Année universitaire Licence de Sciences et Technologies Mention Sciences de la Vie. Unité d enseignement LV271. Travaux dirigés de

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1 Année universitaire Licence de Sciences et Technologies Mention Sciences de la Vie Unité d enseignement LV271 Travaux dirigés de Biochimie Secrétariat : Bâtiment K, 1 er étage, Porte 102 1

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3 I) Tampon Phosphate TD 1 - ACIDES α AMINES 1) On étudie l acide phosphorique et les divers ions phosphates. Indiquer : a. La nature des espèces prédominantes en fonction du ph. b. L allure théorique de la courbe de neutralisation de l acide phosphorique par la soude. couples acido-basiques : - PO 4 H 3 / PO 4 H 2 - PO 4 H 2 / PO 4 H 2 - PO 4 H 2-3- / PO 4 pk : 2,1 7,2 12,3 2) On désire préparer 500 ml d un tampon phosphate 0,025 mol.l -1 de ph = 7,2. On dispose a. de K 2 HPO 4 (M=174) et de KH 2 PO 4 (M=136) b. d acide phosphorique H 3 PO 4 en solution 5 mol.l -1 et de soude 1 mol.l -1 c. de K 3 PO 4, 3 H 2 O (M=266) et d acide chlorhydrique 5 mol.l -1. Comment peut-on préparer ce tampon dans les 3 cas? Indiquer chaque fois les quantités de réactifs nécessaires. II : Propriétés acido-basiques de l Arginine 1) Si l on disposait d arginine pure (pka : 2,2-9,0 12,5) : - Sous quelle forme majoritaire se trouverait-elle dans l eau pure? - Quel serait le ph de cette solution? - Quels seraient les profils des courbes de dosage de cette solution? - Cette solution pourrait-elle jouer le rôle de tampon? 2) Quelles sont les espèces prédominantes de l arginine à ph 12? Donner la proportion de chaque espèce. 3) Quelle quantité (en mol.) de dichlorhydrate d arginine et quel volume de soude 1 mol.l -1 sont nécessaires à la préparation d un litre de tampon de concentration 0,2 mol.l -1 et de ph 12,0? III : Formules Dessiner la formule développée des acides aminés suivants en précisant les charges éventuelles de chacune des fonctions protonables : - L acide glutamique dans l eau - La tyrosine à ph 12 3

4 IV : Acides-aminés : Electrophorèse et chromatographie Chromatographie sur résine échangeuse d ions. L hydrolyse d un peptide en milieu HCl 6 mol.l -1 et à 105 C fournit un mélange d acides aminés que l on veut séparer par chromatographie sur une colonne de polystyrène sulfoné échangeuse de cation suivant : CH 2 CH CH 2 CH + n X + + n Na + SO - 3, Na+ n SO - 3, X+ n Les acides aminés sont fixés sur la colonne par passage de l hydrolysat ci-dessus sur la résine (RSO 3 - Na + ). Ils sont ensuite élués par des tampons de ph croissant. L analyse des fractions récupérées au bas de la colonne a permis d établir le diagramme suivant : conc. AA tampon ph 3,4 4,25 7,5 11 Sachant que ce mélange est constitué d Arg, Asp, Glu, His, Leu et que les différents acides aminés restent fixés sur la résine d autant mieux que leur charge positive est grande, compléter le diagramme ci-dessus en indiquant à quel acide aminé correspond chacun des pics. Justifier votre réponse. V : Exercice supplémentaire non traité en TD Sur une étagère du laboratoire, vous disposez d une poudre d acide aspartique (pka : 2,1-3,9-9,8). Vous décidez de dissoudre cette poudre dans de l eau distillée. 1- Sous quelle forme allez-vous retrouver l acide aspartique? Justifier votre réponse 2- Après avoir établi le tableau de prédominance, représenter la formule développée de l acide aminé en solution dans l eau. Donner la valeur du ph de cette solution. 3- Sur la même étagère, vous trouvez une solution nommée «Acide aspartique, ph = 4,5». Quelles sont les espèces acido-basiques présentes dans cette solution? Dans quel ratio? NB : pour vos calculs : 10 0,6 = 4 et 10-0,6 = 0,25 4

5 TD 2 PEPTIDES ET PROTEINES Les pka des couples acido-basiques correspondant aux groupements ionisables d un peptide ou d une protéine sont influencés par leur environnement. Toutefois des valeurs moyennes peuvent leur être attribuées : Groupe pka moyen α-cooh (terminal) 3,0 β-cooh (Asp) 3,5 γ-cooh (Glu) 4,5 Imidazole (His) 6,0 + α-nh 3 (terminal) 8,0 SH (Cys) 9,0 OH-phénolique (Tyr) 10,0 + ε-nh 3 (Lys) 10,5 Guanidino (Arg) 12,5 Principaux acides aminés à caractère hydrophobe : Hydrophobes neutres : Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val. Hydrophobes potentiellement chargés : His, Tyr. I : Détermination de structures primaires Un hexapeptide H, traité par HCL 6N à 100 C pendant 24h, fournit une quantité équimolaire de Tyr, Ala, Lys, Gly et Glu. Quelle est la composition de ce peptide? Que pouvez vous déduire des informations suivantes : - H soumis à l action de la trypsine libère deux tripeptides A et B. - Une électrophorèse à ph 6 de l hydrolysat trypsique donne le profil suivant (tenir compte des distances de migration des peptides). A X dépôt B Pôle négatif 5 Pôle positif - Un séquençage d Edman des deux tripeptides A et B donne une Tyr pour A et une Gly pour B. - H soumis à l action de la chymotrypsine libère 1 tetrapeptide. Questions : a) Quelle est la séquence de l hexapeptide (justifier brièvement votre réponse)? b) Donner le phi du peptide A. Faire une échelle de prédominance. Une solution de 2 ml du peptide A dans l eau présente une absorbance à 280 nm de 0,2. Le coefficient d extinction molaire de l acide aminé absorbant à 280 nm est de 4000 mol -1.L.cm -1.

6 Questions : c) Donner le nombre de moles de peptide A en solution (justifier votre calcul). d) Quel nombre de moles de soude faut-il ajouter pour titrer totalement le peptide sous sa forme la plus acide? e) En déduire le volume de soude à ajouter si on ajoute de la soude à la concentration de 1 mmole.l -1. (pka moyen des couples acido-basiques potentiellemnt utilisables: α-cooh terminal : 3,0 ; γ- COOH (Glu) : 4,5 ; α-nh3 + (terminal) : 8,0 ; OH-phénolique (Tyr) : 10,0 ; (Lys) :10,5). II : Structure primaire et électrophorèse Un pentapeptide P, traité par HCl 6N à 100 C pendant 24h, fournit 0,2mmol Asp et 0,1mmol Lys. Aucun autre acide aminé n est détecté. 1) Donner tous les acides aminés susceptibles de composer ce peptide. Justifier. Après traitement par la chymotrypsine, le pentapeptide P donne un tétrapeptide et un acide aminé libre. Le pentapeptide réagit avec le réactif d'edman pour donner PTH-Trp. 2) Quels sont les acides aminés terminaux du pentapeptide? Justifier. Après traitement par la trypsine, le pentapeptide P libère un di- et un tri-peptide. L un des deux donne un composé PTH-Asp après traitement par le réactif d Edman. Une électrophorèse à ph = 7 de l'hydrolysat trypsique donne le profil suivant (tenir compte des distances de migration des di et tripeptides) : dipeptide tripeptide x Pôle négatif dépôt Pôle positif 3) Donner la séquence du pentapeptide. Justifier en précisant les charges nettes des bi et tripeptides à ph 7. Une solution de 4 ml du pentapeptide P présente une absorbance à 280 nm de 0,4. Le coefficient d extinction molaire de l acide aminé absorbant à 280 nm est : 4000 mol -1.L.cm -1. En justifiant brièvement vos calculs : 4) Donner le nombre de moles du pentapeptide P en solution : 5) Quel nombre de moles de soude faut-il ajouter à une solution de 4mL de la forme acide de P pour titrer la totalité de ses fonctions acido-basiques? 6) En déduire le volume de soude à ajouter si on utilise de la soude à la concentration de 0,2 mmol.l -1. 6

7 III : Protéines, Structure primaire et dosage On dispose d une protéine A et de cette même protéine B mutée par substitution d un acide aminé. A l issue de l hydrolyse trypsique, on obtient à partir de la protéine A un peptide A1 de composition : 1 Met, 1 Val, 2 Tyr, 2 Thr, 1 Ser, 1 Pro et 1 Lys ; et à partir de la protéine B deux peptides de composition : -Peptide B1 : 1 Met, 1 Tyr et 1 Arg -Peptide B2 : 2 Thr, 1 Ser, 1 Pro, 1 Tyr et 1 Lys 1) Quelle est la substitution en cause? 2) Pourquoi y a-t-il un point de coupure supplémentaire? 3) Calculer le phi théorique du peptide B1. Justifier en schématisant les fonctions acido-basiques. Données : pka 3 ; 8 ; 10 et 12,5. 4) Quelle est la conséquence de cette substitution sur la mobilité de la protéine B mutée par rapport à celle de la protéine A sauvage lors d une électrophorèse à ph 8.6? 5) Le peptide A1 résultant de la digestion trypsique a été repris dans 1 ml de solution tamponnée à ph 7. L absorption de lumière UV pour la solution du peptide A1 est de 1,4. Trajet optique = 1 cm. ε Tyr OH à 276 nm : Définir l unité du coefficient d extinction molaire. Déterminer en nombre de moles la quantité initiale de peptide A1 utilisée pour faire ce dosage UV. Quelle est en nombre de moles la quantité de protéine A initiale utilisée? 6) A ph 12, l absorbance de la solution de peptide A1 à 295 nm est de 2,4. Quel est alors le coefficient d extinction molaire de la tyrosine? Trajet optique= 1 cm. IV : Protéines : Chromatographie d exclusion et électrophorèse bi-dimensionnelle On dispose d un mélange de quatre protéines globulaires : La protéine A a une masse moléculaire de Da, un phi = 6 ; elle est constituée d une seule sous unité. La protéine B a une masse moléculaire de Da, un phi = 4 ; elle est constituée d une seule sous unité. La protéine C a une masse moléculaire de Da, un phi = 8 ; elle est constituée de deux sous unités identiques reliées par un pont disulfure. La protéine D a une masse moléculaire de Da, un phi = 7 ; elle est constituée d une seule sous unité. 1) Ces proteines sont chromatographiées sur un gel de Dextran (Séphadex) assez faiblement réticulé qui sépare les protéines globulaires entre et Da de masse moléculaire. Enumérer les protéines dans leur ordre de sortie de la colonne de chromatographie. 7

8 2) On répète la même expérience avec un gel fortement réticulé qui ne sépare les peptides et les protéines qu entre 5000 et Da. Enumérer les protéines dans leur ordre de sortie de la colonne de chromatographie. 3) Le mélange de ces protéines est soumis à une électrophorèse bi-dimensionnelle. Identifier les spots sur le gel ci dessous. 4) Le mélange de ces protéines est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante avec et sans β mercaptoéthanol. Faire un schéma du résultat de l électrophorèse dans les deux conditions en précisant le sens de migration, le dépôt et la polarité du gel. V) Exercice supplémentaire non traité en TD La masse moléculaire apparente d une protéine globulaire, après passage sur chromatographie d exclusion, est de Da. De plus, la masse moléculaire apparente de cette protéine purifiée sur gel SDS PAGE sans agent réducteur est de 160 kda. Avec un agent réducteur, la masse moléculaire apparente de la protéine sur gel SDS-PAGE est de 80 kda. Proposer un modèle pour la structure quaternaire de la protéine en justifiant brièvement votre réponse. 8

9 TD3: ACIDES NUCLEIQUES Enseignant : Gress Kadaré EXERCICE 1 Représenter la structure d un dinucléotide. Quelle est la différence entre les ribonucléotides et les désoxyribonucléotides? EXERCISE 2 Supposez que vous vouliez préparer de l ADN dans lequel les atomes de phosphore du squelette sont uniformément marqués au 32P. a) Quels réactifs et quels précurseurs devraient être ajoutés à une solution contenant l enzyme ADN Polymérase I? b) Déterminez la position des atomes radioactifs. EXERCISE 3 La composition du brin d un ADN est : A = 36% et G = 19%. 1) Que peut-on dire des pourcentages de T et de C pour le même brin? 2) Quel est le pourcentage des 4 bases de l autre brin? 3) Les marn qui dérivent de la transcription du brin 1 doivent-ils ou non contenir autant de A que de U et autant de G que de C? Quel est le pourcentage des 4 bases de cet ARN? EXERCICE 4 Un fragment d ADN contient les sites pour les enzymes de restriction suivantes : - Xho I 5..C TCGAG.3 - EcoR V 5..GAT ATC Kpn I 5..GGTAC C 3 1) Représenter les extrémités générées par ces trois enzymes, en précisant (dessin) les extrémités 5 et 3, et aussi le type de coupure. 2) On veut réaliser un marquage radioactif des extrémités 5. a) Quel(s) enzyme(s) et quelle molécule radioactive utiliseriez-vous? Dessinez la formule chimique de la molécule radioactive, indiquez la position du marquage. b) Ce marquage en 5 est-il possible dans les trois types de coupure? Justifiez votre réponse. 3) On veut réaliser un marquage radioactif des extrémités 3. a) Quel(s) enzyme et quelle molécule radioactive utiliseriez-vous? Indiquez la localisation du marquage dans la molécule radioactive. b) Ce marquage en 3 est-il possible dans les trois types de coupure? Justifiez votre réponse. 9

10 EXERCICE 5 Une solution d ADN db est chauffée et ensuite refroidie à la température ambiante pendant deux minutes. Quels sera le changement d absorbance à 260 nm durant le refroidissement? 1) Si la solution est chauffée 5 au dessous de Tm? 2) Si la solution est chauffée 10 C au dessus de Tm? EXERCICE 6 Un plasmide peut exister sous trois formes topologiques différentes. Après extraction et purification, le plasmide pav5 est analysé et caractérisé par électrophorèse sur gel d agarose1%. Avant la migration sur gel, le plasmide a subit différents traitements décrits dans la légende de la figure ci-dessous kb 4,3 3 2,5 2 1,5 1 0,5 Piste 1 : pav5 natif Piste 2 : pav5 digéré par l enzyme de restriction EcoR I. Piste 3 : pav5 traité par une enzyme qui hydrolyse un seul des deux brins d ADN Piste 4 : pav5 traité par une DNAse Piste 5 : pav5 digéré par l enzyme de restriction BamHI Piste 6 : Marqueur de taille exprimé en kilo paires de bases (kb). 1) Quelles sont les caractéristiques principales d un plasmide? 2) Rappeler brièvement le principe d une électrophorèse. 3) Dans le cas de la migration des acides nucléiques, donner le(s) critère(s) de séparation des molécules. Expliquer comment on peut visualiser les espèces ayant migré? 4) Identifiez les différentes formes présentes dans les pistes 1 à 4. A quoi correspond la tache de la piste 4? 5) Combien y a-t-il de sites EcoR I et BamHI sur le plasmide pav5? 6) A partir des bandes des pistes 2, 5 et 6, déduire la taille des fragments de restriction et la taille du plasmide pav5 natif. 10

11 TD4 CLONAGE Le but de ce travail est de cloner un fragment d ADN contenant la phase ouverte de lecture (ORF) complète de la protéine kinase FAK de rat afin de produire cette enzyme chez E. coli. Insertion d une séquence d ADN d intérêt dans un vecteur d expression procaryote et transformation de bactéries compétentes. EXERCICE 1 Le fragment d ADN contenant FAK (4930 pb) est obtenu à partir d une banque d ADNc et il est hydrolysé par EcoRI. Ensuite ce fragment est isolé par électrophorèse sur gel et il sera inséré dans le vecteur plasmidique plv271. Pour cela, ce vecteur qui permet l expression d un transgène dans un système procary-ote, est également hydrolysé par l'enzyme de restriction EcoRI. La taille du vecteur est 2686pb. 1.1 Dessinez un gel d agarose avec les molécules de vecteur et de l insert après électrophorèse. Comment visualiser les espèces moléculaires dans le gel? 1.2 Suite à l'action de l'enzyme EcoRI, donnez le nom, la séquence des extrémités géné-rées et enfin la nature du groupement lié au carbone 5, ou au carbone 3, du nucléo-tide situé à l extrémité 5 ou 3 respectivement, des deux extrémités de l insert et aussi de vecteur. EcoRI SmaI SacI PstI EcoRI Figure 1. Carte de restriction du fragment d ADN contenant l ORF FAK. 1.3 Insertion du fragment FAK dans le vecteur. FAK digéré par EcoRI est mélangé avec le vecteur coupé avec la même enzyme, l incubation se fait à 15 C en présence d un tampon adéquat et de l enzyme ADN Ligase. Questions 1 : Quels sont les produits obtenus après l action de l ADN Ligase? 2 : Quel est le nom de la liaison formée après l action de cette enzyme? 3 : Quelle est la taille des plasmides recombinants? 11

12 plv271 Figure 2: Carte simplifiée du plasmide plv271. Les chiffres à coté des noms d'enzymes indiquent la position des sites de restriction. EXERCICE Suite à l insertion, les produits de la ligation sont utilisés pour transformer des bactéries compétentes. Les bactéries sont ensuite étalées sur un milieu gélosé sélectif sur lequel. Seules les bactéries transformées peuvent croître et se multiplier en formant des colonies isolées. Dix colonies sont alors prélevées et cultivées, séparément, en milieu liquide de façon à amplifier le plasmide qu elles contiennent. Enfin, l ADN plasmidique est extrait de chaque culture pour être ultérieurement analysé. Questions : Quel est l agent de sélection contenu dans le milieu gélosé pour les étalements? Justifiez. En vous aidant de la figure 2, dessinez les cartes de restriction de tous les plasmides obtenus en précisant, quand cela est possible, les positions des sites sui-vants : EcoRI, PstI, SmaI et SacI. Comment différencier les différents ADN plasmidiques obtenus? Quelles sont les enzymes de restriction qu on peut utiliser pour apporter des réponses? Dessinez les profils de digestion obtenus après électrophorèse. Si vous n aviez qu une seule digestion à réaliser, laquelle choisiriez-vous? Parmi les clones analysés, lesquels utiliseriez-vous pour produire l enzyme FAK de rat dans des bactéries? Justifiez. Proposez une stratégie de clonage permettant d'obtenir un seul plasmide recombinant conduisant à l expression de FAK dans des bactéries. 12

13 EXERCICE Après avoir réussi le clonage, on peut exprimer le gène FAK dans le nouvel environnement procaryote et ensuite purifier la protéine FAK recombinante. Questions : Quelle sera la taille théorique de la protéine FAK obtenue après expression dans le système procaryote? Comment le vérifier en pratique, quelle méthode faut-il utiliser? Comment vérifier que la protéine FAK recombinante possède réellement une activité enzymatique (kinase)? Si ce n est pas le cas, quelles sont les hypothèses qui peuvent être évoquées? 13

14 TD 5 PROTEINES STRUCTURE TERTIAIRE Etude de l'hexokinase de la morue de l Atlantique du Nord L hexokinase est un enzyme qui catalyse la phosphorylation des hexoses lors de leur entrée dans la cellule (exemple : glucose + ATP > glucose 6-P + ADP). Cette phosphorylation a pour effet de "piéger" l hexose phosphorylé dans la cellule, la présence du groupement phosphate l empêchant de traverser la membrane pour se retrouver dans le milieu extracellulaire. De plus, les hexoses phosphorylés correspondent à la forme activée de la molécule en vue de leur métabolisation dans les voies cataboliques (glycolyse, voie des pentoses phosphate, ) ou anaboliques (glycogènogenèse, ). 1. Avant de procéder à la purification d une protéine, il faut avoir à sa disposition un test qui permettra de suivre le devenir de cette protéine lors des différentes étapes de purification. Ici, comme la protéine que l on désire purifiée est un enzyme, il a tout d abord fallu mettre au point un test d activité. L'activité enzymatique sera donc suivie par incubation d un volume variable de la fraction testée (prise d essai) dilué dans un mélange réactionnel de volume final égal à 10 ml et contenant un substrat artificiel de l hexokinase ; après 10 minutes d incubation à 37 C, le produit coloré apparu par transformation du substrat artificiel est dosé par mesure de la densité optique (D.O.) à 540 nm. L'hexokinase va être purifiée lors de quatre étapes successives, correspondant à une centrifugation à haute vitesse suivie de trois chromatographies : a. Les foies provenant de plusieurs animaux sont tout d abord prélevés, puis homogénéisés dans un tampon isotonique (Extrait total) avant d être soumis à une centrifugation à haute vitesse ( g) pendant une heure à 4 C. A l issue de cette centrifugation, un surnageant, correspondant à la fraction soluble, ainsi qu un culot sont isolés. b. La fraction soluble est ensuite déposée sur une colonne de chromatographie d exclusion sur gel, et les fractions récupérées présentant une activité enzymatique sont regroupées. c. Puis, ces fractions sont déposées sur une colonne de DEAE-cellulose (chromatographie échangeuse d anions), et, à nouveau, les fractions éluées présentant une activité enzymatique sont regroupées. d. Enfin, ces dernières fractions sont soumises à une chromatographie d affinité dans une colonne constituée de molécules de fructose liées de façon covalente à des billes d agarose, et, après élution, les fractions positives pour le test d activité sont regroupées. Indiquez brièvement les principales caractéristiques des trois chromatographies utilisées lors de la purification de l hexokinase de foie de morue. 2. A chaque étape, la densité optique à 540 nm (D.O.), le volume total (ml) et la concentration protéique (mg.ml -1 ) de chaque fraction sont mesurés. Les résultats correspondant aux fractions positives regroupées à l issue de chaque étape sont présentés dans le tableau suivant : 14

15 Etape de purification Prise d'essai (ml) D.O. (λ=540 nm) Volume (ml) Protéines (mg.ml -1 ) Extrait brut 0,50 0,28 20,0 21 Fraction soluble 0,50 0,29 18,4 14 Filtration sur gel 0,40 0,32 9,8 7 DEAE-cellulose 0,20 0,35 1,9 4 Colonne fructose-agarose 0,05 0,88 0,13 1 Activité enzymatique (UE.mL -1 ) Activité spécifique (UE.mg -1 ) Rendement Facteur de purification a. Les mesures de densité optique ont été réalisées dans les conditions où la loi de Beer- Lambert (D.O. = ε M.C.l) est applicable, avec un trajet optique (l) égal à 1 cm. Sachant que le coefficient d'absorption molaire spécifique (ε M ) du produit est égal à 3600 mol -1.L.cm -1 et qu'une unité enzymatique (U.E.) correspond à la formation d'une micromole de produit à 37 C en 10 minutes, calculer, pour chaque étape de la purification, l'activité enzymatique (UE.mL de préparation -1 ) ainsi que l activité spécifique (UE.mg de protéines -1 ). b. Calculer ensuite, pour la fraction obtenue après chaque étape, le facteur de purification ainsi que le rendement de purification par rapport à la fraction obtenue à l étape précédente, mais également par rapport à l extrait de départ (Extrait brut). 3. Le contenu protéique de la fraction obtenue après la chromatographie d affinité est séparé par électrophorèse monodimensionnelle dans un gel de polyacrylamide en présence d un agent dénaturant (dodécyl sulfate de sodium, ou SDS) après avoir été (piste 2) ou non (piste 1) traité au préalable par un agent réducteur, le ß-mercaptoéthanol. Après la migration les protéines ont été révélées par coloration au bleu de Coomassie. Dans le même temps, on a procédé à une calibration du gel de polyacrylamide par migration de protéines moléculaire est connue (piste 3) Masse moléculaire (Da a. Rappelez brièvement le principe de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en précisant le rôle du SDS et celui du ß-mercaptoéthanol. b. Déterminez la masse moléculaire apparente relative (Mr) des bandes observées sur les pistes 1 et 2. Qu'en déduisez-vous quant à la structure de la protéine purifiée? c. Comment vous assurez de la pureté de la fraction séparée par électrophorèse? 15

16 4. Sachant que le profil électrophorétique observé sur la piste 2 de la figure précédente correspond à ce qui a déjà été décrit pour l'hexokinase isolée d'autres espèces de poisson, nous décidons de produire des anticorps polyclonaux spécifiques de l'hexokinase de morue en injectant à un lapin la fraction éluée de la chromatographie d'affinité. Le sérum préimmun et celui obtenu après immunisation ont été testés en immunoblot soit contre de l'hexokinase commerciale - purifiée par chromatographie d'affinité sur son substrat - soit contre un extrait total de protéines préparé à partir de foie de morue, et séparés par électrophorèse mono- ou bidimensionnelle en conditions dénaturantes a. Interprétez les résultats présentés sur la figure ci-dessous. b. Que pouvez-vous en conclure au sujet de votre protocole de purification? 5. Afin d'identifier la nature du spot supplémentaire reconnu par l'anticorps anti-hexokinase de morue et présent dans l'extrait total de foie de morue mais absent de l'échantillon préparé à partir de l'hexokinase commerciale, une analyse par spectrométrie de masse est réalisée. Avant cela, les deux protéines dont les points isoélectriques sont respectivement égaux à 5,6 et 5,4 sont électroéluées du gel d'électrophorèse, soumises à une digestion par l endolysine C et les peptides obtenus sont séparés par électrophorèse bidimensionnelle et révélés par coloration à l'argent. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure ci-dessous. Les deux profils électrophorétiques ne diffèrent que par le changement de position de deux peptides appelés, pour simplifier, "Peptide 5,6"et "Peptide 5,4" et issus respectivement des protéines de pi 5,6 et 5,4. Que déduisez-vous de ces profils électrophorétiques? OH - -. Electrofocalisation H + - Protéine pi = 5,6 16 Protéine pi = 5,4 Electrophorèse-SDS +

17 Les peptides 5,6 et 5,4 sont extraits du gel d électrophorèse bidimensionnelle et sont analysés par spectrométrie de masse. Les résultats sont présentés ci-desssous : Peptide «5,6 pi 5,6» 3676,55 Peptide 5,4 «pi 5,4» 3756,55 Interprétez ces résultats. Quelle(s) méthode(s) vous permettrai(en)t de les confirmer? 17

18 TD 6 Cinétique michaelienne Représentations P=f(t), vi=f(s), linéarisations de la courbe de Michaelis, activité spécifique et purification de protéine. L exercice 4 : l invertase, ne sera pas traité en td. Questions de cours auxquelles vous devez savoir répondre sans ambiguïté. 1) Réécrire les conditions initiales dans lesquelles sont envisagées les réactions enzymatiques. Définir l état stationnaire. 2) Dans quelles conditions peut-on négliger la réaction de constante de vitesse k -2? 3) Définir la constante de dissociation K D du complexe ES. 4) Définir la constante d association K A du complexe ES. 5) Etablir l équation de Michaëlis-Menten 6) Définir de deux manières la constante de Michaëlis-Menten K M. 7) Dans quelles conditions la constante de Michaëlis-Menten K M peut-elle être assimilée à la constante K D du complexe ES? 8) La constante K M de l enzyme dépend-elle des conditions dans lesquelles elle est mesurée (concentration en enzyme, en substrat, température, ph, force ionique)? 9) De quoi dépend V max? Quelle est la signification de k cat? 10) Définir l unité internationale (UI) Exercice 1 : Diagrammes obtenus lors d études de mélanges enzyme + substrat. Graphique 1 : Avancement de la réaction en fonction du temps, courbe A. 1) Que représente l'ordonnée? Dans quelle condition cette donnée est-elle directement utilisable pour une interprétation quantitative de cinétique? 2) Que peut-on dire de l'ordre apparent de la réaction jusqu'à environ 40 min? Expliciter en termes de cinétique la signification des autres domaines du graphique. 3) Courbe B : par rapport aux conditions expérimentales utilisées pour obtenir la courbe A, quels changements ont été introduits pour obtenir la courbe B? 4) Calculer les vitesses initiales v i (A) et v i (B) en mol.l -1.min -1. en Absorbance 420nm x 10 2 A B Graphique 1 : avancement de la réaction fonction du temps. La réaction étudiée présente un ΔG 0 nettement négatif. Temps (min) 18

19 Graphique 2 : 1) Préciser à quelle concentration correspond la valeur 100 sur l'abscisse. 2) Comment passer de l'absorbance à la vitesse initiale? 3) Par rapport aux conditions expérimentales utilisées pour obtenir la courbe A, quel(s) changement(s) a (ont) été introduit(s) pour obtenir la courbe B? 4) Quelle équation mathématique permet de décrire les courbes (A) et (B) 5) Estimer K M et V max pour les expériences (A) et (B). Absorbance 420 nm Graphique 2 : Absorbance du produit de la réaction en fonction de la concentration en substrat (So en mol.l -1 ; temps de réaction : 10 min). Graphiques 3 et 4 : Linéarisations de l équation de Michaelis-Menten (S o en mol.l -1 et v i en mol.l -1.min -1 ) 1) Préciser la signification des coordonnées sur les axes de ces graphiques (par exemple, à quelle grandeur correspond le repère 5 en abscisse et en ordonnée dans les deux cas). 2) Quelles sont les équations de ces droites? 3) Déterminer K M et V max pour les expériences (A) et (B) à l aide des graphiques 3 et 4. Graphique 3 : Représentation selon Lineweaver-Burke Graphique 4 : Représentation selon Eadie-Hofstee 19

20 Exercice 2 (temps conseillé 20 min) Soit une enzyme michaelienne dont la constante de vitesse catalytique (k 2 ) est : min -1. Dans le milieu réactionnel, il apparaît : 2000 µmol.l -1 de produit après 2,5 minutes 4000 µmol.l -1 de produit après 5 minutes 5000 µmol.l -1 de produit après 7,5 minutes 5800 µmol.l -1 de produit après 10 minutes 1) Pendant combien de temps la réaction est-elle en vitesse initiale? 2) Quelle est la valeur de la vitesse initiale? 3) Quelle condition doit être requise pour que vous puissez déduire, de cette valeur de vitesse initiale, la concentration de l enzyme? 4) Sachant que cette condition est remplie dans l expérience présentée ci-dessus, calculer la concentration d enzyme utilisée. Exercice 4 : L invertase (exercice non traité en td) L invertase catalyse la réaction d hydrolyse du saccharose : Eau + Sacharrose Glucose + Fructose a) On réalise un dosage d activité à partir d un extrait cellulaire brut contenant 300 mg de protéines pour 100 ml. Sachant que dans des conditions saturantes en saccharose, il apparaît 3,6 µmoles de glucose en 4 min de réaction dans ce volume de 100 ml, calculer l activité totale de l extrait brut en Unités Internationales (UI) ainsi que son activité spécifique en UI.mg -1 de protéines totales. b) Par ailleurs, on dispose de l enzyme purifiée : la vitesse maximale de l enzyme (V max ) est de 30 mmoles.l -1.min -1 de glucose produit pour une concentration d enzyme de 3, mol.l -1. Sachant que la masse molaire de l enzyme est de g.mol -1, calculer l activité spécifique en UI.mg -1 d enzyme pure. c) Calculer la masse d enzyme pure dans les protéines de l extrait brut. Eléments de réponse : a-activité totale = 0,9 µmol.min -1 ou UI dans les 100 ml. AS extrait = UI.mg -1. b-as enzyme pure = 3,33 UI.mg -1. c-masse d enzyme pure dans les protéines de l extrait brut = 0,27 mg. 20

21 TD 7 Cinétique michaelienne en présence d inhibiteurs réversibles. L exercice 3 : examen de juin 2009 ne sera pas traité en TD Exercice 1 : Réaction enzymatique en présence d inhibiteurs compétitif et non compétitif Soit la réaction S P catalysée par l enzyme E. On mesure les vitesses initiales pour différentes concentrations initiales de S. Les résultats sont donnés sur le tableau suivant : (S) x10 4 mol.l -1 0,2 0,3 0,4 0,5 0, v i µmol.l -1.min -1 0,180 0,240 0,290 0,333 0,4 0,454 0,525 0,590 1) Déterminez K M et V max à partir d une représentation d Eadie-Hofstee. 2) Pour une concentration en substrat de 0, mol.l -1 la vitesse de la réaction enzymatique est diminuée de 60% en présence de mol.l -1 d un inhibiteur compétitif Ic. a) Tracer sur le même graphique la droite v i =f(v i /S o ) en présence de Ic. La droite sera tracée à partir de la seule donnée à 0, mol.l -1 et d une autre donnée relevée sur le graphique. b) Déterminer les nouveaux paramètres K' M et V' max. c) En présence de cet inhibiteur, quelle serait la vitesse v i pour une concentration en substrat de mol.l -1 ; celle pour 10-3 mol.l -1. 3) Un inhibiteur non compétitif est ajouté au milieu réactionnel contenant l enzyme E et le substrat S en excès. La V' max atteinte dans ces conditions correspond à 40% de la V max sans inhibiteur. a) Tracer toujours sur le même graphique, la droite v i =f(v i/s o ) en présence de cet inhibiteur. b) Déterminer les nouveaux paramètres K' M et V' max. c) Quelle serait la vitesse v i pour une concentration en substrat de 0, mol.l -1? d) Schématiser la structure de l enzyme E avec le site enzymatique et les sites d inhibition. Discuter l influence des deux types d inhibiteur sur les vitesses de la réaction v i en fonction de la quantité de substrat présente. 21

22 Exercice 2 : L'étude d'un enzyme Michaëlien, en présence de différentes molécules inhibitrices ou substrats, a permis d'obtenir les représentations de Lineweaver-Burk ci-contre : 1) Indiquer sur le graphe la signification de chacun des axes. 2) Ecrire l'équation de la droite de référence (Ref) en utilisant les constantes cinétiques K M et V max. 3) Identifier les différentes situations correspondant à chaque droite. Justifier votre réponse. Exercice 3 : Partie A : étude de la protéine Z 4 (25 min) Un étudiant en stage dans un laboratoire travaille sur une protéine Z 4 composée de 4 sousunités identiques Z ayant pour séquence : E V Y D C A L M I Y D R A I F L K L D R V A E L V N R L étudiant analyse la protéine Z 4 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide soit en conditions dénaturantes et réductrices, soit en conditions dénaturantes et non réductrices. Dans les deux cas, il observe, après coloration du gel au bleu de Coomassie, une seule bande, dont il estime la masse moléculaire apparente à 3 kda. 1. Quelle est l information de structure apportée par cette expérience? 2. La masse moléculaire apparente observée est-elle en accord avec la masse attendue? Justifier votre réponse. 3. Quelle sera l action de la trypsine sur les sous-unités de la protéine Z 4? Indiquer les sites d hydrolyse sur la séquence ci-dessous et la séquence des fragments peptidiques générés. Justifier votre réponse. 22

23 L étudiant souhaite doser la protéine Z 4 purifiée dans une solution tampon à ph = 12. La mesure est effectuée à 295 nm grâce au spectrophotomètre du laboratoire. L absorbance mesurée à cette longueur d onde est égale à 0,48 (trajet optique de la cuve = 1 cm). Le coefficient d extinction molaire de l acide aminé qui absorbe à cette longueur d onde est 2400 M -1 cm Quel est l acide aminé absorbant à cette longueur d onde de façon caractéristique? Justifier votre réponse. 5. Calculer la concentration molaire de la protéine Z 4 en solution. Partie B : étude cinétique de la protéine Z 4 (10 min) La protéine Z 4 est en fait un enzyme Michaëlien qui catalyse la conversion du substrat S en produit P. L étudiant souhaite déterminer les paramètres cinétiques caractéristiques de cet enzyme. Pour cela, il a déterminé la vitesse initiale de la réaction pour différentes concentrations de substrat. La figure ci-dessous présente le résultat obtenu sans inhibiteur ou en présence de l inhibiteur I. 6. Quelle est l équation des droites représentées sur la figure? 7. Déterminer graphiquement les paramètres cinétiques de l enzyme en l absence et en présence de l inhibiteur I. De quel type d inhibition s agit-il? Justifier votre réponse. 8. Sachant que la concentration de la protéine Z 4 utilisée est de 0, mol.l -1, calculer le k cat de l enzyme en l absence d inhibiteur. 9. Sur la figure précédente, tracer la droite que l on obtiendrait en l absence d inhibiteur pour une concentration d enzyme de 0, mol.l -1. Justifier votre réponse. Eléments de réponse Partie A 1- Homotétramère, 1 seule bande, masse d une sous-unité 3 kda. Pas de pont disulfure interchaine. 2- Masse moléculaire moyenne d un aa = 110 Da ; 27 acides aminés. E V Y D C A L M I Y D R A I F L K L D R V A E L V N R. Peptide 1 : EVYDGALMIYDR, Peptide 2 : AIFLK, Peptide 3 : LDR, Peptide 4 : VAELVNR 4- Tyr : ϕ-oh/ϕ-o - : pk = 10; spectre d absorption du phénol sensible au ph (ϕ-oh : 276 nm vs ϕ-o - : 295 nm). A ph =12.0 Tyr absorbe à 295 nm, [Tyr] = mol/l. 5- Homotétramère donc 8 Tyr, [protéine] = 0, mol/l. Partie B 6- vi = V max K M (vi / [S] ) 7- Sans I : V max = mol.l -1.s -1 K M = /100 = 2 µm - Avec I : V max = mol.l -1.s -1 K M = /75 = 2 µm Même K M mais V max différentes, donc inhibition non compétitive 8- k cat = 8 s Concentration d enzyme deux fois plus élevée, V max deux fois plus grande, K M est inchangé, V max / K M = 200 s -1 23