) : concentration par voie aqueuse et par la nourriture Biomagnification (BMF) : concentration dans la chaîne trophique

52 Exemple du DDT

53 Cas des substances hydrophobes

54 Qu est ce qu une substance hydrophobe? BCF Koc Kow Affinité pour les lipides Affinité pour le carbone organique Affinité pour l octanol

55 Relation entre le Kow et le BCF log BCF = 0,76 log K OW 0,23 r 2 = 0,82

56 Relation entre le Kow et le Koc Relations entre KOC et KOW observées dans les eaux de surface de Green Bay, lac Michigan (source: Achman et al., 1993).

57 Comportement des substances hydrophobes dans l environnement aquatique Adsorption sur les MES Kp Dissous (filtré à 0.45 µm) Contamination via l eau BCF BMF 1 BMF 2 Empoisonnement secondaire? Ecotoxicité pour les organismes Sedimentation benthiques? Remise en suspension Contamination via les sédiments Pollution historique

58 Ecotoxicité pour les organismes benthiques (sédiments)

59 Les sédiments constituent un écosystème (complexe) à part entière La toxicité des contaminants dans les sédiments dépend de nombreux facteurs : - Facteurs physiques : granulométrie, teneur en eau, en gaz, température, etc. - Facteurs chimiques : teneur en matière organique, conditions redox, ph, teneur en ammoniaque, sulfures, etc. - Facteurs biologiques : Densité du macrobenthos, activité microbienne, etc. From US-EPA (1993). Provisional guidance for quantitative risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons. EPA/600/R-93/ Activités humaines: dragage, transport fluvial, etc. - Conditions hydrologiques et météorologiques Standardisation difficile pour les tests écotox et le monitoring

60 Essais écotox pour les organismes benthiques Des bioessais normalisés sur sédiments ont été développés pour quelques organismes benthiques Chironomus (larves) Le sédiment (prélevé dans le milieu ou reconstitué) est contaminé en laboratoire par des concentrations croissantes de la substance relation dose-réponse Tubifex Plusieurs facteurs à contrôler : type de sédiments, procédure de contamination, période d équilibration, facteurs physico-chimiques et autres facteurs expérimentaux. Standardisation représentativité Hyalella Tests coûteux Rares

61 Essais sur chironomes (e.g. Chironomus riparius) Détermination de la mortalité des larves : lecture à 10 jours Détermination de la taille de la capsule céphalique des larves après 10 jours Détermination du pourcentage d émergence des adultes après 28 jours d essai Détermination du pourcentage de mortalité et du pourcentage d inhibition de la croissance et du développement par rapport au témoin

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67 Essais sur hyalelles (e.g. Hyalella azteca) Détermination de la mortalité des organismes : lecture à 14 et 28 jours Détermination de la taille des organismes après 14 et 28 jours Détermination du pourcentage de mortalité et du pourcentage d inhibition de la croissance par rapport au témoin

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71 L approche de l équilibre de partage Dissous (filtration à 0.45 µm) Concentration toxique pour une espèce aquatique (mg/l) Équilibre? Kp (coefficient de partage) Hypothèse que seule la fraction dissoute dans l eau interstitielle induit un effet Adsorbé sur les sédiments Concentration toxique pour les espèces benthiques (mg/kg sed ) - Caractéristiques du sédiment - Ingestion de particules - Spécificité biologiques des espèces benthiques Historic pollution sont ignorées!

72 µg kg sed Csed ρ sed = Feaused. Ceau concentration dans les sédiments [µg/m 3 3 kg µg µg sed m eau L m kg solide solide 3 3 L m kg sed msed m eau msed solide msolide. solide 3 sed ] concentration dans l'eau [µg/m 3 sed ] Fsolidesed. Csolide. ρ concentration adsorbée [µg/m 3 sed ] par défaut par défaut par défaut par défaut 1150 kg/m kg/m 3 ( Fsolide =1 ) sed Feau sed or L kg solide Kp = sed C C solide eau et Kp kg oc kgsolide sed = Focsed. L kg oc Koc. par défaut 0.1 Peut s estimer à partir du Kow C eau = ( Feau.1000) + ( Fsolide. Kp. ρ ) sed C sed. ρ sed sed sed solide Soit, avec les paramètres par défaut :. C eau = C sed Koc

73 Facteurs importants pour l adsorption sur les particules sédimentaires SiO 2 silicates sables & cherts Galets Graviers roches argileuses latérites & bauxites (Al,Fe)2O 3 xh 2 O argiles hydratées rare ou impossible calcaires & dolomites (Ca,Mg)CO 3 carbonates Sable Limon Nature de la matrice rocheuse e.g. teneurs en oxydes de Fe et Mn associés à un forte adsorption des métaux Teneur et nature de la matière organique Granulométrie Argiles Particules fines grande surface spécifique

74 Devenir du toxique dans les sédiments: un système dynamique, hors équilibre Resuspension / redéposition La fraction adsorbée ou séquestrée dans les couches inférieures n est plus biodisponible? Diffusion Adsorbé Kp Pollution historique Dissous Mais, - diffusion vers les couches supérieures - resuspension de sédiments contaminés

75 Les contaminants (y compris la pollution historique) peuvent être mobilisés après la resuspension des sédiments Bioturbation Dragage, navigation, etc. Crues et pluies intenses Maintenance des barrages

76 Evaluations in situ - analyse chimique en laboratoire de sédiments prélevés in situ - bioessais en laboratoire sur des sédiments prélevés in situ - observation in situ de l abondance et/ou de la diversité des espèces e.g. SLC, AET, Triad, etc... NQ spécifiques à des sites, mais peu spécifiques par rapport aux substances (interactions de nombreuses substances et autres facteurs)

77 Conclusion pour les sédiments Est-il possible / pertinent de faire des NQ pour les sédiments? Suivi des tendances temporelles?

78 (Eco)toxicité orale pour les prédateurs et l homme

79 NQ dans le biota: tenir compte de l empoisonnement secondaire Empoisonnement secondaire Biota : indicateur intégratif de la contamination du milieu

80 Monitoring dans le biota: développements nécessaires Lymnea - Choix des espèces à suivre harmonisation et représentativité. Alternatives possibles: DGT, SPMD, etc. Dreissena - Protocole d échantillonnage fréquence, âge des organismes Membrane synthétique - Méthodes analytiques Gel de diffusion Gel + résine e.g Diffusive Gradient in Thin-film (DGT)

81 Données de toxicité pour les prédateurs DOSE JOURNALIERE CONCENTRATION TOXIQUE kg µg corporelle µg. jour tox kgfood tox PNEC orale = TOX orale / AF AF orale Nourriture contaminée (e.g. maïs, blé, etc.) animaux de laboratoire (e.g. souris, canard, caille, etc.) Représentativité pour les écosystèmes aquatiques?

82 Facteurs de conversion DOSE JOURNALIERE CONCENTRATION kg corporelle. jour kgfood Facteurs d extrapolation

83 Vers une méthodologie harmonisée pour les normes de qualité environnementale

84 Très grande variabilité entre les NQ des différents Etats Membres Facteur de différence pouvant aller jusqu à 1,000,000!!! Les données et la méthodologie utilisées par les Etats Membres ne sont pas nécessairement transparentes - NQ basées sur les critères d (eco)toxicité? - Exhaustivité et validité des données sources? - Méthodologie utilisée? (facteurs d extrapolation, nombre de niveaux trophiques couverts, etc.)

85 Vers une méthodologie harmonisée au niveau européen Méthodologie En accord avec l Annexe V de la DCE Doit être fondée scientifiquement Doit être opérationnelle et gérable NQE européennes révisées / NQE pour les nouvelles substances prioritaires (2009) Méthodologie pouvant être utilisée aussi pour les NQE nationales

86 Documents clef Technical guidance document for risk assessment: i.e. TGD (EC, 2003) Evaluation du risque gestion du risque La gestion du risque doit faire la balance entre ce qui est désirable pour la qualité de l environnement et ce qui est raisonnablement acceptable d un point de vue technique et économique. Analyse coûts / bénéfices. Rérérence possible à l art. 4 ( 4 to 8) de la DCE.

87 Documents clef Méthodologie utilisée pour les 33 premières substances prioritaires (FHI, 2005) Approche intégrée cherchant à couvrir l ensemble des risques pour ou via l environnement aquatique Mais des questions méthodologiques restant en suspens

88 Documents clef Etat des lieux sur les problèmes méthodologiques en suspens (INERIS/OIEau, 2006) Revue générale, pas un guide technique

89 Documents clef Technical guidance document for EQS setting (2008) Guide technique pour la méthodologie de fixation des NQE. Doit être disponible pour

90 Problèmes en suspens Problèmes méthodologiques (NQE pour les sédiments, pour les biotes, biodisponibilité et NQE pour les métaux, NQE pour les HAPs, etc.) Comparaison avec les données de monitoring : que faire si NQE < LQ? Que faire en cas de données insuffisantes? Attendre les données issues de REACH?, utilisation de (Q)SARs?, financement pour générer des données supplémentaires? Que faire en cas de grosses incertitudes? Facteurs d extrapolation importants (principe de précaution). Mais des NQE très strictes peuvent poser des difficultés socio-économiques. Paradigme substance-par-substance? concept one-out all-out Cocktails de toxiques?

91 Que faire si NQE < LQ? La limite de quantification (LQ) doit respecter le critère 30% NQE (proposition provisoire pour les spécifications techniques de la surveillance chimique Quel est le facteur de sécurité utilisé pour dériver la NQ? Produire de nouveaux tests écotox pour réduire les facteurs de sécurité La matrice analysée est-elle appropriée? Pour les substances hydrophobes, préférer le suivi dans les matrices solides (sédiments, MES) ou le biota Méthodes analytiques utilisées? Encourager le progrès technique et la diffusion de méthodes analytiques performantes Substance extrêmement toxique ou effets à très faibles doses? Méthodes alternatives: biomonitoring, (biomarqueurs et bioindicateurs)

92 Approches alternatives : les mésocosmes et les approches terrain

93 Des bioessais aux écosystèmes MODÈLES DÉVELOPPEMENT VALIDATION AMÉLIORATION LABORATOIRE MILIEU NATUREL ESPÈCES ISOLÉES CHAÎNES TROPHIQUES MICROCOSMES RIVIÈRES ARTIFICIELLES MARES EXPÉRIMENTALES ENCEINTES ÉCOSYSTÈMES NATURELS - + COMPLEXITÉ ET REPRÉSENTATIVITÉ RÉPLICABILITÉ + -

94 Les mésocosmes «Unités expérimentales à ciel ouvert limitées et partiellement encloses, simulant le milieu naturel» (ODUM (1984)) Reproduire à l échelle du laboratoire un écosystème simplifié possédant un nombre réduit d espèces caractéristiques des principaux niveaux trophiques Évaluer les effets de substances chimiques sur les écosystèmes aquatiques Évaluer le devenir de substances chimiques dans les écosystèmes aquatiques Généralement placés dans des conditions climatiques naturelles Biotope et biocénose plus complexes que lors des essais de laboratoire : contiennent du sédiment regroupent des espèces de différents niveaux trophiques ; les poissons ne sont pas toujours présents

95 Exemple de système lentique Système lentique = système statique simulant un lac ou une étendue d eau INRA Rennes : mésocosmes lentiques de 18 m 2

96 Exemple de système lentique Système lotique = système dynamique simulant un cours d eau INERIS : mésocosmes lotiques de 20 m de long

97 Mésocosmes INERIS : zone amont

98 Mésocosmes INERIS : zone aval

99 Piège en tubes pour invertébrés pélagiques

100 Piège à émergence - Cage à limnées

101 Les bio-indicateurs «Espèces ou groupes d espèces, qui par leur présence et/ou leur abondance, sont significatifs d une ou de plusieurs propriétés de l écosystème dont ils font partie» Font appel à la connaissance fine de la structure et du fonctionnement des écosystèmes La comparaison de la composition floro-faunistique des stations permet de les classer selon le degré de perturbation de leur qualité biologique

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103 Exemples de bio indicateurs L indice diatomée L indice oligochètes L IBGN Suivis des populations de poissons

104 Approches alternatives : les biomarqueurs biochimiques

105 Les biomarqueurs biochimiques «Mesures dans des liquides biologiques, des cellules ou des tissus, qui indiquent en terme biochimique la présence de contaminant ou le niveau de réponse de l organisme exposé» Présence de polluants dans le milieu Présence de polluants dans l organisme Réponse de l organisme aux polluants Réponse des populations ou des communautés aux polluants Analyses chimiques Biomarqueurs d exposition indiquent que le polluant présent dans le milieu a pénétré dans l organisme Biomarqueurs d effets au niveau individuel indiquent que le polluant exerce un effet, toxique ou non, sur une cible critique Bio-indicateurs d après Lagadic et al., 1997 Un indicateur précoce, mais ponctuel, réversible, saturable

106 Poissons prélevés dans le milieu Autres échantillons environnementaux (eau, sédiment) Échantillon de tissu, liquide biologique ou cellules ANALYSES CHIMIQUES Fractionnement par HPLC Test d activité des différentes fractions Identifications des composés responsables de l activité (GC/MS) Tests in vitro sur cultures cellulaires ADN BIOCHIMIE ARNm ADNc biologie moléculaire protéine anticorps immunochimie enzyme activité enzymatique enzymologie

107 Exemples de biomarqueurs biochimiques BIOTRANSFORMATION Glutathion-S-transferase EROD Acétylcholinestérase NEUROTOXICITE Glutathion Vitellogénine Glutathion peroxydase PERTURBATION ENDOCRINIENNE Spiggin Lipoperoxydation STRESS OXYDANT

108 Exemple : les perturbateurs endocriniens Substances qui «interfèrent avec les processus de synthèse, de sécrétion, de transport, d action ou d élimination des hormones responsables de l homéostasie, de la reproduction et du comportement» (Kavlock et al., 1996) «Substances exogènes qui provoquent des effets néfastes sur la santé d un organisme ou de sa descendance, secondairement à des changements de la fonction endocrine» (OCDE, 1997)

109 Perturbateurs endocriniens et environnement Populations d'alligators du lac Apopka : diminution du taux d'éclosion, prédominance des femelles, pénis anormalement petit chez les mâles, modifications des concentrations plasmatiques en hormones sexuelles. Truites exposées aux effluents de STEP : production anormale de vitellogénine chez des truites mâles.

110 Interaction avec le récepteur des oestrogènes (ER) HSP ER noyau Gènes oestrogéno-régulés ERE ADN cytoplasme ARNm ARNm protéine Réponse cellulaire aux hormones Estradiol (E2) HSP ER noyau Gènes oestrogéno-régulés ERE ADN cytoplasme ARNm ARNm protéine Réponse cellulaire aux hormones Xénooestrogènes Estradiol (E2)

111 Approches alternatives : les (Q)SARs

112 QSAR = (Quantitative) Structure Activity Relationship Pharmacocinetique Toxicité Proprieté (Q) S A R Avec ou sans quantification

113 Relation entre le Kow et le BCF log BCF = 0,76 log K OW 0,23 r 2 = 0,82

114 Relation entre le Kow et le Koc Relations entre KOC et KOW observées dans les eaux de surface de Green Bay, lac Michigan (source: Achman et al., 1993).

115 Exemple de QSAR : fixation des phénols sur le récepteur oestrogénique D après Fang et al (2001). Chem Res Toxicol 14,

116 QSARs, SARs, read-across

117 Alertes structurales : exemple la perturbation endocrinienne Les fragments phénols sont susceptibles de se lier aux récepteurs des oestrogènes (ER) Recherche du fragment phénol dans la structure Oc(cccc1)c1 Code SMILES (Simplified Molecular Input Line System) Alerte 2D 3D QSAR Site de fixation sur le récepteur des oestrogénes (ER) Propriétés quantiques de la molécule

118 Exemple de modèles QSARs: la suite EPIWIN Volatilisation Photolyse dans l atmosphère Irritation cutanée Points de fusion, d ébullition, pression de vapeur Écotoxicité aquatique Hydrolyse Biodégradabilité Hydrosolubilité Kow Koc (adsorption) Bioaccumulation

119 Limites des (Q)SARs 5 principes de validation de l OCDE : critère d effet défini? algorithme défini? domaine d applicabilité défini? validation interne et externe? mécanisme d interprétation (si possible)?

120 Approches alternatives : la modélisation en écotoxicologie

121 Principe d un test d écotoxicité Après une durée d, on compte le nombre d individus affectés dans chaque récipient Réplicats Effets observés: mortalité, croissance, reproduction C 0 (témoins) C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 Concentrations croissantes en toxique

122 Relation dose-réponse et détermination des critères d écotoxicité Pourcentage d effets 100% Courbe d ajustement aux résultats expérimentaux (e.g. probit, logit, Hill, ) Variabilité statistique due aux réplicats 50% x% 0% Témoins NOEC EC x EC 50 Concentrations en toxique (échelle log) NOEC: Plus forte concentration testée pour laquelle les effets observés ne sont pas significativement différents de 0 EC50: concentration modélisée pour laquelle on s attend à observer des effets sur 50% d une population d une espèce

123 Exploiter différemment les résultats des bioessais Survie Temps Conc.

124 Survie LC50 Temps Conc. No Effect Concentration (NEC)? Temps

125 Exemples de variation des EC 10 en fonction du temps 2.5 carbendazime EC 10 EC pentachlorobenzene Survie Taille Taille Reproduction 20 Reproduction temps (jours) temps (jours) D après Alda Alvarez et al., 2006 (ES&T)

126 Le modèle DEB (Dynamic Energy Budget) Assimilation Kooijman et al. Reproduction Maintenance Croissance L organisme alloue ses ressources énergétiques pour ses différentes fonctions (Budget énergétique)

127 Le modèle DEB (Dynamic Energy Budget) Assimilation Kooijman et al. Reproduction Maintenance Croissance Les toxiques peuvent affecter l efficacité des transferts énergétiques

128 temps temps temps temps reproduction Concentration dans l organisme Concentration dans le milieu Rejet dans le milieu Gestion dynamique (= dans le temps) du budget énergétique

129 Contact : vincent.bonnomet@ineris.fr