Acides aminés, peptides et protéines. Biochimie. Licence de Sciences et Technologies Mention Sciences du Vivant. Unité d!

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1 Année universitaire Licence de Sciences et Technologies Mention Sciences du Vivant Unité d!enseignement LV232 Acides aminés, peptides et protéines biochimie/bioch.htm Travaux dirigés de Biochimie 1

2 TD 1 Equilibres acido-basiques et acides!-aminés Courbes de titrage, acides forts/acides faibles, bases fortes/bases faibles, relation d'henderson-hasselbalch. Exercice 1 : Tampon Phosphate 1) On étudie l acide phosphorique et les divers ions phosphates. Indiquer : a. La nature des espèces prédominantes en fonction du ph. b. L allure théorique de la courbe de neutralisation de l acide phosphorique par la soude. couples acido-basiques : PO4H3 / PO4H2 pk : 2,1 - - PO4H2 / PO4H2 7,2 - - PO4H2 / PO43 12,3-2) On désire préparer 500 ml d un tampon phosphate 0,025 mol.l-1 de ph = 7,2. On dispose a. de K2HPO4 (M=174) et de KH2PO4 (M=136) b. d acide phosphorique H3PO4 en solution 5 mol.l-1 et de soude 1 mol.l-1 c. de K3PO4, 3 H2O (M=266) et d acide chlorhydrique 5 mol.l-1. Comment peut-on préparer ce tampon dans les 3 cas? Indiquer chaque fois les quantités de réactifs nécessaires. NB : Un exercice sur les solutions tampons est également dans le polycopié de Travaux Pratiques. Il doit être impérativement préparé avant la séance de TP car il vous sera nécessaire pour les manipulations. Exercice 2 : Titrage de l acide glutamique A titre d exemple, nous étudierons les propriétés d un acide aminé dont la chaîne latérale contient une fonction acido-basique anionique à ph 7,0 : l acide glutamique. 1) Domaines de prédominance. a. Attribuer les pka aux différents groupements acide-base. b. Ecrire les équilibres acide-base, en solution aqueuse, correspondant aux différents pka de l acide glutamique. c. Donner les espèces prédominantes acide-base en fonction du ph de la solution tampon, préciser la charge globale de chaque espèce. 2) Forme zwitterion : en solution dans l eau pure, les acides aminés sont présents sous forme dite zwitterion. a. Donner la formule du zwitterion de l acide glutamique. b. Calculer la valeur du ph isoélectrique (phi). 3) Dosages acido-basiques de l acide glutamique : donner l allure théorique des courbes de dosage de Glu par la soude et l acide chlorhydrique. Préciser les points remarquables. 4) A partir des résultats précédents sur l acide glutamique, indiquer quelle serait la courbe de dosage du glutamate disodique, un sel de sodium acide a-aminé. 2 3

3 Exercice d annale non traité en TD Exercice 3 : Tampon Tris Une réaction enzymatique est réalisée dans un tampon Tris 0,2 mol.l -1 à ph 7,8 : (HOCH2)3C-NH3+ / (HOCH2)3C-NH2, noté TH + / T, caractérisé par un pk (TH + / T ) = 8,1. Cette réaction libère 0,03 mol.l -1 d ions H3O + (assimilés à H + ). 1) Quel est le rapport de [TH + ] / [T ] avant la réaction? 2) Quelles sont les concentrations de TH + et T avant la réaction? 3) Dans cette réaction enzymatique, avec quoi réagit l acide H30 +? 4) Quelles sont les concentrations de T et de TH + à la fin de la réaction? 5) Quel est le ph à la fin de la réaction? 6) Quel serait le ph final si la réaction avait lieu en milieu aqueux non tamponné? TD 2 Acides Aminés et Peptides Etats d ionisation des acides aminés, chromatographies, hydrolyses acide et enzymatique, séquençage selon Edman, absorption UV, loi de Beer-Lambert. Exercice 1 : Ionisation des acides aminés Sur une étagère du laboratoire, vous disposez d une poudre d acide aspartique (pka : 2,1-3,9-9,8). Vous décidez de dissoudre cette poudre dans de l eau distillée. 1. Sous quelle forme allez-vous retrouver l acide aspartique? Justifier votre réponse. 2. Après avoir établi le tableau de prédominance, représenter la formule développée de l acide aminé en solution dans l eau. Donner la valeur du ph de cette solution. 3. Sur la même étagère, vous trouvez une solution nommée «Acide aspartique, ph=4,5». Quelles sont les espèces acido-basiques présentes dans cette solution? Dans quel ratio? NB : pour vos calculs : 10 0,6 = 4 et 10-0,6 = 0,25 Les pka des couples acido-basiques correspondant aux groupements ionisables d un peptide ou d une protéine sont influencés par leur environnement. Toutefois des valeurs moyennes peuvent leur être attribuées : Groupe pka moyen!-cooh (terminal) 3,0 "-COOH (Asp) 3,5 #-COOH (Glu) 4,5 Imidazole (His) 6,0!-NH3+ (terminal) 8,0 SH (Cys) 9,0 OH-phénolique (Tyr) 10,0 $-NH3+ (Lys) 10,5 Guanidino (Arg) 12,5 Principaux acides aminés à caractère hydrophobe : Hydrophobes : Phe > Leu = Ile > Tyr! Trp > Val > Met > Pro > Ala. Exercice 2 : Etude de la structure primaire d une protéine Partie 1) Une protéine P est isolée et purifiée à l homogénéité. Son analyse donne les résultats suivants : Un traitement par le phénylisothiocyanate (réactif d Edman) libère un premier dérivé, le PTH-Ala. Après hydrolyse trypsique de P, les peptides libérés sont séparés par la méthode du Finger-Print (électrophorèse à ph 6,5 suivie d une chromatographie dans un sens perpendiculaire réalisée à l aide d une phase mobile organique). Après révélation par la ninhydrine, on obtient 4 taches numérotées 1, 2, 3 et 4 : 4 5

4 Un autre lot de la protéine P est aussi traité par la trypsine. Les quatre mêmes peptides sont séparés par chromatographie d exclusion. Puis les quatre solutions de peptide sont soumises à une hydrolyse totale : HCl 6 mol.l -1, 105 C. Chaque hydrolysat est analysé sur une résine de polystyrène sulfoné échangeuse de cations suivante : CH 2 CH SO - 3, Na+ n CH 2 CH + n X + + n Na + SO -, X+ 3 n Les acides aminés sont fixés sur la colonne par passage de l hydrolysat sur la résine (RSO 3- Na + ). Ils sont ensuite élués par des tampons de ph croissant. Cette méthode permet d obtenir la composition en acides aminés de chacun des peptides issus de la protéine P : - peptide "a" : Ala, 4 Leu, Met, Ser, Tyr - peptide "b" : Arg, 5 His, 2 Pro, 2 Ser, Thr - peptide "c" : Ala, Asp, 2 Cys, 3 Glu, Leu, Lys - peptide "d" : Arg, Thr, 2 Tyr, 2 Val A titre d exemple, le chromatogramme obtenu pour le peptide "c" est le suivant : Questions : 1. Décrire les effets de l hydrolyse acide sur un peptide ou une protéine. 2. Donner le principe de la chromatographie échangeuse de cations utilisée. 3. Compléter le chromatogramme ci-dessus en indiquant à quel acide aminé correspond chacun des pics. Justifier votre réponse. Expliquer les différences de hauteur des pics. 4. Quel est l emplacement des peptides "a", "b", "c" et "d" sur le Finger-print? Il est nécessaire de prendre en compte des formes minoritaires non négligeables pour résoudre ce problème. 5. Ces résultats permettent-ils de lever certaines ambiguïtés provenant du traitement par l hydrolyse acide? 6. Calculer le phi théorique du peptide "a". 7. Un autre de ces peptides a un phi de 4,0. Lequel? 8. Quels sont les peptides qui contiennent nécessairement les résidus d acides aminés terminaux de la protéine P? Partie 2) Les 4 peptides isolés sont dissous dans 2 ml de solution aqueuse tamponnée à ph 7. L absorption en lumière ultraviolette du peptide "d" mesurée à 276 nm dans une cuve de largeur 1 cm est égale à 0, Quelles absorbances attend-on a priori pour chacun des peptides "a", "b" et "c"? 10. Déterminer en nombre de moles la quantité minimum de protéine P utilisée pour effectuer l hydrolyse par la trypsine avant la chromatographie sur gel d exclusion. 11. L absorbance mesurée pour le peptide "a" ne correspond pas à la valeur attendue mais est égale à 0,97. Donner une interprétation qualitative et quantitative de cette donnée expérimentale. (Pour répondre à cette question, on tiendra compte du fait que l absorbance mesurée à une longueur d onde donnée est fonction des différentes espèces qui absorbent à cette longueur d onde) Données :! Tyr ( "OH) à 276 nm : mol -1.L.cm -1! Trp à 276 nm : mol -1.L.cm -1 Le maximum d'absorption de la phénylalanine étant à 260 nm, on considère que l absorbance est nulle à 276 nm. 6 7

5 Exercice d annale non traité en TD Exercice 3 : Electrophorèse d acides aminés. Sur la paillasse du laboratoire, quatre flacons d acide aminé sont disponibles : acide aspartique, arginine, histidine et tyrosine. 1) Ecrire les espèces prédominantes des quatre amino-acides en fonction du ph. Pour identifier les trois acides aminés présents dans une solution aqueuse faite à partir de trois de ces flacons, on fait subir à ce mélange deux électrophorèses sur plaques équilibrées dans une solution tampon : la première à ph 5 et la deuxième à ph 11,2. La durée de ces électrophorèses n est pas la même dans les deux cas. Après révélation, les deux plaques se présentent comme indiqué dans la figure ci-dessous. + Dépôt initial - Tampon ph 5 TD 3 Peptides et protéines Détermination de structure primaire, charge nette de peptide/protéine. Exercice 1 : Séquence de peptide (Contrôle continu, mars 2009) a. L hydrolyse acide d un hexa peptide P libère 2 moles d alanine, 2 moles d arginine et 1 mole d un acide aminé oxydable. b. Après ajout de phényl-isothiocyanate (PITC, réactif d Edman), un phényl-thiohydantoïne (PTH)-Alanine est libéré. c. Le peptide P est hydrolysé par la trypsine. On obtient un tri peptide, un dipeptide et un acide aminé libre : l acide aminé oxydable. Le tri peptide et le dipeptide ont le même acide aminé en N-terminal. + - Tampon ph 11,2 Figure : Electrophorèse d acides aminés d. Après digestion d un autre lot de cet hexa peptide P par la chymotrypsine, deux peptides sont libérés : un tétrapeptide qui absorbe à 280 nm et un dipeptide. 2) Attribuer chacune des taches ci-dessus à un acide aminé, ou mélange d acides aminés en justifiant la réponse à partir des valeurs des pka des amino-acides qui peuvent être présents. En déduire la composition du mélange initial des trois amino-acides. NB : On rappelle qu un acide aminé ne migre pratiquement pas lorsque la forme zwitterion est majoritaire. e. Déterminer la séquence du peptide et replacer les sites de coupure de chaque enzyme. Réponses : Q2) de gauche à droite : D, Y, (R ou H) (pour ph5) donc D et Y font partie du mélange et le troisième est R ou H de gauche à droite : D + Y, R (pour ph11,2) donc c est R qui fait partie du mélange et non H Conclusion : les 3 acides aminés sont D, Y et R 8 9

6 Exercice 2 : Séquence de peptide (Examen, janvier 2001) Un décapeptide a été isolé et purifié jusqu'à homogénéité. Un traitement de ce peptide par le réactif d Edman libère du PTH-Asp. Après hydrolyse chymotrypsique du peptide natif, on obtient 3 peptides : A, B et C. La séquence de ces peptides, déterminée par la méthode récurrente d'edman, est la suivante : A : Val-His-Ser-Trp B : Asp-Arg-Val-Tyr C : Lys-Leu 1. Quelle est la séquence du peptide initial? Justifier votre réponse. 2. Donner pour le peptide B les formules développées des chaînes latérales ionisables en précisant les couples acido-basiques en présence. 3. Ecrire la formule développée du peptide A dans l'eau. Calculer le ph de cette solution. 4. Tracer la courbe de neutralisation théorique d'une solution de sel mono sodique du peptide A. Préciser l'état d'ionisation des fonctions de ce sel et la nature du réactif utilisé pour ce dosage. Placer sur cette courbe les volumes équivalents, les pka et les ph aux points d'équivalence. 5. A quel ph pourrait-on séparer par électrophorèse les peptides B et C? Justifier votre réponse (échelle de ph ou équilibres acido-basiques). Schématiser le déplacement relatif attendu pour les peptides B et C par rapport à la position du dépôt initial d'un mélange B + C. Exercice 3 : Détermination du phi de la chymotrypsine La chymotrypsine est formée de 3 chaînes polypeptidiques reliées par 4 ponts disulfures. Sa composition en acides aminés à caractère acido-basique est la suivante : 3 Arg, 9 Asp, 10 Cys, 5 Glu, 2 His, 13 Lys et 4 Tyr. 1. Estimer la charge nette globale de la chymotrypsine à ph 1, ph 7 et à ph Evaluer son phi. TD 4 Purification et structure des protéines Chromatographies, calcul de rendement et facteur de purification Exercice 1 : Purification d une enzyme Une enzyme est purifiée à partir de sérum humain. Son substrat, disponible au laboratoire, est utilisé pour mesurer l activité enzymatique des fractions obtenues après chaque étape de la purification. 1- Première étape de la purification a- Traitement du sérum par du sulfate d ammonium à 50% de saturation puis centrifugation. L activité enzymatique est mesurée dans le culot et dans le surnageant et on constate que seul le culot présente une activité. Q1) Quel est l intérêt de ce traitement? Q2) Sur quelle fraction (culot ou surnageant) faut-il poursuivre la purification? Cette fraction est nommée F1. b. La fraction F1 est dialysée contre du tampon phosphate 20 mm, ph 8, NaCl 50 mm. Q3) Comment fonctionne une dialyse? Quel est l intérêt de cette étape de dialyse à ce stade de la purification? 2- Deuxième étape de la purification La solution F1 dialysée est purifiée par chromatographie sur une résine échangeuse d anions ; diverses protéines sont éluées par diminution progressive depuis ph initial de 8 jusqu à 5. Une seule fraction possède une activité enzymatique : la fraction F2. Elle est éluée à ph 6. Q4) Quel est le critère de séparation des protéines utilisé dans la chromatographie sur résine échangeuse d ions? Q5) Que peut-on dire du phi de l enzyme? 3- Troisième étape de la purification La fraction active F2 est déposée sur une colonne de chromatographie d exclusion (Sephadex G100) et éluée par un tampon phosphate 20 mm, NaCl 150 mm, ph 7. Le profil d élution est représenté sur la figure 1. La colonne de Sephadex G100 a été préalablement calibrée avec 4 protéines de masses moléculaires connues dont les volumes d élution respectifs sont indiqués sur ce même schéma (flèches). Une seule fraction possède une activité enzymatique (fraction F3)

7 4- Analyse de la purification par électrophorèse Figure 1 : profil d élution de la fraction F2 sur Sephadex G100 Une aliquote de la fraction F3 est analysé par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose puis colorées au Rouge Ponceau (coloration spécifique des protéines). Après décoloration de la membrane, l enzyme est détectée grâce à un anticorps spécifique par la technique de Western-blot. Les résultats sont schématisés dans la figure 2A. Q12) Sur quelle propriété est basée l électrophorèse utilisée ici? Rappeler le principe de la technique de Western-blot. Q13) Que peut-on dire de la pureté de la fraction active F3? Q14) Proposer une autre technique qui pourrait améliorer la purification de cette enzyme. On utilise la technique mentionnée à la Q14 et on obtient une nouvelle fraction active (fraction F4) que l on analyse comme dans la partie 4 (figure 2B). Q6) Sur quelle propriété des protéines repose la chromatographie d exclusion? Q15) Que peut-on dire de la pureté de cette dernière fraction obtenue? Q7) Pourquoi suit-on les étapes de chromatographie à 280 nm? Q8) Peut-on dire que la fraction active F2 étudiée ici était très pure? Q9) Proposer une valeur de volume d élution pour l enzyme active. Q10) En utilisant la grille semi-log ci-dessous, donner une estimation de la masse moléculaire de cette enzyme. MM (kda) A B Ponceau WB Ponceau WB Figure 2 : après SDS-PAGE et transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose, la membrane est colorée au Rouge Ponceau (Ponceau) puis l enzyme est détectée par Westernblot à l aide d un anticorps spécifique (WB). A : fraction F3, B : fraction F4 Q11) Quelle est l'allure de la courbe obtenue? Que déduire de la loi qui lie MM et Ve? C est une droite. Il y a proportionnalité entre le log de MM et le Ve On étudie la structure quaternaire de l enzyme à partir de la fraction F4, en utilisant la technique de filtration sur gel comme dans la partie 3, dans différentes conditions expérimentales : 1- dépôt dans des conditions natives. 2- dépôt dans des conditions natives en présence de "-mercaptoéthanol en excès. Les résultats sont résumés dans la figure 3. Ve (ml) 12 13

8 1 94 kda 68 kda 43 kda Ve (ml) Figure 3 : profils d élution de la fraction F4 sur Sephadex G et 2 correspondent aux deux conditions expérimentales décrites dans le texte kda 68 kda 43 kda Ve (ml) Q16) Proposer une interprétation de ces derniers résultats. Enzymologie Exercice 2 : Méthodes de purification des protéines Vous avez testé plusieurs méthodes de fractionnement d une enzyme à partir d un extrait brut d Escherichia coli. Les résultats de ces différents essais sont présentés dans le tableau ci-dessous : Extrait brut Fraction purifiée Méthodes de fractionnement Protéines (mg) Activité totale (U) Protéines (mg) Activité totale (U) Gradient de saccharose 5-20% , Chromatographie Séphadex G , Chromatographie DEAE , Précipitation au sulfate d'ammonium entre 60 et 80% Pour chacune des méthodes utilisées, calculez l'activité spécifique (U.mg -1 de protéines) de la fraction obtenue, le facteur de purification et le rendement. 2- Quelles sont les deux méthodes qui vous semblent les meilleures? Pourquoi? 14 15

9 TD5/6 - Cinétique michaelienne en absence et en présence d inhibiteurs réversibles. Représentation P=f(t) ; Vi=f(S), Michaëlis et Menten, linéarisation, constante catalytique Exercice 1 : cinétique michaëlienne Une enzyme michaëlienne catalyse la conversion d un substrat S en produit P. A différents temps de la réaction, on prélève une fraction du milieu réactionnel et on dose la concentration de produit apparu. Le tableau ci-après représente les valeurs des concentrations de produit apparu [P] en mmole.l -1, pour 7 concentrations différentes de substrat testées (S1 à S7), en présence de 15 nmol.l -1 d enzyme. Concentration de produit apparu [P] (mmole.l -1 ) pour différentes Temps concentrations de substrat S utilisées (min) [S1] 2, M [S2] M [S3] 10-3 M [S4] 2, M [S5] M [S6] 10-2 M [S7] M ,045 0,075 0,11 0,16 0,19 0,20 0,2 2 0,10 0,14 0,22 0,32 0,37 0,40 0,4 4 0,16 0,27 0,45 0,60 0,74 0,80 0,8 6 0,20 0,37 0,62 0,90 1,10 1,20 1,2 10 0,25 0,48 0,85 1,45 1, ,25 0,50 0,95 2,00 2,40 2,80 2,8 20 0,25 0,50 1 2, Ce tableau a permis de tracer le graphe suivant, [P] = f(t). 1) Tracer soigneusement sur le graphe, les courbes correspondant aux concentrations de [S2], [S5] et [S7]. 2) A quelles concentrations de produit apparu correspondent les plateaux des courbes obtenues pour [So] = 2,5.10-4, et 10-3 mol.l -1? Quelle est la signification de ces plateaux? 3) Quelle serait la valeur du plateau (ordonnée à t = +%) obtenu pour la courbe [S7] = 20 mmol.l -1? 4) Tracer la courbe P = f(t) que l on devrait obtenir en travaillant en présence de [S3] = 10-3 mol.l -1 et [Eo] = 30 nmol.l -1. 5) Pendant combien de temps reste-t-on en vitesse initiale (vi)? Donner, pour chacune des concentrations de substrat S, la vitesse initiale correspondante (en mmol.l -1.min -1 ). 6) Tracer la courbe de saturation vi = f([so]). Comment se nomme cette courbe? Quelle est son équation? Donner une estimation de la Vmax. 7) A partir de quelle concentration de substrat pensez-vous que l enzyme est saturée? 8) Un paramètre cinétique, caractéristique du couple enzyme-substrat, est la constante de Michaëlis, KM. Cette constante est la concentration en substrat qui permet d obtenir une vitesse initiale (vi) égale à la moitié de la Vmax. Donner une estimation de cette KM. Comparer cette valeur à la valeur de [S] donnant la saturation. Exercice 2 : Vitesse enzymatique versus quantité d enzyme Pour un substrat donné, une enzyme possède un KM de 3, mol.l -1. Pour une concentration en enzyme [Etot] = 0,1 mg.ml -1 et en substrat [So] = mol.l -1, la vitesse est de 30 &mol.l -1 de produit (P) libéré par minute. 1) Quelle sera la vitesse de la réaction si [So] = mol.l -1 et [Etot] = 0,03mg.mL -1? 2) Quelles seront les valeurs de KM et Vmax pour une concentration d enzyme deux fois plus élevée que dans les conditions initiales? 3) Pour Etot = 0,1 mg.ml -1, comment obtenir une vitesse vi de 15 &mol.l -1 de P libéré par minute? 16 17

10 Exercice 3 : Activité enzymatique de la "-galactosidase À ph 7,7 et à 25 C, les cinétiques d'hydrolyse de l'o-nitrophényl-galactoside (ONPG) par la ß-galactosidase de Escherichia coli ont été étudiées en absence ou en présence de l'un des inhibiteurs suivants: o-nitrophényl-ß-d-thiogalactoside (ONPTG), maltose. Les mesures de vitesses initiales pour chacune de ces expériences sont données dans le tableau suivant comme la variation de l'absorbance à 410 nm (longueur d'onde d'absorption maximale de l'onp, produit coloré). Le volume réactionnel est de 1 ml. Vo (!Abs.min -1 ) S (mol.l -1 ) Sans inhibiteur ONPTG ( mol.l -1 ) Maltose (0,25 mol.l -1 ) 2, ,033 0,018 0,0165 5, ,055 0,033 0,0275 Exercice 4 : Cinétique enzymatique (contrôle continu, avril 2011) Dans des échantillons de 10 ml d'un milieu réactionnel contenant tous les coenzymes et cofacteurs nécessaires à la catalyse, on mélange 0,2 nanomoles d'une enzyme E avec différentes concentrations d'un substrat S. La constante de Michaelis K M de l'enzyme pour ce substrat est estimée à 10-5 mol.l -1 et la constante de vitesse catalytique k cat est de min -1. 1) Définir (en une phrase) la constante catalytique k cat d une enzyme. Quelle expression relie cette constante à la V max de la réaction enzymatique? En déduire la valeur de V max dans les conditions expérimentales. 2) Compléter le graphe ci-après en traçant, à l échelle, la droite d Eadie-Hofstee. Légender les axes (sans oublier les unités) et indiquer les points remarquables en détaillant les calculs si besoin. Ecrire et redémontrer l équation de la droite. 1, ,0825 0,055 0,041 2, ,118 0,091 0,059 5, ,138 0,118 0,069 1, ,150 0,138 0,075 1) Tracer la courbe 1/Vo = f (1/S) pour chacune des expériences. Redémontrer l équation de la droite. 2) Déterminer Vmax et KM pour l'expérience réalisée en absence d'inhibiteur. 3) Calculer kcat en s -1 sachant que [E0 ]= 1, mol.l -1 et que $M de l'onp à 410 nm = L.mol -1 cm -1. 4) Déterminer V'max et K'M pour chacun des inhibiteurs. 5) Déterminer la nature de l'inhibition pour chacun des inhibiteurs. 6) Pour chacun de ces inhibiteurs, quelle concentration de substrat utiliseriez-vous pour montrer leur effet sur l activité enzymatique? 18 19

11 3) Donner de même, sans la démontrer, l équation de Michaelis-Menten v i = f([s] 0) où v i est la vitesse initiale mesurée pour une concentration de substrat [S] 0, dans les conditions de vitesse initiale et à l état stationnaire. En déduire les valeurs du rapport v i/v max pour : S] 0 = 10-3 mol.l -1 v i/v max ' [S] 0 = mol.l -1 [S] 0 = 10-5 mol.l -1 v i/v max ' v i/v max ' 4) On dispose de deux inhibiteurs pour cette réaction enzymatique, l un responsable d une inhibition compétitive (I 1) et l autre d une inhibition non compétitive (I 2). Des mesures de vitesse initiale sont faites dans les mêmes conditions que ci-dessus, mais en présence de l un (expériences A) ou de l autre inhibiteur (expériences B). Malheureusement, votre binôme a oublié de noter lequel des deux inhibiteurs a été utilisé pour chaque série d expériences. a) Pour une concentration [S] 0 = 10-5 mol.l -1, le rapport v i /V max est de 0,5 dans la série A et de 0,33 dans la série B. Retrouver l identité de l inhibiteur utilisé dans chaque série d expériences, en justifiant chaque proposition. b) Compléter le graphe commencé en 1) en dessinant les droites d Eadie-Hofstee correspondant aux inhibitions par I 1 et I 2 (utiliser des couleurs ou des symboles différents). Exercice 5 : qui est quoi? (Examen, avril 2005) L'étude d'un enzyme Michaëlien, en présence de différentes molécules inhibitrices ou substrats, a permis d'obtenir les représentations de Lineweaver-Burk ci-contre : Exercice d annale non traité en TD Exercice 6 : Etude de la protéine Z 4 (examen, juin 2009) Partie A : étude de la protéine Z 4 (25 min) Un étudiant en stage dans un laboratoire travaille sur une protéine Z 4 composée de 4 sousunités identiques Z ayant pour séquence : E V Y D C A L M I Y D R A I F L K L D R V A E L V N R L étudiant analyse la protéine Z 4 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide soit en conditions dénaturantes et réductrices, soit en conditions dénaturantes et non réductrices. Dans les deux cas, il observe, après coloration du gel au bleu de Coomassie, une seule bande, dont il estime la masse moléculaire apparente à 3 kda. 1. Quelle est l information de structure apportée par cette expérience? 2. La masse moléculaire apparente observée est-elle en accord avec la masse attendue? Justifier votre réponse. 3. Quelle sera l action de la trypsine sur les sous-unités de la protéine Z 4? 4. Indiquer les sites d hydrolyse sur la séquence ci-dessous et la séquence des fragments peptidiques générés. Justifier votre réponse. L étudiant souhaite doser la protéine Z 4 purifiée dans une solution tampon à ph = 12. La mesure est effectuée à 295 nm grâce au spectrophotomètre du laboratoire. L absorbance mesurée à cette longueur d onde est égale à 0,48 (trajet optique de la cuve = 1 cm). Le coefficient d extinction molaire de l acide aminé qui absorbe à cette longueur d onde est 2400 M -1 cm Quel est l acide aminé absorbant à cette longueur d onde de façon caractéristique? Justifier votre réponse. 6. Calculer la concentration molaire de la protéine Z 4 en solution. 1) Indiquer sur le graphe la signification de chacun des axes. 2) Ecrire l'équation de la droite de référence (Ref) en utilisant les constantes cinétiques K M et V max. 3) Identifier les différentes situations correspondant à chaque droite. Justifier votre réponse

12 Partie B : étude cinétique de la protéine Z 4 (10 min) La protéine Z 4 est en fait une enzyme Michaëlienne qui catalyse la conversion du substrat S en produit P. L étudiant souhaite déterminer les paramètres cinétiques caractéristiques de cet enzyme. Pour cela, il a déterminé la vitesse initiale de la réaction pour différentes concentrations de substrat. La figure ci-dessous présente le résultat obtenu sans inhibiteur ou en présence de l inhibiteur I. Questions de cours auxquelles vous devez savoir répondre sans ambiguïté! 1) Réécrire les conditions initiales dans lesquelles sont envisagées les réactions enzymatiques. Définir l état stationnaire. 2) Dans quelles conditions peut-on négliger la réaction de constante de vitesse k -2? 3) Définir la constante de dissociation K D du complexe ES. 4) Définir la constante d association K A du complexe ES. 5) Etablir l équation de Michaëlis-Menten 6) Définir de deux manières la constante de Michaëlis-Menten K M. 7) Dans quelles conditions la constante de Michaëlis-Menten K M peut-elle être assimilée à la constante K D du complexe ES? 8) La constante K M de l enzyme dépend-elle des conditions dans lesquelles elle est mesurée (concentration en enzyme, en substrat, température, ph, force ionique)? 9) De quoi dépend V max? Quelle est la signification de k cat? 10) Définir l unité internationale (UI). 7. Quelle est l équation des droites représentées sur la figure? 8. Déterminer graphiquement les paramètres cinétiques de l enzyme en l absence et en présence de l inhibiteur I. De quel type d inhibition s agit-il? Justifier votre réponse. 9. Sachant que la concentration de la protéine Z 4 utilisée est de 0, mol.l -1, calculer le k cat de l enzyme en l absence d inhibiteur. 10. Sur la figure précédente, tracer la droite que l on obtiendrait en l absence d inhibiteur pour une concentration d enzyme de 0, mol.l -1. Justifier votre réponse. Eléments de réponse 1- Homotétramère, 1 seule bande, masse d une sous-unité 3 kda. Pas de pont disulfure interchaine. 2- Masse moléculaire moyenne d un aa = 110 Da ; ' 27 acides aminés. E V Y D C A L M I Y D R A I F L K L D R V A E L V N R. Peptide 1 : EVYDGALMIYDR, Peptide 2 : AIFLK, Peptide 3 : LDR, Peptide 4 : VAELVNR 4- Tyr : #-OH/#-O - : pk = 10; spectre d absorption du phénol sensible au ph (#-OH : 276 nm vs #-O - : 295 nm). A ph =12.0 Tyr absorbe à 295 nm, [Tyr] = mol/l. 5- Homotétramère donc 8 Tyr, [protéine] = 0, mol/l. 6- vi = V max K M (vi / [S] ) 7- Sans I : V max = mol.l -1.s -1 K M = /100 = 2 &M - Avec I : V max = mol.l -1.s -1 K M = /75 = 2 &M Même K M mais V max différentes, donc inhibition non compétitive 8- k cat = 8 s Concentration d enzyme deux fois plus élevée, V max deux fois plus grande, K M est inchangé, V max / K M = 200 s